辛伐他汀調(diào)控RhoA對血管平滑肌細胞增殖與遷移及纖溶活性的影響

黃紀衛(wèi)，覃數(shù),張冬穎

(1．自貢市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，四川 自貢 643000；2．重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400016)

辛伐他汀調(diào)控RhoA對血管平滑肌細胞增殖與遷移及纖溶活性的影響

黃紀衛(wèi)1，覃數(shù)2,張冬穎2

(1．自貢市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，四川 自貢 643000；2．重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400016)

目的探討不同濃度辛伐他汀調(diào)控小G 蛋白RhoA及下游激酶ROCK信號對人主動脈血管平滑肌細胞(HAVSMCs)增殖和遷移，以及組織纖溶酶原激活物( t-PA)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)表達的影響及作用機制。方法應用不同濃度Simvastatin(0.1 μmol /L、1 μmol /L、10 μmol /L)處理HAVSMCs，CCK-8法和“劃痕實驗”分別檢查細胞增殖和遷移能力，RT-qPCR檢測RhoA mRNA及下游ROCK mRNA表達，應用RT-qPCR和ELISA檢測纖溶活性相關(guān) t-PA/PAI-1 mRNA及蛋白活性變化。結(jié)果辛伐他汀呈濃度依賴性顯著抑制HUASMCs的增殖和遷移能力。辛伐他汀能夠顯著抑制RhoA/ ROCK信號途徑，誘導PAI-1 mRNA表達下調(diào)從而抑制蛋白分泌表達，同時上調(diào)t-PA mRNA表達從而增加蛋白分泌表達，以10 μmol/L辛伐他汀組處理24 h效果最為顯著。結(jié)論辛伐他汀呈濃度時間依賴性抑制RhoA/ ROCK信號途徑，并且上調(diào)tPA以及下調(diào)PAI-1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達，從而促進纖溶，抑制細胞增殖和遷移。

辛伐他??；人血管平滑肌細胞；小G 蛋白RhoA及下游激酶ROCK；組織纖溶酶原激活物和纖溶酶原激活物抑制劑-1；細胞增殖和遷移

血管平滑肌細胞(human vascular smooth muscle cell,VSMCs)的激活、增殖、遷移和轉(zhuǎn)化是諸如冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等心血管病的關(guān)鍵性起始步驟，也是導致經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)術(shù)后再狹窄最重要的病理生理機制[1-2]。研究表明，VSMCs的增殖和遷移可促進PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生，并且與心血管病病變部位多種細胞因子的分泌及相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[1-2]。因此，研究VSMCs 增殖和遷移調(diào)節(jié)的機制, 對上述疾病的防治具有重要意義。

辛伐他汀是一類競爭性抑制膽固醇合成的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A抑制劑，是臨床治療高膽固醇血癥的首選藥物之一[3-4]。辛伐他汀除傳統(tǒng)的調(diào)脂作用外，還可抑制血管細胞增殖和遷移[3-4]。小G蛋白Rho GTP激酶家族成員RhoA 及其激酶ROCK在調(diào)節(jié)心血管結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要的作用，參與調(diào)控血管細胞的收縮運動和黏附遷移等功能[5]。PAI-1是調(diào)節(jié)纖溶活性的重要因子，是體內(nèi)主要的抗纖溶、促凝血因素，生理條件下是組織型(t-PA)纖溶酶原激活物的特異性抑制物[5-6]。研究顯示，PAI-1水平升高和t-PA活性降低與心血管發(fā)生密切相關(guān)[5-6]。

