副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠便秘的改善作用

曹永強(qiáng)，張 健，鄭 喆，梅雪洋，王世杰，朱 宏，楊貞耐,*

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)，北京 100048；3.石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊 050221）

副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠便秘的改善作用

曹永強(qiáng)1,2，張 健1,2，鄭 喆1,2，梅雪洋1,2，王世杰3，朱 宏3，楊貞耐1,2,*

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)，北京 100048；3.石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊 050221）

本研究基于鹽酸咯哌丁胺建模制造小鼠便秘模型，考察副干酪乳桿菌 N1115發(fā)酵乳對(duì)治療小鼠便秘的作用。低、中、高劑量副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳（活菌含量分別為1×107、1×108、1×109CFU/mL）連續(xù)灌胃15 d后，與對(duì)照組相比小鼠的排便量及糞便含水量均顯著升高（P＜0.05）；腸道推進(jìn)率分別為57.3%、67.3%和71.3%，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。氣相色譜儀分析小鼠糞便中的短鏈脂肪酸發(fā)現(xiàn)，灌胃副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳后，小鼠糞便中的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸含量顯著升高（P＜0.05），且短鏈脂肪酸種類(lèi)較模型組更為豐富。對(duì)小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸的組織形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，灌胃副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳的小鼠結(jié)腸黏膜完整，細(xì)胞排列整齊，而對(duì)照組的腸黏膜厚度降低，凹窩變淺。通過(guò)c-kit抗體對(duì)小鼠結(jié)腸中的腸間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICC）進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果顯示，灌胃副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳后小鼠的ICC含量顯著增加，表明副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳通過(guò)提高ICC活性，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)。綜上，副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳能夠有效緩解小鼠的便秘癥狀。

副干酪乳桿菌；發(fā)酵乳；便秘；短鏈脂肪酸

便秘是臨床的常見(jiàn)疾病，其發(fā)病機(jī)理及癥狀存在個(gè)體差異，常見(jiàn)的治療方法多以調(diào)養(yǎng)為主，其中益生菌在治療便秘方面具有突出的療效，是近年來(lái)臨床上常用的治療便秘的調(diào)節(jié)劑[1]。益生菌能夠定殖在人體腸道中，可以通過(guò)直接或者間接的方式調(diào)整腸道的菌群結(jié)構(gòu)，同時(shí)還可避免藥物治療帶來(lái)的副作用。益生菌主要包括乳桿菌[2]、雙歧桿菌[3]、革蘭氏陽(yáng)性球菌[4]等，其中乳桿菌中的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）廣泛存在于奶酪、泡菜等發(fā)酵食品，具有悠久的食用歷史，為食源安全性菌株[5]。副干酪乳桿菌可黏附于腸黏膜而阻止病原微生物的黏附，在腸道內(nèi)具有較好的生存能力，具有潤(rùn)腸、抑制有害菌生長(zhǎng)、維持腸道菌群平衡、降低膽固醇、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種保健功能[6-7]。Picard等[8]研究表明，副干酪乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中能夠提高腸道內(nèi)短鏈脂肪酸（shortchain fatty acid，SCFA）的濃度、降低腸道整體pH值、縮短腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，從而起到緩解便秘的作用。

對(duì)于副干酪乳桿菌緩解便秘的研究，大部分是基于菌株自身的理化特性，而關(guān)于該菌株發(fā)酵乳對(duì)便秘改善效果的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道[9]。通過(guò)發(fā)酵乳研究菌株的特性能夠更加真實(shí)地反映菌株在乳制品中的作用，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。本研究基于一株分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的副干酪乳桿菌N1115，前期研究表明，該菌株具有耐酸、耐膽鹽、促進(jìn)腸道細(xì)胞生長(zhǎng)等益生作用[10-11]。通過(guò)該菌株發(fā)酵脫脂乳，采用發(fā)酵乳灌胃便秘小鼠模型，研究其對(duì)小鼠便秘的改善作用，以期為益生菌發(fā)酵乳改善人體便秘的應(yīng)用提供參考依據(jù)，并為該菌株發(fā)酵乳的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性昆明小鼠60 只，6 周齡，平均體質(zhì)量為30 g左右，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供。

