可耐受高溫對黑曲霉生物膜體外模型構(gòu)建的影響

曾 榮，童建波，劉宇甄，陳 青，林 彤，李 岷，呂桂霞

1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所，南京 210042 2 江蘇省血液中心，南京 210042 3江蘇省皮膚性病學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，南京 210042

·論著·

可耐受高溫對黑曲霉生物膜體外模型構(gòu)建的影響

曾 榮1，童建波1，劉宇甄1，陳 青2，林 彤1，李 岷3，呂桂霞1

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所，南京 2100422江蘇省血液中心，南京 2100423江蘇省皮膚性病學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，南京 210042

目的在可耐受高溫作用下構(gòu)建黑曲霉生物膜模型，探討可耐受高溫效應(yīng)對其形成結(jié)構(gòu)及活力的影響。方法對比37℃下，分別采用共聚焦激光掃描顯微鏡和甲基四氮鹽法探索在不同高溫效應(yīng)下(39℃或41℃)體外黑曲霉生物膜形成過程中的多個時間觀察點(4、8、10、16、24、48和72 h)的超微結(jié)構(gòu)差異及活力變化。結(jié)果與37℃相比，在4 h時，溫度較高的39℃組和41℃組黏附率均顯著降低(t=8.603，P=0.047；t=14.550，P=0.008)，黏附濃度也均顯著降低(t=8.315，P=0.0021；t=11.748，P=0.0015)；在8 h時，溫度越高，出芽率越低(t=8.906，P=0.049；t=23.310，P=0.009)、菌絲長度越短(t=35.118，P=0.039；t=63.450，P=0.006)；在10～16 h菌絲生長階段，溫度越高菌絲極性生長破壞越嚴(yán)重，菌絲越彎曲，且分枝越多，活力越高(t=24.262，P=0.038；t=7.556，P=0.031)；24 h時，溫度越高生物膜厚度越薄(t=2.375，P=0.043，t=5.263，P=0.031)，菌絲方向性越差，活力越低(t=24.262，P=0.038；t=7.556，P=0.031)。結(jié)論可耐受高溫作用能夠在一定程度上抑制黑曲霉生物膜的形成及其活力。

黑曲霉；生物膜；高溫作用

黑曲霉是侵襲性曲霉病的重要致病菌之一，在多個調(diào)查中均發(fā)現(xiàn)其處于常見致病曲霉菌的前3位[1- 2]。據(jù)統(tǒng)計該病的致死率可達30%～90%[3- 4]。造成如此高的致死率可能與曲霉在體內(nèi)形成生物膜形態(tài)相關(guān)。生物膜是一種菌體和生物膜基質(zhì)混合形成的菌體復(fù)合體。生物膜耐藥性及致病性均較懸浮菌顯著增加。外源性的持續(xù)可耐受高溫效應(yīng)常被用于肌肉拉傷、感染等方面疾病的治療[5- 6]。因此，本研究擬使用可耐受高溫作用于黑曲霉生物膜形成過程探索可耐受高溫作用對黑曲霉生物膜形成的影響，為日后可耐受高溫應(yīng)用于黑曲霉生物膜相關(guān)感染的臨床治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

菌株、主要試劑及儀器黑曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC16404)購自美國(American Type Culture Collection，ATCC)；FUN- 1(Invitrogen)、XTT(Sigma)、RPMI- 1640(Gibco)；共聚焦激光掃描顯微鏡(OLYMPUS-FV1000)、酶標(biāo)儀(Thermo)、恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

生物膜體外模型構(gòu)建構(gòu)建方法參考曲霉的生物膜構(gòu)建方法[7]。按要求菌懸液制備完成后，將菌懸液分別接種于24孔組織培養(yǎng)板中。24孔組織培養(yǎng)板培養(yǎng)孔在菌懸液接種前提前放置圓形無菌細胞爬片(直徑13 mm)。后分別置于3個不同的溫度下(37℃、39℃或41℃)進行培養(yǎng)。