近年研究[3-4,7-9]表明，他汀類藥物能夠抑制RhoA/ROCK信號途徑，并且參與調(diào)節(jié)體內(nèi)纖溶系統(tǒng)，從而影響細胞增殖和遷移能力，然而具體分子調(diào)控機制仍不清楚。本研究組前期研究成功建立大鼠心肌梗死模型， Western Blot實驗結(jié)果表明辛伐他汀能夠通過抑制RhoA及其激酶ROCK蛋白信號途徑，從而在心肌細胞結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用[8-9]。本研究旨在觀察不同濃度辛伐他汀對VSMCs細胞增殖和遷移的影響，以及辛伐他汀調(diào)節(jié)RhoA及ROCK活性對纖溶系統(tǒng)PAI-1、t-PA表達的影響，初步探討辛伐他汀調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞功能變化的分子作用機制，為辛伐他汀防治高血壓、動脈粥樣硬化和術(shù)后再狹窄等心血管病提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人主動脈血管平滑肌細胞(human aortic vascular smooth-muscle cells,HAVSMCs)(ATCC)；DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰酶(HyClone公司)；Trizol試劑、PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 和SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNase H Plus) 試劑盒(TaKaRa)；DNA ladder marker、2×Taq PCR Master Mix、E. coli poly (A) polymerase、rATP(NEB)、青霉素、鏈霉素等(北京天根生化科技公司)；t-PA、PAI-1 ELISA試劑盒(美國R&D Systems公司)；CCK-8試劑盒(上海同仁化學研究所)；其它試劑為進口產(chǎn)品或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。ABI Prism7500實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；全自動酶標儀(美國BIO-RAD公司)；Gel DocXR 凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；高速冷凍離心機(Eppendorf Centrifuge 5804R)；超凈工作臺(SW-CJ)；-80 ℃超低溫冰箱(Thermo)；ND-1 000微量紫外可見分光光度計(美國NanoDrop公司)。吸頭、離心管等經(jīng)0.1% DEPC-H2O 浸泡24 h后，高溫高壓滅菌、50 ℃烘干備用。辛伐他汀原藥(美國Merck Sharp & Dohme公司)。RT-qPCR引物由Invitrogen公司合成(表1)。

1.2 方法

1.2.1 HAVSMCs的培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基(1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)HAVSMCs，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取5～9代對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 辛伐他汀配制 稱取定量辛伐他汀4.325 9 mg，溶于100 μL無水乙醇，再加入150 μL 0.1 mol /L NaOH，50 ℃孵育2 h，然后用0.1 mol /L HCl 調(diào)pH 值至7.2，加雙蒸水至10 mL，即制得終濃度為1 mmol /L的儲存液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后分裝，4 ℃保存，備用。實驗時分別將辛伐他汀儲存液調(diào)整濃度至0.1 μmol /L、1 μmol /L、10 μmol /L。

1.2.3 細胞活力鑒定 將HAVSMCs(1×104個/mL)接種于96孔板，待生長至80%匯合時，分別加入終濃度為0 μmol /L、0.1 μmol /L、1 μmol /L、10 μmol /L的辛伐他汀溶液共孵育72 h。臺盼藍染色計數(shù)活細胞，所選各濃度辛伐他汀溶液對HAVSMCs生長均無毒性反應，細胞拒染率達95%以上。

1.2.4 細胞增殖測定 HAVSMCs(1×105個/mL)接種于96孔板，待其基本達80%融合時更換無血清DMEM培養(yǎng)24 h，再分別加入終濃度為0 μmol /L、0.1 μmol /L、1 μmol /L、10 μmol /L辛伐他汀溶液處理24 h，隨后分別加入10 μL/孔的CCK-8試劑37 ℃孵育1 h，全自動酶標儀測定450 nm波長處的OD值，每組平行6次測定并計算均值，統(tǒng)計學分析比較細胞增殖變化情況。

1.2.5 細胞遷移測定 HAVSMCs(1×105個/mL)接種于6孔板，設置5個復孔，待細胞80%融合后，應用“劃痕法”于倒置顯微鏡下用無菌移液器槍頭進行細胞表面劃痕，清洗懸浮細胞后更換低血清培養(yǎng)基，再分別加入終濃度為0 μmol /L、0.1 μmol /L、1 μmol /L、10 μmol /L辛伐他汀溶液處理，于處理0 h、12 h、24 h時，倒置顯微鏡下觀察拍照，使用Image J 軟件統(tǒng)計分析細胞遷移距離。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測RhoA/ ROCK以及t-PA/PAI-1的mRNA表達 利用Trizol試劑盒提取各組細胞總RNA，測定A260/A280值，計算RNA純度及含量，實驗重復3次。隨后應用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)制備cDNA模板。應用SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNase H Plus)進行qPCR檢測。以18S rRNA為內(nèi)參，分別檢測RhoA、 ROCK、t-PA、PAI-1基因轉(zhuǎn)錄活性。qPCR擴展條件為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，54 ～ 58 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，共進行38個循環(huán)，60～95 ℃繪制融解曲線。應用2-△△CT法計算相對表達量，設置重復各3次，引物見表1。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測t-PA/PAI-1蛋白表達 收集各組細胞處理上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行t-PA/PAI-1蛋白活性測定。每個樣品均設置5個復孔，最后記錄490 nm 的OD值，用于繪制標準曲線和計算待測樣品水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