乙醚、鹽酸咯哌丁胺、蘇木紅染料、活性炭、甲醛、伊紅、鹽酸、蘇木精、冰醋酸、氯化鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L. paracasei N1115菌粉（NCBI 參考序列：NZ_CP007123.1，食品級(jí)） 石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司；脫脂乳粉（食品級(jí)） 新西蘭恒天然乳品有限公司；MABF360 c-kit抗體 德國(guó)達(dá)姆施塔特默克集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750高壓蒸汽滅菌器 日本三洋公司；FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；7890B氣相色譜（gas chromatograph，GC）儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；CR21Ⅲ離心機(jī) 日本Hitachi公司；BX53顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

脫脂乳培養(yǎng)基：去離子水1 L、葡萄糖20.0 g、脫脂乳粉12 g，攪拌均勻后置于95 ℃滅菌15 min。

活性炭溶液：阿拉伯膠100 g，去離子水800 mL，混勻，煮沸至溶液透明，再準(zhǔn)確加入50 g粉狀活性炭，連續(xù)煮沸3 次，冷卻后，加水定容至1 000 mL，4 ℃冷藏，使用前需搖勻。

1.3.2 副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳的制備

向100 mL巴氏殺菌脫脂乳培養(yǎng)基中接種副干酪乳桿菌N1115直投式發(fā)酵劑，42 ℃發(fā)酵至終pH值降至4.5，活菌含量為1×109CFU/mL，發(fā)酵液用相同濃度的脫脂乳培養(yǎng)基稀釋至1×107、1×108CFU/mL，同時(shí)用平板菌落計(jì)數(shù)法確定具體的副干酪乳桿菌N1115活菌含量。4 ℃貯藏，使用前37 ℃預(yù)熱5 min。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及模型的建立

實(shí)驗(yàn)前穩(wěn)定飼養(yǎng)小鼠1 周，控制動(dòng)物房溫度25℃、相對(duì)濕度50%，晝夜時(shí)間分明，不禁食不禁水。將小鼠分成3 組，分別為空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組各30 只，實(shí)驗(yàn)組又分為副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳低（1×107CFU/mL）、中（1×108CFU/mL）、高（1×109CFU/mL）劑量組各10只。灌胃對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠鹽酸洛哌丁胺5 mg/kg（以體質(zhì)量計(jì)，下同），早09∶00、晚18∶00各一次，連續(xù)灌胃7 d，構(gòu)造便秘模型。以排便量減少、糞便干硬、毛發(fā)粗糙、精神不振為小鼠便秘的判斷指標(biāo)。空白組灌胃等量的生理鹽水。造模成功后，空白組、對(duì)照組分別給予滅菌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的脫脂乳，實(shí)驗(yàn)組分別給予低、中、高3 個(gè)劑量組的副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳，灌胃量10 mg/（kg·d），連續(xù)灌胃15 d。

1.3.4 糞便指標(biāo)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄小鼠灌胃1、5、10、15 d的體質(zhì)量變化，同時(shí)記錄末次灌胃后小鼠的進(jìn)食和飲水量，收集6 h內(nèi)所有的新鮮糞便，置于帶蓋離心管中，記錄總質(zhì)量和糞便數(shù)量。將每組小鼠的糞便樣品均勻的分成3 份，1 份用來(lái)測(cè)定糞便含水率，另2 份用來(lái)測(cè)定SCFA含量和pH值。

1.3.4.1 糞便含水量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)量新鮮小鼠糞便質(zhì)量（m1），置于105 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量（m2），按公式（1）計(jì)算糞便含水量。

