新型Aβ42寡聚體模擬表位疫苗的制備

劉向蒙 于雅東 王少偉 于曉琳 王瑞明

（1. 齊魯工業(yè)大學生物工程學院，濟南 250353；2. 昆明市環(huán)境監(jiān)測中心，昆明 650100；3. 中國科學院過程工程研究所，北京 100190）

新型Aβ42寡聚體模擬表位疫苗的制備

劉向蒙1于雅東2王少偉3于曉琳3王瑞明1

（1. 齊魯工業(yè)大學生物工程學院，濟南 250353；2. 昆明市環(huán)境監(jiān)測中心，昆明 650100；3. 中國科學院過程工程研究所，北京 100190）

旨在獲得一株特異靶向致病性Aβ42寡聚體的模擬表位疫苗。在前期工作中，應用親和層析的方法從人靜脈用免疫球蛋白（Intravenous immune globulin，IVIG）中純化獲得特異性識別Aβ42寡聚體的抗體組分IVIG-AOB。以IVIG-AOB為靶蛋白，應用噬菌體展示技術(shù)淘選出一系列Aβ42寡聚體的特異性環(huán)狀模擬表位多肽，隨后將表位多肽融合表達至乙肝病毒核心蛋白（HBc-VLP）構(gòu)建成表位載體疫苗，進而將免疫小鼠，從中篩選出能有效免疫產(chǎn)生抗Aβ42寡聚體抗體的模擬表位疫苗。從噬菌體環(huán)形七肽庫中篩選出5條特異性結(jié)合IVIG-AOB的模擬表位多肽，將其克隆至HBc載體，并在大腸桿菌中成功表達和組裝成嵌合表位的HBc-VLP，通過免疫小鼠優(yōu)選出一株效果最好的Aβ42寡聚體構(gòu)象表位疫苗HBc-C4。Aβ寡聚體是AD發(fā)生發(fā)展的主要致病因素?；贏β42寡聚體獨特的構(gòu)象表位研制的表位HBc-VLP疫苗誘導機體產(chǎn)生的抗體將能夠特異靶向并中和毒性Aβ42寡聚體，而不影響Aβ42的正常生理功能，從而起到從根本上治療AD的作用。

阿爾茨海默??；Aβ42寡聚體；模擬表位；疫苗；抗體

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD），是一種持續(xù)性惡化的神經(jīng)退行性疾病。近年來，AD的發(fā)病率及患病人數(shù)持續(xù)增長，已成為繼心臟病、癌癥、中風后的第四大致病性疾病。AD的病理變化主要表現(xiàn)為由Aβ在神經(jīng)元細胞外形成的老年斑和由異常磷酸化tau蛋白在神經(jīng)元細胞內(nèi)形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)［1］。Aβ是由其前體蛋白APP經(jīng)β-和γ-分泌酶酶切產(chǎn)生的多肽片段［2］，過量的Aβ累積后會發(fā)生聚集，形成寡聚體、原纖維和纖維等。其中，APP和Aβ單體在神經(jīng)元和突觸發(fā)育中起著重要作用［3］，而Aβ寡聚體具有神經(jīng)毒性，是AD發(fā)病的起始誘因。

抗Aβ免疫治療是清除Aβ的有效途徑，在AD治療中具有廣闊的應用前景。然而，自身免疫的風險、顯著的副作用以及不確定的治療效果限制了Aβ免疫治療的發(fā)展［4］。第一代疫苗AN1792利用全長的Aβ42多肽作為免疫原直接進行免疫治療，在動物實驗中表現(xiàn)出了良好的治療效果，但是在臨床II期試驗中由于引發(fā)嚴重的腦膜炎等副作用而被迫中止。隨后的研究表明，全長Aβ含有的T細胞表位引發(fā)的T細胞活化及浸潤是其副作用發(fā)生的主要原因［5］。為了避免T細胞自身免疫反應，第二代Aβ疫苗ACC-001、CAD106等利用Aβ42的B細胞表位區(qū)作為抗原表位，同時搭載病毒載體蛋白提高了免疫效率，但是I期或者II期的臨床試驗發(fā)現(xiàn)其治療效果仍不顯著［6-7］。同時，使用抗Aβ單克隆抗體的被動免疫治療在AD臨床試驗中效果也不理想，例如 bapineuzumab［8］，solanezumab［9］。這些單抗或者疫苗免疫產(chǎn)生的抗體可同時結(jié)合Aβ單體、寡聚體和纖維以及APP蛋白。這或許降低了有限的抗體靶向寡聚體的能力，再者，靶向具有正常生理功能的Aβ和APP可導致副作用發(fā)生。