不同溫度作用下黑曲霉生物膜形成過程和結(jié)構(gòu)特征采用共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)對不同可耐受高溫作用下(37℃、39℃和41℃)孢子的黏附率、黏附濃度、出芽率、菌絲生長長度及菌絲的形態(tài)差異進行對比觀察。通過拍攝5個以上的激光共聚焦顯微鏡照片計算孢子在細胞爬片上的黏附濃度(個/mm2)及黏附率。使用CLSM對生物膜的整個形成過程進行掃描觀察，并使用軟件(Olympus Fluo View Vesion 3.1 Viewer)對菌絲的形態(tài)、長度進行測量及對生物膜的立體結(jié)構(gòu)進行三維重建并對生物膜的厚度進行測量(圖1)。操作方法按照試劑說明書配制FUN- 1熒光染料緩沖液。使FUN- 1熒光染料終濃度為25 μmol/L。在預(yù)先設(shè)定的時間點4、8、10、16、24、48及72 h取出細胞爬片。使用1×PBS清洗生物膜表面，反復(fù)3次。在生物膜表面加入200 μl上述FUN- 1液體。室溫避光孵育30 min后，使用CLSM進行觀察，激發(fā)光波長為488 nm。

生物膜的活力測定按照說明書配制甲基四氮鹽/維生素K3(XTT/VitK3)混合液。使XTT/VitK3混合液終濃度為XTT(0.5 mg/ml)/VitK3(10 mmol/L)測定生物膜活體部分的代謝活力，即生物膜活力，以此評價生物膜的生長情況。在預(yù)先設(shè)定的時間點4、8、10、16、24、48及72 h進行生物膜活力測定。取出培養(yǎng)板，先吸棄懸浮液，再使用PBS清洗24孔組織培養(yǎng)板中的生物膜3遍。然后向孔內(nèi)加人500 μl XTT/VitK3混合液。鋁箔紙包扎，避光37℃培養(yǎng)3 h。將上清吸至新的酶標(biāo)儀板中使用酶標(biāo)儀在490 nm波長下讀取數(shù)據(jù)。記錄相關(guān)數(shù)值。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用兩獨立樣本比較的t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

可耐受高溫對黑曲霉生物膜早期形成階段(0～15h)的影響在4 h時37℃、39℃及41℃的黏附率分別為(26.1±5.2)%、(17.3±3.4)%及(14.6±4.1)%，黏附濃度分別為(130.5±12.3)/mm2、(85.6±8.3)/mm2及(70.6±7.2)/mm2。39℃及41℃組黏附率較37℃組均顯著降低(t=8.603，P=0.047；t=14.550，P=0.008)；39℃及41℃組黏附濃度較37℃組均顯著降低(t=8.315，P=0.002；t=11.748，P=0.002)；且溫度越高，黏附率和黏附濃度越低；在8 h時37℃、39℃及41℃的孢子出芽率分別為(88.2±12.1)%、(68.4±10.3)%及(27.7±7.1)%。39℃及41℃組出芽率較37℃組均顯著降低(t=8.906，P=0.049；t=23.310，P=0.009)；且溫度越高，出芽率越低；在8 h時測量菌絲長度，37℃、39℃及41℃的菌絲長度分別為(45.50±2.44)mm、(24.50±1.67)mm及(9.20±1.24)mm。39℃及41℃組菌絲長度較37℃組均顯著縮短(t=35.118，P=0.039；t=63.450，P=0.006)；且溫度越高，菌絲長度越短(圖2)；在10～15 h，37℃組菌絲直且長，而可耐受高溫組菌絲短，且分枝多，且溫度越高上述情況越顯著(圖1)。