表1 實驗引物

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀對HAVSMCs增殖的影響

應用 “CCK-8法”分析HAVSMCs的細胞增殖能力，結(jié)果顯示與對照組比較辛伐他汀可導致HAVSMCs增殖能力顯著降低，并且呈藥物濃度依賴性，其中10 μmol /L辛伐他汀處理效果最佳，降低約55.94%(P<0.05)。提示辛伐他汀呈濃度依賴性抑制HAVSMCs增殖活力。見圖1。

2.2 辛伐他汀對HAVSMCs遷移的影響

應用“劃痕實驗”分析HAVSMCs的遷移能力，結(jié)果顯示與對照組比較，辛伐他汀明顯抑制HAVSMCs遷移距離(P<0.05)，并且呈濃度依賴關(guān)系，其中10 μmol/L辛伐他汀處理效果最佳，抑制率高達約48.19%。提示辛伐他汀呈濃度依賴性抑制HAVSMCs遷移活力。見圖2。

2.3 辛伐他汀對HAVSMCs中RhoA/ ROCK以及t-PA /PAI-1 mRNA表達的影響

應用篩選出的最佳處理效果濃度10 μmol /L辛伐他汀分別處理HAVSMCs 0 h、12 h、24 h，48 h后收集細胞并提取總RNA。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄制備各組cDNA模板后RT-qPCR結(jié)果表明，與對照組(0 h)比較，隨著給藥時間的增加，辛伐他汀明顯抑制HAVSMCs中RhoA、ROCK以及下游PAI-1 mRNA的表達，并且抑制作用逐漸增強趨勢，相反的，t-PA mRNA表達水平則逐漸升高，其中以10 μmol /L辛伐他汀處理24 h后作用最為顯著，各組mRNA表達水平升高或降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 辛伐他汀對HAVSMCs分泌 t-PA /PAI-1表達的影響

ELISA蛋白表達水平檢測結(jié)果進一步證實，辛伐他汀能夠?qū)е翲AVSMCs分泌t-PA蛋白表達顯著增加，PAI-1蛋白表達顯著減少，并且其中10 μmol/L辛伐他汀處理24 h后t-PA /PAI-11蛋白表達變化差異最顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

研究表明，t-PA/PAI-1與冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病率和致死率密切相關(guān)， PAI-1水平升高更冠心病等血管栓塞性疾病的獨立危險因子[10]。PAI-1作為絲氨酸蛋白酶抑制物超家族的一個成員(Serpin E1)，是體內(nèi)主要的抗纖溶、促凝血因素，也是調(diào)節(jié)纖溶活性的重要因子，生理條件下是組織型(t-PA)纖溶酶原激活物的特異性抑制物[5-6, 10]。纖溶活性主要由t-PA和PAI-1決定，t-PA和PAI-1相互制約調(diào)節(jié)和動態(tài)平衡維護了體內(nèi)外正常纖溶活性[6,10]。他汀類藥物作為一類傳統(tǒng)調(diào)脂藥物，目前已被廣泛應用于心血管的防治。研究表明，他汀藥物能夠抑制多種血管細胞以及脂肪細胞、單核細胞的生長、增殖、遷移和轉(zhuǎn)化。糖尿病、冠心病等血管栓塞性疾病以及脂質(zhì)紊亂患者使用他汀治療都伴隨著患者纖溶系統(tǒng)的改善[7-9,11-13]。

辛伐他汀可對競爭性抑制膽固醇合成的甲羥戊酸途徑，除傳統(tǒng)的調(diào)脂作用外，辛伐他汀的血管保護、穩(wěn)定斑塊和抗炎等作用已被逐漸揭示，最近研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀還參與調(diào)節(jié)血管細胞增殖和遷移，保護纖溶功能紊亂，調(diào)節(jié)血管細胞分泌細胞因子等功能[7-9,11-13]。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能夠通過抑制RhoA 及其激酶ROCK蛋白信號途徑，從而在心肌細胞結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用[8-9]。本實驗進一步采用不同濃度辛伐他汀干預HUASMCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)辛伐他汀呈濃度時間依賴性抑制明顯抑制RhoA/ROCK信號途徑，并誘導PAI-1 mRNA表達下調(diào)進而抑制PAI-1蛋白分泌，同時上調(diào)t-PA mRNA表達進而增加t-PA蛋白分泌，其中以10 μmol/L辛伐他汀處理24 h效果最為顯著。