2016年的一項I期臨床試驗表明，一種特異性靶向Aβ寡聚體的單克隆抗體aducanumab，能顯著降低AD患者腦內(nèi)的Aβ水平，改善患者臨床認知能力［10］。除此之外，一項III期臨床實驗表明，人靜脈用免疫球蛋白（IVIG）可改善攜帶APOE-ε4基因的輕度到中度AD患者的認知損傷［11］。我們認為IVIG中抗Aβ寡聚體的抗體組分是起到這一治療作用的關(guān)鍵［12］。這些研究表明，特異性針對Aβ寡聚體的免疫治療對AD具有更好的治療作用。

本研究選擇 Aβ42寡聚體作為阿爾茨海默病的免疫治療靶標，利用本實驗室從IVIG中純化獲得的抗Aβ42寡聚體特異性抗體組分（IVIG-AOB）篩選獲得Aβ42寡聚體模擬表位，并克隆至HBc中制備VLP疫苗，然后免疫BalB/c小鼠，用ELISA方法檢測小鼠血清中抗體水平，進一步驗證這種新型疫苗Aβ42寡聚體模擬表位疫苗的免疫原性，期望獲得一株較高免疫原性的疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 隨機多肽噬菌體庫（NEB公司，美國）；BL21感受態(tài)細胞（TakaRa公司，日本）；IVIG-AOB（實驗室制備）；層析柱、親和層析填料、疏水介質(zhì)丁基及羥基磷灰石介質(zhì)（GE公司，美國）；注射用鋁佐劑、化學發(fā)光試劑盒（ECL）（Thermo公司，美國）；Amyloid beta 42（Aβ42）（American Peptide，美國）；二甲基亞砜（DMSO）、六氟異丙醇（HFIP）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、硫磺素T（ThT）、過硫酸銨（AP）、N，N，N，N，-四甲基乙二胺（TEMED）、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris、甘氨酸（glycin）、Tween-20（Sigma公司，美國）；200目碳支持膜、醋酸雙氧鈾（北京中鏡科儀）；硝酸纖維素膜（NC膜）（Milipore公司，美國）；HBc單克隆抗體（Invitrogen公司，美國）；抗His單克隆抗體、HRP-羊抗鼠（北京中杉生物工程有限公司）；96孔酶標板（廣州JET公司）；可溶型單組分TMB顯色底物（北京天根生化科技有限公司）；酸性顯影粉、通用定影粉（天津世紀奧博公司）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗動物 雌性Balb/c小鼠，4-6周齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 Aβ42寡聚體模擬表位多肽的篩選 本試驗采用固相結(jié)合法，將IVIG-AOB包被于聚乙烯平皿中，加入環(huán)形7肽噬菌體庫，洗脫掉未結(jié)合或者結(jié)合不牢的噬菌體后收集特異性結(jié)合的噬菌體。在淘選過程中，使用逐步降低靶分子濃度（100 μg/mL，10 μg/mL，1 μg/mL）、提高去污劑 Tween-20 的濃度（0.1%、0.3%和0.5%）和增加洗滌次數(shù)（12次、15次和20次）的方法，以提高篩選效率。按這種方法進行了4輪的篩選，最終獲得了特異性富集的噬菌體。

1.2.2 噬菌體陽性克隆的篩選 使用96孔ELISA板，每孔加入 1 μg/100 μL Aβ寡聚體（PBS稀釋），同時需包被空白孔（PBS）以排除挑選的噬菌體與ELISA板結(jié)合，4℃包被過夜。包被結(jié)束后，用0.3%PBST洗脫3遍，除去殘液并拍干后，每孔加滿封阻液，37℃封閉2 h。封閉結(jié)束后，0.3% PBST洗脫兩遍，除去殘液并拍干。然后加入合適稀釋度的擴增噬菌體貯液，室溫震蕩1 h，棄掉貯液并拍干，0.3%PBST洗脫10遍，然后用0.3% PBST以1：1 000的比例稀釋HRP標記的抗-M13抗體，每孔加入100 μL稀釋后的抗體，室溫震蕩作用1 h。用0.3% PBST洗板10次。每孔加100 μL TMB底物溶液，室溫作用10 min，1 mol/L H2SO4每孔100 μL終止反應。用讀板儀記錄450 nm處的吸光值。