可耐受高溫對黑曲霉生物膜晚期形成階段(16～72h)的影響16～24 h時，與37℃組相比，高溫效應(yīng)組菌絲極性生長情況進一步被破壞，菌絲卷曲明顯，菌絲纏繞無序，不夠致密，且溫度越高，上述現(xiàn)象越明顯(圖1)。通過CLSM對黑曲霉生物膜形成過程進行逐層掃描，結(jié)果顯示在16 h時，37℃、39℃及41℃的生物膜厚度分別為(129.5±2.2)μm、(141.0±3.2)μm及(154.3±5.2)μm。39℃組生物膜厚度較37℃對照組厚(t=2.375，P=0.043)；41℃組生物膜厚度較37℃組顯著增厚(t=5.263，P=0.031)，且溫度越高生物膜厚度越厚。然而在24～72 h時，3種溫度作用下生物膜厚度出現(xiàn)了趨勢逆反。在24 h時37℃、39℃及41℃的生物膜厚度分別為(177.5±3.3)μm、(165.7±4.5)μm及(151.3±2.5)μm。39℃及41℃組生物膜厚度較37℃組變薄(t=9.213，P=0.035；t=5.872，P=0.031)，且溫度越高生物膜厚度越薄(t=3.826，P=0.043)(圖3)。

可耐受高溫對黑曲霉生物膜形成活力的影響在4～8 h時，與37℃正常溫度相比，可耐受高溫作用下生物膜活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.213，P=0.256)。10 h時37℃、39℃和41℃的XTT值分別為0.543±0.04、0.355±0.02和0.154±0.09。39℃及41℃組XTT活力值較37℃組均顯著降低(t=13.068，P=0.027；t=10.271，P=0.019)；且溫度越高，生物膜活力值越低。然而在16 h時，37℃、39℃和41℃的XTT值分別為0.641±0.04、0.842±0.05和0.887±0.12。39℃及41℃組XTT活力值較37℃組均顯著增高(t=24.262，P=0.038；t=7.556，P=0.031)。但在24 h后，37℃、39℃和41℃的XTT值分別為1.680±0.09、1.380±0.11和1.080±0.14。39℃及41℃組XTT活力值較37℃組均顯著降低(t=23.541，P=0.046；t=7.264，P=0.033)，且溫度越高，生物膜活力值越低(t=4.367，P=0.046)(圖4)。

討 論

黑曲霉是侵襲性曲霉病感染的重要致病菌。該菌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。雖然有不少新型抗真菌藥物的出現(xiàn)，但是其致死率仍較高。因此，尋求其他有效治療黑曲霉感染的方法十分必要?？赡褪芨邷匦?yīng)在一些疾病的治療方面取得了欣喜的效果，本研究試圖探索該方法是否有助于抑制黑曲霉生物膜的形成。