1.3.4.2 糞便SCFA含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg糞便樣品，加入0.9 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphata buffered saline，PBS）充分溶解，加入1/6體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%硫酸混勻后，再加入1 mL乙醚，振蕩10 min，3 000 r/min離心5 min，取乙醚層，加入無(wú)水氯化鈣除去水分，取2 μL樣品用于GC測(cè)定[16]。

1.3.4.3 糞便pH值的測(cè)定

將一定質(zhì)量的小鼠新鮮糞便制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的懸濁液，溶劑為去離子水，使用pH計(jì)測(cè)定懸濁液pH值。

1.3.5 腸道推進(jìn)率的測(cè)定

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期最后一天（第15天），小鼠禁食不禁水12 h后，分別對(duì)空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組小鼠灌胃1 mL墨汁，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)30 min后脫頸椎處死小鼠，解剖腹腔剪取上端自幽門(mén)、下端至回盲腸部的腸管，置于白板上，噴灑無(wú)菌水以防止小腸黏結(jié)，輕輕將小腸拉成直線(xiàn)，測(cè)量腸管總長(zhǎng)度（L1），從幽門(mén)至墨汁前沿為墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度（L2），按公式（2）計(jì)算腸道推進(jìn)率。

1.3.6 遠(yuǎn)端結(jié)腸組織微觀結(jié)構(gòu)觀察

脫頸處死小鼠并解剖，取遠(yuǎn)端結(jié)腸1 cm，放入10%中性甲醛溶液浸泡保存，做常規(guī)切片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 免疫組化實(shí)驗(yàn)

組織切片依次用二甲苯、乙醇溶液和去離子水沖洗脫蠟，復(fù)水并靜置一段時(shí)間后加入3% H2O2浸泡10 min以除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，去離子水清洗后再加入檸檬酸鹽緩沖液，微波爐95 ℃加熱10 min使抗體復(fù)性，水洗2 次后浸入PBS沖洗，擦干載玻片周?chē)鶳BS后立即滴加血清，置于37 ℃恒溫箱中0.5 h進(jìn)行血清封閉。取出載玻片擦干組織周?chē)澹渭右豢筩-kit（1∶200），37 ℃孵化2 h，PBS洗滌2 次，擦干組織周?chē)彌_液，滴加生物素共軛二次抗體，37 ℃孵化30 min，取出后PBS洗滌3 次，擦干周?chē)鶳BS，滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，37 ℃恒溫箱中孵化30 min，取出后PBS清洗3 次，擦干周?chē)鶳BS，加DAB染色，顯色后將染片用清水沖洗，浸泡于蘇木精中復(fù)染，復(fù)染后的染片依次用去離水、乙醇、二甲苯脫水，最后用中性樹(shù)膠封片，通過(guò)顯微鏡拍照，圖像通過(guò)Image Pro Plus軟件處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)樣品3 組平行，結(jié)果取平均值，以 ±s表示，SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量和飲水量變化

圖1 副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠體質(zhì)量（A），末次灌胃后小鼠進(jìn)食量（B）、進(jìn)水量（C）的影響Fig. 1 Effect of L. paracasei N1115 fermented milk on body weight (A),food intake (B), and water intake (C) in mice after the last administration

由圖1A可知，總體上所有組別小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的體質(zhì)量均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。此外，雖然對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量略低于其他組，但是各組小鼠的體質(zhì)量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。從圖1B可以看出，末次灌胃后各組小鼠進(jìn)食量之間存在差異，其中，對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)中的進(jìn)食量最低（P＜0.05），此外，各實(shí)驗(yàn)組小鼠之間的進(jìn)食量之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。從圖1C還可看出，各組小鼠飲水量之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 小鼠腸道推進(jìn)率變化