1.2.3 ELISA檢測模擬表位多肽與IVIG-AOB結(jié)合活性 根據(jù)噬菌體ELISA檢測結(jié)果及測序結(jié)果，合成了具有重復序列的6條環(huán)形7肽，在多肽合成時加入含有6個組氨酸的His標簽（CxxxxxxxCHHHHHH），以檢測其與IVIG-AOB的結(jié)合情況。環(huán)形多肽ELISA檢測時，包被樣品為IVIG-AOB，每孔1 μg/100 μL，一抗為帶His標簽的多肽，二抗小鼠抗His標簽的單抗，其余按1.2.2的方法。

1.2.4 HBc與模擬表位多肽重組蛋白的表達純化 首先將表位多肽插入HBc149的免疫顯性區(qū)域（Major immunodominant region，MIR），重組的 HBc表位嵌合基因克隆至pBR327質(zhì)粒中。然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞中，挑取單克隆后在含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按照1∶50接種至M9培養(yǎng)基，37℃誘導培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，于8 500 r/min離心5 min，收集菌體，加入2 mL重 懸 buffer（50 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl），加入蛋白酶抑制劑PMSF，混勻，超聲破碎菌體，12 000 r/min離心10 min，分別取上清和沉淀；利用SDS-PAGE鑒定蛋白表達。最后將菌體裂解上清進行硫酸銨沉淀（80%）粗純后，利用疏水層析和羥基磷灰石進行兩步純化，收集洗脫液。1.2.5 表位疫苗免疫 取4-6周齡的雌性BalB/c小鼠18只，分6組，每組3只，皮下免疫3次，每次間隔兩周。接種劑量為每只小鼠100 μg HBc重組蛋白VLP抗原混合 Imject? Alum佐劑?？乖c佐劑的比例為 3∶1（V/V）。

1.2.6 ELISA檢測小鼠血清中抗體水平 在第3次免疫后第10天，利用眼眶取血收集血清。在96孔板中分別包被用PBS稀釋的表位多肽和Aβ42寡聚體（均為 0.5 μg/100 μL），血清利用封閉液按照 1∶100稀釋，二抗為 HRP標記的山羊抗小鼠IgG，其他步驟同1.2.2。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 所有實驗數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤差。采用T-TEST分析各組樣品間的顯著性差異。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學差異。*表示P＜0.05，**表示 P＜0.01，***表示 P＜0.001。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體多肽庫的篩選

經(jīng)過4 輪的篩選，噬菌體的產(chǎn)出量由4.5×106CFU/mL提高到1.0×109CFU/mL，投入產(chǎn)出比從2.3×10-5提高到5×10-3，提高了200多倍。淘選條件及噬菌體富集變化，見表1。

表1 噬菌體多肽庫的富集變化

2.2 噬菌體陽性克隆的淘選

ELISA檢測4輪淘選后獲得的單克隆噬菌體，經(jīng)OD450的比值分析，IVIG-AOB/對照（阿達木單抗）大于1.7被認為陽性克隆。一般以樣品組比上對照組大于2被認為陽性，為了獲得更多的克隆數(shù)，在此以大于1.7作為選擇參數(shù)。從288個克隆中挑出118株陽性克隆，并對其進行測序。結(jié)果表明，118株陽性克隆中共有6條序列具有兩次及兩次以上的重復，分別命名為C1-C6。

2.3 驗證多肽與IVIG的結(jié)合情況

ELISA檢測以上合成的6條多肽C1-C6，結(jié)果（圖1）表明，多肽C1與IVIG-AOB結(jié)合與對照組沒有差異，說明C1可能與抗體的恒定區(qū)結(jié)合；而C2-C6與IVIG-AOB的結(jié)合明顯高于與對照抗體的結(jié)合，說明C2-C6這5條多肽是潛在的Aβ寡聚體模擬表位。

圖1 ELISA檢測合成的環(huán)形7肽與IVIG-AOB的結(jié)合

2.4 HBc重組蛋白構(gòu)建、表達及純化分析

SDS-PAGE和Western Blot檢測表明HBc表位重組蛋白能夠成功表達，Western Blot檢測抗體是抗HBc抗體，目標條帶在14-17 kD之間（圖2），條帶大小與預期相符。

