多發(fā)性骨髓瘤患者血清miR-193b表達(dá)變化及臨床意義

蘇建友，趙虬旻，申嫻娟，鞠少卿

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

·臨床研究·

多發(fā)性骨髓瘤患者血清miR-193b表達(dá)變化及臨床意義

蘇建友，趙虬旻，申嫻娟，鞠少卿

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

目的探討多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者血清miR-193b表達(dá)變化及臨床意義。方法選取MM患者42例(MM組)，其中IgG型16例、IgA型9例、其他17例，體檢健康者35例(對(duì)照組)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測(cè)血清miR-193b相對(duì)表達(dá)量；采用Spearman相關(guān)分析法分析MM患者血清miR-193b表達(dá)與β2微球蛋白(β2M)、輕鏈κ、輕鏈λ和乳酸脫氫酶(LDH)水平的關(guān)系；采用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)MM的診斷效能。結(jié)果MM組和對(duì)照組血清miR-193b相對(duì)表達(dá)量分別為6.904±2.782、4.454±2.553，組間比較P<0.01。IgG型MM患者血清miR-193b相對(duì)表達(dá)量為8.001±2.479，IgA型為5.268±1.849，其他為6.396±3.132；IgG型高于IgA型(P<0.01)，其余各型比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。MM患者血清miR-193b表達(dá)與血清β2M、輕鏈κ、輕鏈λ和LDH水平均無(wú)相關(guān)性(P均>0.05)。血清miR-193b診斷MM的敏感性、準(zhǔn)確性均高于輕鏈κ、輕鏈λ、β2M和LDH，血清miR-193b聯(lián)合輕鏈κ、輕鏈λ、β2M或LDH診斷MM的敏感性、準(zhǔn)確性均高于各單項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)論MM患者血清miR-193b表達(dá)上調(diào);檢測(cè)血清miR-193b表達(dá)變化可用于MM的輔助診斷及臨床分型。

多發(fā)性骨髓瘤；微小RNA-193b；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；受試者工作特征曲線

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是以骨髓中漿細(xì)胞克隆性增殖并分泌大量單克隆免疫球蛋白為特征的惡性血液疾病[1]，其發(fā)病率約占惡性血液系統(tǒng)腫瘤的13%[2]，患者5年生存率低[3]。MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22 nt的非編碼小RNA，通過(guò)抑制或降解特定靶基因mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在腫瘤中常發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥等行為[4,5]；其可作為新的生物標(biāo)志物，用于疾病的診斷及患者預(yù)后判斷[6～9]。研究發(fā)現(xiàn)，MM發(fā)生、發(fā)展的不同階段均伴隨miRNA表達(dá)變化[10]；miRNA亦可通過(guò)調(diào)控抑癌基因或促凋亡基因表達(dá)而影響MM的病理進(jìn)程[11]。但目前關(guān)于miR-193b與MM發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚未明確。為此我們進(jìn)行本研究，現(xiàn)將研究過(guò)程及結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年6月～2016年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院收治的MM初診患者42例(MM組)，均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第2版中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]?；颊吣?2例、女20例，年齡(60±11)歲，IgG型16例、IgA型9例、其他17例，血清輕鏈κ為(1 209.0±728.1)mg/mL、輕鏈λ為(1 290.0±876.1)mg/mL、β2微球蛋白(β2M)為(2.4±1.4)μg/mL、乳酸脫氫酶(LDH)為(179.0±84.3)U/L。選取同期體檢健康者35例(對(duì)照組)，男20例、女15例，年齡(58±9)歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 血清miR-193b水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法。采用帶有分離膠的真空采集管收集兩組血液標(biāo)本，1 000 r/min離心10 min，將上層血清分裝于無(wú)酶離心管中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用RNA提取試劑盒(美國(guó)Life公司)提取血清總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量濃度和純度合格后，保存于-80 ℃冰箱。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA。收集逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，采用SYBR GreenⅠ混合液(德國(guó)羅氏公司)和7500實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。miR-193b引物序列：正向：5′-ACACTCCAGCTGGGAACTGGCCCTCAAAGT-3′； 反向：5′-TGGTGTC-GTGGAGTCG-3′。U6(內(nèi)參)引物序列：正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向： 5′-AACGCTTCAC-GAATTTGCGT-3′。反應(yīng)體系：SYBR Green Ⅰ 混合液 10 μL，互補(bǔ)DNA 6 μL，正反向引物各1 μL，無(wú)RNA酶水2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、58 ℃ 31 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取其均值。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-193b相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-193b表達(dá)比較 MM組和對(duì)照組血清miR-193b相對(duì)表達(dá)量分別為6.904±2.782、4.454±2.553，組間比較P<0.01。IgG型MM患者血清miR-193b相對(duì)表達(dá)量為8.001±2.479，IgA型為5.268±1.849，其他為6.396±3.132；IgG型高于IgA型(P<0.01)，其余各型比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 MM患者血清miR-193b表達(dá)與β2M、輕鏈κ、輕鏈λ和LDH水平的關(guān)系 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MM患者血清miR-193b表達(dá)與血清β2M、輕鏈κ、輕鏈λ和LDH水平均不相關(guān)(P均>0.05)。