從圖2可以看出，空白組和實(shí)驗(yàn)組皆與對(duì)照組之間存在顯著差異（P＜0.05），其中空白組的腸道推進(jìn)率最高為73.6%，對(duì)照組的腸道推進(jìn)率最低為49.3%，而實(shí)驗(yàn)組中的腸道推進(jìn)率皆顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分別為57.3%、67.3%和71.3%，并且隨著副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳菌數(shù)的提高，腸道推進(jìn)率也逐漸提高。

圖2 副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠腸道推進(jìn)率的影響Fig. 2 Effect of L. paracasei N1115 fermented milk on intestinal propulsion in mice

2.3 末次灌胃后小鼠糞便指標(biāo)分析結(jié)果

表1 副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)末次灌胃后小鼠排便量及糞便含水量的影響Table 1 Effect of L. paracasei N1115 fermented milk on fecal parameters in mice after the last intragastric administration

收集小鼠在灌胃后6 h內(nèi)的糞便，對(duì)空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組小鼠的糞便分別計(jì)數(shù)、稱(chēng)質(zhì)量，測(cè)定糞便含水量，結(jié)果由表1可知，對(duì)照組與空白組之間各指標(biāo)均存在顯著差異（P＜0.05），其小鼠糞便質(zhì)量最低，為0.030 g/粒。實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便質(zhì)量之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但是均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。小鼠糞便顆粒數(shù)中對(duì)照組最小，為18.75 粒，空白組和實(shí)驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）?？瞻捉M、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組之間糞便含水量存在顯著性差異，其中對(duì)照組的糞便含水量較少，糞便比較干燥，而空白組糞便含水量最高，為52.51%。實(shí)驗(yàn)組之間不存在顯著差異（P＞0.05），但是均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4 小鼠糞便pH值變化

圖3 副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠糞便pH值的影響Fig. 3 Effect of L. paracasei N1115 fermented milk on pH in mice feces

從圖3中可以看出，空白組和實(shí)驗(yàn)組皆與對(duì)照組之間存在顯著差異（P＜0.05），其中對(duì)照組的小鼠糞便pH值最高，為7.33，高于所有實(shí)驗(yàn)組。隨著副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳活菌含量的增加，實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便pH值從低劑量組到高劑量組呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，且均顯著低于對(duì)照組的pH值（P＜0.05）。

2.5 小鼠糞便SCFA種類(lèi)及含量

表2 副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳小鼠糞便中SCFA含量的影響Table 2 Effect of L. paracasei N1115 fermented milk on SCFA contents in mice feces

小鼠糞便中的SCFA種類(lèi)及含量的變化由表2可知，對(duì)照組小鼠糞便中的主要SCFA為乙酸、丙酸、丁酸和戊酸，其含量均顯著低于其他組別（P＜0.05）。此外，實(shí)驗(yàn)組中乙酸、丁酸、丙酸和戊酸的含量均顯著高于空白組和對(duì)照組（P＜0.05）。另外，實(shí)驗(yàn)組的小鼠糞便中還含有異丁酸，該酸在對(duì)照組和空白組中均不存在。

2.6 小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織微觀結(jié)構(gòu)觀察

圖4 副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織微觀結(jié)構(gòu)的影響（×100）Fig. 4 Effect of L. paracasei N1115 fermented milk on microstructure of distal colon tissue in mice (× 100)

通過(guò)組織切片可更好地觀察不同組小鼠的腸道微觀結(jié)構(gòu)，小鼠的遠(yuǎn)端結(jié)腸組織經(jīng)過(guò)石蠟包埋后切片，染色后的結(jié)腸組織橫截面的顯微圖如圖4所示?？瞻捉M的結(jié)腸黏膜的上皮完整，未見(jiàn)萎縮、糜爛、壞死，細(xì)胞排列整齊，其間散落分布杯狀細(xì)胞，絨毛豐富，符合健康狀態(tài)下小鼠腸道黏膜的形態(tài)特征。然而，鹽酸咯哌丁胺導(dǎo)致小鼠便秘后，其結(jié)腸組織會(huì)受到相應(yīng)的影響。從圖4b可以看出，黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生脫落，造成黏膜表面形成凹型缺陷，小腸黏膜細(xì)胞排列不均一，杯狀細(xì)胞的數(shù)量有所下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)灌胃副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳后，便秘組的小鼠的腸道黏膜形態(tài)學(xué)特征會(huì)有一定程度的恢復(fù)。從圖4c～e可以看出，隨著發(fā)酵乳中干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳菌數(shù)的增加，小鼠結(jié)腸組織的細(xì)胞排列越來(lái)越均勻，褶皺深度逐漸加深，高劑量組的結(jié)腸特征與空白組的結(jié)腸特征接近。