2.5 HBc表位重組蛋白組裝檢測

透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）檢測結(jié)果（圖3）表明，HBc表位重組蛋白組裝成正常的VLP顆粒。

2.6 HBc-VLP模擬表位疫苗免疫后血清中抗體的水平

包被表位多肽的ELISA檢測結(jié)果（圖4）表明，5種HBc表位疫苗免疫3次后都可誘發(fā)針對各自表位的抗體，表明HBc載體是一種有效的半抗原載體。包被Aβ42寡聚體的ELISA檢測結(jié)果表明，由于HBc-VLP是一種分子量大于3 000 kD，結(jié)構(gòu)復雜的大蛋白，能夠免疫產(chǎn)生多種抗體；Aβ42寡聚體則是不同分子量Aβ的混合物，包含多種不同的構(gòu)象表位，因此HBc-VLP免疫產(chǎn)生的抗體可能會和Aβ42寡聚體發(fā)生一些交叉反應，導致HBc產(chǎn)生的抗Aβ42寡聚體抗體水平偏高。然而HBc-C4誘導產(chǎn)生抗 Aβ42寡聚體抗體明顯高于HBc對照組，其余則與HBc對照組無顯著差異（圖5），表明C4多肽較好的模擬了Aβ42寡聚體表位。

圖2 SDS-PAGE（A）和Western-blot（B）檢測HBc及HBc重組蛋白表達情況

圖3 透射電鏡檢測純化后HBc-VLP重組蛋白

圖4 ELISA檢測小鼠血清中抗表位多肽IgG的水平

圖5 ELISA檢測小鼠血清中抗Aβ42寡聚體IgG的水平

3 討論

阿爾茨海默癥（AD）是一種持續(xù)性惡化的神經(jīng)退變性疾病，常發(fā)生于65歲以上的老人，是最常見的一種老年癡呆疾?。?3-15］。隨著世界人口老齡化的加劇，AD已成為最大的公共健康問題［16］。針對Aβ的免疫治療一直被認為是治療AD的突破口。目前，Aβ疫苗和抗體先后經(jīng)歷過30多次臨床試驗，但尚無一種疫苗或抗體能夠在III期臨床試驗中表現(xiàn)出良好的改善認知作用［15］。系統(tǒng)分析表明，目前臨床所使用的疫苗或者抗體都是針對Aβ單體的N端、中間或者C端，而Aβ單體具有正常的生理功能。因此利用免疫反應中和Aβ單體可能會引起潛在的副作用。同時，對AD發(fā)病機制的研究表明，由Aβ單體聚集形成寡聚體是AD發(fā)病的核心誘發(fā)因素，由此引發(fā)一系列毒性級聯(lián)反應［17］。因此，特異性靶向Aβ寡聚體的免疫制劑可能具有較好的治療效果，并能減少副作用產(chǎn)生。2016年，一例利用抗Aβ寡聚體的單克隆抗體Aducanumab治療AD的臨床實驗表明，Aducanumab能夠明顯改善AD患者的認知損傷和病理學損傷［10］。

本研究利用從IVIG中純化獲得的特異性結(jié)合Aβ42寡聚體的組分IVIG-AOB為靶抗體，通過隨機多肽庫淘選獲得了一系列與之結(jié)合的表位多肽；以HBc為載體構(gòu)建出多個表位載體疫苗，并進行免疫檢測從而成功篩選出一株可免疫產(chǎn)生Aβ寡聚體抗體模擬表位疫苗HBc-C4。IVIG-AOB作為一種Aβ寡聚體抗體，相較于目前商業(yè)化的Aβ寡聚體抗體A11和OC（均為兔源抗體），其來源于正常人體，安全性更高并特異性結(jié)合Aβ42寡聚體。篩選獲得表位多肽C4與Aβ42一級序列無任何同源性，且C4為環(huán)形的多肽，因此我們認為模擬表位C4免疫產(chǎn)生的抗體不應該與Aβ42單體結(jié)合，從而有效避免了自身免疫反應問題。