生物膜形成過程包括孢子黏附、出芽、菌絲生長、菌絲纏繞和生物膜基質(zhì)的形成。本研究結(jié)果顯示黑曲霉懸浮菌在3個不同溫度(37℃、39℃和41℃)培養(yǎng)4 h后，溫度越高、黏附率越低，表明溫度高可能會抑制黑曲霉孢子黏附，而黏附正是生物膜形成的第一步，也是真菌重要的致病因素之一。Cho等[8]在高溫效應(yīng)下構(gòu)建白念珠菌生物膜模型時發(fā)現(xiàn)37℃、39℃和41℃組孢子的黏附率、黏附濃度無差異。筆者推測可能是因為白念珠菌更能耐受這個范圍的高溫作用。而有可能這一特性正是導(dǎo)致白念珠菌臨床發(fā)病率顯著高于黑曲霉的重要原因之一。在8 h時，與37℃正常溫度相比，39℃和41℃菌絲生長長度顯著短于正常溫度組，且溫度越高，菌絲長度越短，表明從孢子萌芽至菌絲初步生長階段37℃是最適宜的生長溫度。在10～16 h時，本研究顯示37℃組菌絲細長，呈現(xiàn)極性生長，既有橫向方向性生長，又有豎直方向的生長狀態(tài)，而高溫組39℃、41℃組菌絲方向性生長較差，菌絲較細短，且過早出現(xiàn)彎曲、分枝，溫度越高，上述現(xiàn)象越明顯，表明高溫會影響菌絲的極性生長。在絲狀真菌中極性生長是其重要的生長方式，這和它的致病性密切相關(guān)[9]。孢子在出芽前先經(jīng)歷了一小段時間的對稱性生長后就會進入極性生長階段，這個階段一直會持續(xù)調(diào)控菌絲的生長及延長，雖然有不少對極性生長方面的研究，但是其具體機制仍不清楚。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)在常溫作用下，煙曲霉溫度敏感株△fcwh41菌株不能夠呈現(xiàn)極性生長，而正常野生株在同樣溫度下可進行極性生長。Castillo-Lluva等[11]在玉蜀黍黑粉菌溫度敏感株cdk5突變株也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。然而Chen等[12]使用綠色熒光蛋白標(biāo)記鈣調(diào)素的構(gòu)巢曲霉菌株上發(fā)現(xiàn)在37℃和42℃作用下，控制菌絲生長方向的綠色熒光蛋白均處于極性生長的頂端，菌絲均呈極性生長。黑曲霉與其存在差異可能是因為構(gòu)巢曲霉要更多地適應(yīng)自然環(huán)境，因此需要更好地耐受自然界的高溫環(huán)境，而作為人體常見的致病菌黑曲霉并不需要具備這項能力。

圖1利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察黑曲霉生物膜在3種不同溫度(37℃、39℃和41℃)作用下的各個時間點(4、8、10、16、24 h)的形成情況(A～E)，并使用該顯微鏡自帶三維重建軟件對生物膜進行三維重建(F)

Fig1Images ofAspergillusnigerbiofilm formation at 37℃，39℃，and 41℃ obtained by confocal laser scanning microscopy at different time points (4，8，10，16，and 24 hours) (A-E)，three-dimensional images of biofilm were construct by 3D reconstruction software of confocal laser scanning microscopy (F)

aP=0.047；bP=0.008；cP=0.0021；dP=0.0015；eP=0.049；fP=0.009；gP=0.0039；hP=0.006

A.菌懸液接種4 h后的黏附率；B.菌懸液接種4 h后孢子在細胞爬片上的黏附濃度；C.菌懸液接種8 h后孢子的出芽率；D.菌懸液接種8 h后菌絲的長度

A.the adherence rates after 4 hours of inoculation；B.the concentration of cells after 4 hours of inoculation；C.the germination rate after 8 hours of inoculation；D.the hyphal lengths after 8 hours of inoculation

圖2在不同溫度作用下黑曲霉生物膜早期形成階段的動態(tài)變化

Fig2The dynamic change ofAspergillusnigercells in biofilm formation after treatment with different mild heat temperature

t=2.375，a1P=0.043；t=5.263，b1P=0.031；t=9.213，a2P=0.035；t=5.872，b2P=0.031

圖3共聚焦激光掃描顯微鏡測定不同時間點在37℃、39℃ 和 41℃作用下生物膜形成過程中厚度變化

Fig3The thickness of biofilm under different mild heat stress conditions at 37℃，39℃，and 41℃ by confocal laser scanning microscopy at different time points

t=13.068，a1P=0.027；t=10.271，b1P=0.019；t=24.262，a2P=0.038；t=7.556，b2P=0.031；t=23.541，a3P=0.046；t=7.264，b3P=0.033

圖4甲基四氮鹽法檢測不同時間點在37℃、39℃ 和 41℃作用下生物膜活力變化

Fig4The dynamic change of biofilm under different mild heat stress conditions at 37℃，39℃，and 41°C by 2，3-bis(2-methoxy- 4-nitro- 5-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium- 5-carboxanilide reduction assay at different time points