2.7 免疫組化分析

圖5 副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸免疫組化的影響（×100）Fig. 5 Effect of L. paracasei N1115 fermented milk on immunohistochemical characteristics of ICC in the mouse distal colon (×100)

圖6 副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠ICC數(shù)量的影響Fig. 6 Effect of L. paracasei N1115 fermented milk on the quantity of colonic ICC in mice

不同組小鼠結(jié)腸組織ICC含量可以通過(guò)與c-kit抗體特異性結(jié)合表達(dá)來(lái)量化，通過(guò)免疫組化染色得到各組ICC特異性表達(dá)的圖片如圖5所示，c-kit抗體結(jié)合ICC后會(huì)顯棕黃色，各組ICC數(shù)量和活性存在一定的差異。為了更好地研究組間的差異，通過(guò)Image Pro Plus軟件對(duì)經(jīng)免疫組化處理后的ICC進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖6所示，空白組、對(duì)照阻和實(shí)驗(yàn)組單位面積內(nèi)ICC數(shù)量存在顯著差異（P＜0.05）。其中，空白組單位面積內(nèi)ICC數(shù)量最多，表明該組腸道平滑肌中的ICC數(shù)量較高，從圖5a中也能看出其色澤較深，對(duì)照組的ICC數(shù)量顯著低于空白組（P＜0.05）。然而灌胃副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳后，各實(shí)驗(yàn)組中各劑量組的ICC數(shù)量均顯著高于對(duì)照組。此外，從圖6可以看出，隨著副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳中菌含量增加，c-kit抗體特異性表達(dá)更顯著。

3 結(jié) 論

采用灌胃鹽酸咯哌丁胺建造小鼠便秘模型[12]。鹽酸咯哌丁胺造模后導(dǎo)致小鼠便秘、食欲降低，表明鹽酸咯哌丁胺造模成功[13]。本實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比較，副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠的體質(zhì)量及進(jìn)食量、飲水量無(wú)顯著影響。

小鼠腸道推進(jìn)率是指消化物在單位時(shí)間內(nèi)在腸道內(nèi)推進(jìn)的速率，是研究小鼠便秘情況的重要指標(biāo)之一。小腸運(yùn)動(dòng)主要是通過(guò)蠕動(dòng)力推動(dòng)腸內(nèi)容物運(yùn)動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵乳能夠提高便秘小鼠的腸道推進(jìn)率，能夠有效地改善便秘問(wèn)題。這可能存在兩方面的原因：一是副干酪乳桿菌N1115可改善腸道菌群環(huán)境，刺激腸道蠕動(dòng)，治療便秘；另一原因可能是干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳中含有益生元，可促進(jìn)腸道內(nèi)菌群的生長(zhǎng)與活動(dòng)，改善便秘，這與周曉丹等[14]研究干酪乳桿菌LC-01促進(jìn)腸道蠕動(dòng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

糞便含水量表征糞便的干燥程度，糞便越干燥，表明小鼠便秘情況越嚴(yán)重。通過(guò)灌胃不同菌含量的副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳，小鼠糞便數(shù)量和質(zhì)量提高，表明干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳起到了一定的緩解便秘的作用。實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組便秘小鼠的糞便pH值偏高，通過(guò)灌胃副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳后，腸道pH值降低，表明副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠便秘起到了一定的緩解作用，且隨著菌含量的增高，其預(yù)防便秘的效果愈加顯著。