HBc-C4是一種完全模擬Aβ42寡聚體的表位疫苗，與目前已報道的Aβ聚集體疫苗-Affitope AD02，SDPM1，3A，pBri等相比具有明顯的優(yōu)勢。AD02表位與Aβ單體有50%同源性，其產(chǎn)生的抗體雖不和Aβ單體及APP結(jié)合，但主要識別Aβ纖維而非寡聚體［18］。SDPM1是一種可結(jié)合Aβ40聚集體的環(huán)形20肽，其免疫產(chǎn)生的抗體可結(jié)合Aβ聚集體而不能特異性針對寡聚體［19］。3A是由8種氨基酸（T、Y、S、H、I、V、F和L）隨機合成的20肽，3A本身并不能作為Aβ寡聚體表位，而是其聚集物可免疫產(chǎn)生抗Aβ前纖維狀寡聚體的抗體［20］。與3A相似，ABri多肽聚集后形成的聚合物-pABri免疫小鼠能誘發(fā)針對Aβ寡聚體的抗體反應［21］。AD02、SDPM1、3A及ABri等Aβ聚集體疫苗都能夠明顯改善AD轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶和病理損傷。因此，我們認為HBc-C4具有治療AD轉(zhuǎn)基因小鼠的潛力。除此之外，病毒樣顆粒（VLP）是一種呈遞外源表位理想的載體［12］，目前已有多種VLP疫苗應用于臨床研究，包括乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B virus surface antigen，HBs）疫苗和人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）疫苗［13］等。乙肝病毒核心抗原（Hepatitis B core antigen，HBc）作為抗原制備出的疫苗已得到十分廣泛的臨床應用，其安全性已經(jīng)得到確認。因而，以HBc-VLP作為載體制備的表位疫苗在未來臨床試驗中安全性優(yōu)越。

4 結(jié)論

本研究成功驗證了應用新型Aβ42寡聚體模擬表位制備AD疫苗的可行性。通過噬菌體篩選技術(shù)，成功獲得了一類Aβ42寡聚體模擬表位多肽，并將其克隆至HBc載體中，構(gòu)建HBc-VLP表位疫苗，通過免疫后篩選獲得一株可產(chǎn)生抗Aβ42寡聚體抗體的模擬表位疫苗株HBc-C4。

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Preparation of a Novel Aβ42 Oligomer Mimotope Vaccine

LIU Xiang-meng1YU Ya-dong2WANG Shao-wei3YU Xiao-lin3WANG Rui-ming1
（1. Department of Biology Engineering，QILU University of Technology，Jinan 250353 ；2. Kunming Environmental Monitoring Center，Kunming 650100 ；3. State Key Laboratory of Biochemical Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190）

The objective of this study is to obtain a mimotope vaccine specifically targeting to pathogenic Aβ42 oligomer. In previous studies，we purified an antibody IVIG-AOB，which specifically recognizes Aβ42 oligomers，from intravenous immunoglobulin（IVIG）by affinity chromatography. Using phage display technique，a series of ring-shape mimotope polypeptides were screened for specific binding to IVIG-AOB. These oligomer epitope peptide genes were then cloned to HBc-VLP vector and the recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. After that，the recombinant Aβ42 oligomer conformational epitope HBc-VLP vaccine were applied to Balb/c mice. The antibody responses induced by the Aβ42 oligomer-targeted VLP vaccine were determined. Five mimotope polypeptides specifically-bound with IVIGAOB were successfully screened from phage cyclic peptide library and cloned into HBc-VLP vector. The recombinant proteins were successfully expressed in E. coli. HBc-C4 elicited the highest antibody titer after vaccination to Balb/c mice. Conclusively，Aβ oligomer is the major factor in the pathological processes of Alzheimer’s disease（AD）. The mimotope HPc-VLP vaccine based on the unique structure of Aβ42 oligomer induced body to generate the antibody targeting and neutralizing the toxic Aβ42 oligomers，while not affecting its normal physiological function，thus it plays a fundamental role in the treatment of AD.

Alzheimer’s disease；Aβ42 oligomers；mimotope；vaccine；antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0488

2017-06-10

國家自然科學基金項目（81402837），國家科技重大專項（2014ZX09102041-007）

劉向蒙，男，碩士，研究方向：生物技術(shù)藥物；E-mail：liuxm@ipe.ac.cn

王瑞明，男，博士，教授，研究方向：微生物酶技術(shù)；E-mail：ruiming3k@163.com

（責任編輯 李楠）