ROCK是RhoA下游的效應分子之一[8-9]。研究表明，RhoA/ROCK信號通路能夠調(diào)節(jié)VSMCs的收縮、增殖、遷移，以及調(diào)控VSMCs細胞內(nèi)部分重要功能因子表達，從而在心肌肥厚、心臟重構(gòu)中起著重要作用。Lee等[14]研究揭示G12/13蛋白激活RhoA/ROCK信號通路，進而激活下游PAI-1表達，調(diào)控纖溶平衡。綜合提示辛伐他汀的血管保護以及纖溶活性改善作用，可能是通過抑制類異戊二烯及其轉(zhuǎn)化Rho的主要底物合成，進而抑制RhoA/ ROCK通路激活[15]，導致下游PAI-1激活收到抑制，從而抑制下游PAI-1 mRNA 表達和蛋白的產(chǎn)生與釋放，增加t-PA mRNA 表達及其蛋白表達。

VSMCs 的增殖和遷移是心血管類疾病事件的關(guān)鍵性起始步驟，是PCI術(shù)后再狹窄極其重要的病理生理機制[1-2]。已有研究表明，RhoA/Rho 激酶途徑及其下游PAI-1表達在調(diào)節(jié)VSMCs的表型轉(zhuǎn)化以及細胞增殖和遷移活力中發(fā)揮著重要的作用[6]。本實驗結(jié)果顯示辛伐他汀呈濃度依賴性顯著抑制HUASMCs的增殖和遷移活力，推測辛伐他汀對VSMCs增殖與遷移活力的抑制作用可能是通過抑制RhoA/ ROCK通路，從而調(diào)節(jié)下游t-PA /PAI-1 mRNA表達水平及蛋白表達，進而調(diào)節(jié)纖溶活性，抑制VSMCs細胞增殖和遷移。

研究表明，降低患者高水平PAI-1 在血栓性疾病診治及預后中起著重要作用[15]。臨床合理藥物干預有效抑制VSMCs細胞增殖和遷移是防治冠心病、動脈粥樣硬化性內(nèi)膜增生的重要機制之一[16]。本研究結(jié)果表明，在體外辛伐他汀可呈濃度時間依賴性顯著改善纖溶活性，抑制VSMCs增殖和遷移，可為臨床防治高血壓、動脈粥樣硬化和術(shù)后再狹窄等心血管類疾病提供一定的理論及實踐依據(jù)。有關(guān)辛伐他汀體內(nèi)與體外具體分子作用機制及調(diào)控細節(jié)仍有待進一步深入研究。

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EffectsofsimvastatinoncellproliferationandmigrationabilityofHAVSMCsbyregulatingRhoA-inducedfibrinolysis

HUANG Ji-wei1,QIN Shu2,ZHANG Dong-ying2

(DepartmentofCardiology,1.TheFirstPeople’sHospitalofZigong,Zigong643000,Sichuan;2.TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective：To investigate the effect and mechanism of different concentrations of simvastatin on the proliferation and migration of human vascular smooth muscle cells (HAVSMCs) by regulating RhoA/ROCK-induced expression changes of fibrinolytic activity (t-PA/PAI-1).MethodsCultured HAVSMCs were treated with different concentrations of simvastatin (0.1μmol /L、1μmol /L、10 μmol /L),and then cell proliferation and cell migration were measured by CCK-8 assay and wound healing test.The expression levels of RhoA/ROCK,t-PA/PAI-1 mRNA or protein activity were detected by RT-qPCR and ELISA.ResultsThe proliferation and cell migration of HAVSMCs were dramatically inhibited by simvastatin in a dose-dependent manner.After HAVSMCs were treated with 10 μmol /L simvastatin for 24 h,simvastatin could significantly inhibit the RhoA/ ROCK signalling pathway and induce efficient inhibition of PAI-1 mRNA and protein production levels and the promotion of t-PA mRNA and protein production levels.ConclusionSimvastatin can significantly promote fibrinolytic activity and inhibit the proliferation and cell migration of HAVSMCs through the inhibition of the RhoA/ ROCK signalling pathway,thereby suppressing PAI-1 mRNA and protein levels and increasing t-PA mRNA and protein levels.

Simvastatin;HAVSMCs;RhoA/ ROCK signalling pathway;t-PA/PAI-1;Cell proliferation and cell migration

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.06.002

重慶市自然科學基金[渝發(fā)科技字(2004)54號文]

2017-06-12

黃紀衛(wèi)(1982-)，男，主治醫(yī)師。E-mail:zhihuiht2018@126.com.

張冬穎，E-mail:zdy.chris@gmail.com

時間： 2017-12-27 16∶44網(wǎng)絡出版地址http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171227.1643.004.html

1005-3697(2017)06-0816-05

R363；R965

A

(學術(shù)編輯：楊穎)