研究表明，腸道SCFA是結(jié)腸桿菌的發(fā)酵雜多糖的終產(chǎn)物[15-16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明灌胃副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳會(huì)影響小鼠糞便中SCFA的含量[17]，其中，乙酸含量增加原因可能是由于乙酸積累。丁酸、丙酸、戊酸含量增加的原因可能有兩方面，一方面，副干酪乳桿菌N1115會(huì)影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，影響腸道菌群產(chǎn)酸。副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳中的益生元可促進(jìn)腸道中結(jié)腸桿菌的生長(zhǎng)代謝，促進(jìn)其分解雜多糖產(chǎn)酸。另一方面，丁酸為腸道細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)提供能量，促進(jìn)腸道細(xì)胞的增殖，提高腸道動(dòng)力，加快腸道蠕動(dòng)速率[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過(guò)灌胃副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳，小鼠糞便中的SCFA種類(lèi)發(fā)生變化，異丁酸對(duì)于促進(jìn)小鼠腸道蠕動(dòng)具有潛在的作用[19-20]。綜上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)灌胃副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳導(dǎo)致小鼠糞便中SCFA含量和種類(lèi)的變化會(huì)促進(jìn)小鼠的腸道蠕動(dòng)，從而緩解便秘狀況。

Shimotoyodome等[21]研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸咯哌丁胺會(huì)損傷小鼠的結(jié)腸黏膜，一方面可能是由于副干酪乳桿菌N1115與腸道中有益菌的協(xié)同作用，促進(jìn)其產(chǎn)生丁酸，丁酸可為小鼠的腸道細(xì)胞提供能量，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，同時(shí)，益生菌利用丁酸產(chǎn)生的丁酸鈉還具有修復(fù)腸道黏膜，增加腸道絨毛長(zhǎng)度的作用[22-23]，這與上面研究小鼠糞便中的SCFA的結(jié)果相一致；另一方面，副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳中的有機(jī)酸可能可以調(diào)節(jié)腸道菌群環(huán)境[24]，曹山川等[25]在仔豬飼料中添加有機(jī)酸，仔豬的腸道絨毛會(huì)增加。高增兵等[26]研究發(fā)現(xiàn)，某些有機(jī)酸（如苯甲酸等）會(huì)修復(fù)腸道黏膜，調(diào)節(jié)腸道菌群環(huán)境，具有潛在的提高腸道菌群中雙歧桿菌活性的能力。綜上結(jié)果表明，副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳能夠有效抑制鹽酸咯哌丁胺造成的小鼠結(jié)腸黏膜的持續(xù)惡化，修復(fù)小鼠腸道黏膜，提高腸道黏膜細(xì)胞的活性，對(duì)改善小鼠便秘起一定的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，若ICC之間或其與平滑肌細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到損傷，腸道的運(yùn)動(dòng)功能就會(huì)受到抑制[26]。灌胃鹽酸咯哌丁胺后，小鼠產(chǎn)生便秘癥狀，腸道平滑肌中的ICC受到抑制，小鼠腸道蠕動(dòng)速率降低。而灌胃副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳后，ICC數(shù)量提高，腸道蠕動(dòng)速率升高，表明副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠腸道ICC具有促進(jìn)作用，這一方面可能是由于副干酪乳桿菌N1115的產(chǎn)酸特性導(dǎo)致的[27-28]。另一方面是腸道細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)得到修復(fù)，活性提高導(dǎo)致的[29-30]。故推測(cè)副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠的腸間質(zhì)細(xì)胞具有促進(jìn)作用。