2.3 各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)MM的診斷效能 ROC曲線結(jié)果顯示，血清miR-193b診斷MM的敏感性、準(zhǔn)確性均高于輕鏈κ、輕鏈λ、β2M和LDH，血清miR-193b聯(lián)合輕鏈κ、輕鏈λ、β2M或LDH診斷MM的敏感性、準(zhǔn)確性均高于各單項(xiàng)指標(biāo)，但血清miR-193b單項(xiàng)或聯(lián)合診斷的特異性低于輕鏈κ、輕鏈λ、β2M或LDH。

表1 各指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)MM的診斷效能(%)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA除了通過(guò)改變自身表達(dá)水平參與MM的發(fā)生、發(fā)展外，還可通過(guò)調(diào)控抑癌基因或促凋亡基因表達(dá)影響MM的病理進(jìn)程[15]。本課題組前期通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)MM患者和健康對(duì)照者骨髓miRNA表達(dá)水平進(jìn)行高通量分析。結(jié)果顯示，相對(duì)于健康對(duì)照者，MM患者骨髓中有54種miRNA高表達(dá)，28種miRNA低表達(dá)。根據(jù)miRNA表達(dá)差異的倍數(shù)和P<0.05原則，選取了miR-193b作為本研究目標(biāo)因子。miR-193b編碼基因位于人16p13.12，是一種非編碼的小分子，與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、血管形成及患者預(yù)后等多種生物學(xué)行為相關(guān)[14]。研究表明，miR-17-92簇的表達(dá)和調(diào)節(jié)與Myc基因相關(guān)，沉默Myc基因可誘導(dǎo)MM細(xì)胞死亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增加前凋亡蛋白Bim表達(dá)，且miR-17-92簇表達(dá)改變與MM患者預(yù)后相關(guān)[13]。但由于其靶基因眾多，在不同類(lèi)型腫瘤中miR-193b的確切生物學(xué)作用及調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究我們采用qRT-PCR法檢測(cè)血清miR-193b，結(jié)果顯示，MM患者血清miR-193b相對(duì)表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照者，提示miR-193b在MM中可能發(fā)揮癌基因作用，可能用于MM的輔助診斷和疾病監(jiān)測(cè)。IgG型與IgA型MM患者血清miR-193b相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示檢測(cè)miR-193b水平可在一定程度上協(xié)助判斷IgG、IgA分型。血清輕鏈λ、輕鏈κ、β2M水平與MM患者腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)，血清LDH水平反映腫瘤細(xì)胞增殖活性，上述指標(biāo)對(duì)腫瘤療效及患者預(yù)后判斷均具有重要價(jià)值。但本研究MM患者血清miR-193b相對(duì)表達(dá)量與血清LDH、β2M、輕鏈λ和輕鏈κ水平均不相關(guān)，可能與標(biāo)本量較小，未將MM患者按病情分級(jí)有關(guān)。