本研究顯示極性生長可能與生物膜形成的厚度密切相關(guān)。在16 h時可耐受高溫組41℃和39℃雖然菌絲數(shù)量及XTT檢測活力均高于37℃正常溫度對照組，但是在菌懸液培育24 h后生物膜整體厚度及活力反而較37℃正常溫度對照組薄，且整體活力低，推測這可能與觀察到可耐受高溫組菌絲過早出現(xiàn)分枝，且分枝在垂直于生物膜生長接觸面方向較短，導(dǎo)致生物膜豎直方向生長空間狹小有關(guān)。因此筆者推測極性生長狀態(tài)的菌絲能夠構(gòu)建更厚的生物膜是因為極性生長能夠使菌絲在接觸面的垂直方向更好地生長。37℃是黑曲霉極性生長的最佳溫度，因此，筆者推測37℃是最適合生物膜生長的溫度，過高的溫度將削弱生物膜的形成。

綜上，本研究顯示可耐受高溫作用能夠較好地抑制黑曲霉生物膜的形成，該效應(yīng)能否運用于臨床治療尚需要更多的動物實驗及大量的臨床試驗進行驗證。

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InVitroEfficacyofContinuousMildHighTemperatureontheBiofilmFormationofAspergillusNiger

ZENG Rong1，TONG Jianbo1，LIU Yuzhen1，CHEN Qing2，LIN Tong1，LI Min3，Lü Guixia1

1Institute of Dermatology，CAMS and PUMC，Nanjing 210042，China2Jiangsu Province Blood Center，Nanjing 210042，China3Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases & STDs，Nanjing 210042，China

LIN Tong Tel：025- 85478000，E-mail：ddlin@hotmail.com；

ObjectiveTo investigate whether continuous mild high temperature (increased temperature without causing significant damage to host cells) can inhibit the biofilm formation ofAspergillusniger(A.niger) and its vitality.MethodsA.nigerbiofilms were formed on a coverslip in 24-well tissue culture plate and were checked at the time points 4，8，10，16，24，48 and 72 hours.Confocal laser scanning microscopy (CLSM) was used to image and quantifyA.nigerbiofilm formation under three different continuous mild high temperatures at 37℃，39℃，and 41℃.Furthermore，2，3-bis(2-methoxy- 4-nitro- 5-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium- 5-carboxanilide (XTT) assay was used to quantify the dynamic growth ofA.nigerbiofilm under the above conditions.ResultsCompared with the culture condition 37℃，CLSM analysis at 39℃ or 41℃ showed that higher temperature induced later germination at 4 hours (t=8.603，P=0.047；t=14.550，P=0.008)，poorer hyphal elongation at 8 hours(t=35.118，P=0.039；t=63.450，P=0.006)，poorer polar growth，and reduced biofilm thickness from 10 to 24 hours.The XTT assay showed that higher temperature (39℃ or 41℃) lead to lower vitality at 10 hours，higher vitality at 16 hours，but finally lower vitality from 24 to 72 hours (t=24.262，P=0.038；t=7.556，P=0.031).ConclusionContinuous mild high temperature may have a negative regulatory effect on biofilm formation ofA.nigerand its vitality.

Aspergillusniger；biofilm；continuous mild high temperature

ActaAcadMedSin，2017,39(6)：762-767

國家自然科學(xué)基金(81502739、81371750)、江蘇省自然科學(xué)基金(BK20150068)、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院青年基金(3332016108)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項目(CIFMS- 2017-I2M- 1- 017)和973項目(2013CB531605)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81502739，81371750)，Jiangsu Nature Sciences Foundation (BK20150068)，PUMC Youth Fund (3332016108)，CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS- 2017-I2M- 1- 017)，and Program 973 (2013CB531605)

林 彤 電話：025- 85478000，電子郵件：ddlin@hotmail.com；

李 岷 電話：025- 85478151，電子郵件：drlimin@sina.cn

R379.6

A

1000- 503X(2017)06- 0762- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.06.005

LI Min Tel：025- 85478151，E-mail：drlimin@sina.cn

2017- 03- 10)