對(duì)于副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳的功能特性研究表明，一方面其可提高便秘小鼠的腸道推進(jìn)率，提高便秘小鼠的糞便質(zhì)量、排便量及糞便中的含水量；另一方面，其影響糞便中SCFA的含量及種類(lèi)，糞便中測(cè)到的異丁酸有利于促進(jìn)腸道蠕動(dòng)。另外，副干酪乳桿菌N1115會(huì)使小鼠糞便的pH值顯著降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)活菌含量達(dá)到1×109CFU/mL時(shí)，這種改善效果更加顯著。

對(duì)小鼠腸道遠(yuǎn)端結(jié)腸組織進(jìn)一步的生理分析發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵乳中副干酪乳桿菌N1115活菌含量的增加，小鼠結(jié)腸組織的細(xì)胞排列越來(lái)越均勻，褶皺深度逐漸加深，高劑量組的結(jié)腸特征與實(shí)驗(yàn)組的結(jié)腸特征接近。此外，實(shí)驗(yàn)組腸間質(zhì)細(xì)胞ICC數(shù)量顯著高于對(duì)照組。本研究結(jié)果表明，副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠便秘具有一定的改善作用。

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Therapeutic Effect of Lactobacillus paracasei N1115 Fermented Milk in Constipated Mice

CAO Yongqiang1,2, ZHANG Jian1,2, ZHENG Zhe1,2, MEI Xueyang1,2, WANG Shijie3, ZHU Hong3, YANG Zhennai1,2,*
(1. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University,Beijing 100048, China; 2. Beijing Laboratory for Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University,Beijing 100048, China; 3. Shijiazhuang Junlebao Dairy Co. Ltd., Shijiazhuang 050211, China)

In this study, the therapeutic effect of Lactobacillus paracasei N1115 fermented milk on constipation was examined by using a mouse model of constipation induced by loperamide hydrochloride. After 15 days of feeding with the fermented milk at low (1 × 107CFU/mL), middle (1 × 108CFU/mL) and high (1 × 109CFU/mL) dosages, the constipated mice had a signif i cant increase in defecation and fecal moisture content (P ＜ 0.05) as well as increased intestinal propulsion rates of 57.3%, 67.3% and 71.3%, respectively, when compared with the control group (P ＜ 0.05). Analysis of short chain fatty acids in feces by gas chromatography-mass spectrometry showed significantly increased contents of acetic acid,propionic acid, butyric acid and valeric acid in the treated mice (P ＜ 0.05) along with more diverse short chain fatty acids than compared with the control mice. Histological analysis of distal colon tissue showed that the colon mucosa of the treated mice remained intact with orderly cell arrangement, while that of the model control mice was reduced in thickness with shallower pits. Furthermore, immunohistochemical analysis of interstitial cells of Cajal (ICC) in colon tissue using c-kit antibody showed that feeding constipated mice with the fermented milk significantly increased colonic ICC, indicating increased ICC activity and intestinal movement. These results showed that L. paracasei N1115 fermented milk had a positive therapeutic effect on constipation.

Lactobacillus paracasei; fermented milk; constipation; short chain fatty acids

10.7506/spkx1002-6630-201801028

TS218

A

1002-6630（2018）01-0185-07

曹永強(qiáng), 張健, 鄭喆, 等. 副干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠便秘的改善作用[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(1): 185-191.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801028. http://www.spkx.net.cn

2016-10-17

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371804）；副干酪乳桿菌N1115抗后酸化菌株的選育及應(yīng)用研究橫向項(xiàng)目

曹永強(qiáng)（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)。E-mail：caoyongqiang91@163.com

*通信作者簡(jiǎn)介：楊貞耐（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)及加工技術(shù)。E-mail：yangzhennai@th.btbu.edu.cn

CAO Yongqiang, ZHANG Jian, ZHENG Zhe, et al. Therapeutic effect of Lactobacillus paracasei N1115 fermented milk in constipated mice[J]. Food Science, 2018, 39(1): 185-191. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801028. http://www.spkx.net.cn