本研究ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-193b診斷MM的敏感性、準(zhǔn)確性均高于血清輕鏈κ、輕鏈λ、β2M和LDH；血清miR-193b聯(lián)合輕鏈κ、輕鏈λ、β2M或LDH診斷MM的敏感性、準(zhǔn)確性均高于各單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，其中miR-193b和輕鏈λ聯(lián)合檢測(cè)的診斷敏感性和準(zhǔn)確性最高。提示血清miR-193b可能在MM的輔助診斷方面發(fā)揮一定作用，與輕鏈λ等指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合時(shí)其診斷敏感性、準(zhǔn)確性均提高。但血清miR-193b單項(xiàng)或聯(lián)合診斷的特異性低于輕鏈κ、輕鏈λ、β2M或LDH，后期仍需擴(kuò)大樣本量來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，MM患者血清miR-193b表達(dá)上調(diào)，檢測(cè)血清miR-193b表達(dá)變化可用于MM的輔助診斷及臨床分型。

[1] Campo S, Allegra A, D′Ascola A, et al. MiRNome expression is deregulated in the peripheral lymphoid compartment of multiple myeloma[J]. Br J Haematol, 2014,165(6):801-813.

[2] Peller PJ. Multiple myeloma[J]. PET Clin, 2015,10(2):227-241.

[3] Kyle RA, Rajkumar SV. Criiteria for diagnosis, staging, risk stratification and response assessment of multiple myeloma[J]. Leukemia, 2009,23(1):3-9.

[4] Scholer N, Langer C, Dohner H, et al. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature[J]. Exp Hematol, 2010,38(12):1126-1130.

[5] Yang Y, Lin J, Ma Z, et al. Potential roles of microRNAs and their target genes in human multiple myeloma[J]. Eur J Haematol, 2017,99(2):178-185.

[6] Sandhu S, Garzon R. Potential applications of microRNAs in cancer diagnosis, prognosis, and treatment[J]. Semin Oncol, 2011,38(6):781-787.

[7] Hajizamani S, Shahjahani M, Shahrabi S, et al. MicroRNAs as prognostic biomarker and relapse indicator in leukemia[J]. Clin Transl Oncol, 2017,19(8):951-960.

[8] 賈磊,李兆鳳.miRNA及其臨床作用的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2012,52(15):89-91.

[9] 呂麗霞,薛靜.miRNA作為腫瘤治療靶點(diǎn)的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2014,54(40):105-108.

[10] Pichiorri F, Suh SS, Ladetto M, et al. MicroRNAs regulate critical genes associated with multiple myeloma pathogenesis [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(35):12885-12890.

[11] Chen L, Li C, Zhang R, et al. miR-17-92 cluster microRNAs confers tumorigenicity in multiple myeloma[J]. Cancer Lett, 2011,309(1):62-70.

[12] 張之南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1998:33-380.

[13] Zhou X, Jeker LT, Fife BT, et al. Selective mRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity[J]. J Exp Med, 2008,205(9):1983-1991.

[14] Cismasiu VB, Radu E, Popescu LM. miR-193 expression differentiates telocytes from other stromal cells[J]. J Cell Mol Med, 2011,5(5):1071-1074.

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81672099)；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)(BE2015654)；江蘇省“科教強(qiáng)衛(wèi)”工程青年醫(yī)學(xué)人才項(xiàng)目(QNRC2016695)；南通市民生科技創(chuàng)新和示范推廣計(jì)劃項(xiàng)目(MS120170008-6)。

鞠少卿(E-mail: jsq814@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.015

R733.3

B

1002-266X(2017)48-0046-03

2017-07-19)