廣西漢族人群MTHFR和MTRR基因多態(tài)性與深靜脈血栓的研究

胡長付 ，王行海，劉起理 ，郭建剛 ，唐前輝，王澤

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血管外科，廣西 桂林 541000；2.北京石景山醫(yī)院血管外科，北京 100041)

2017年，我國共有2.9億心血管病患者，心腦血管住院費用將超過705億元，平均每5名中國成人就有1例心血管病患者。 城鄉(xiāng)居民疾病死亡構(gòu)成比中，心血管疾病占首位，心腦血管疾病已經(jīng)成為我國公共衛(wèi)生領(lǐng)域，尤其是慢病防控領(lǐng)域的最大挑戰(zhàn)。今年5月，首份科學(xué)、客觀評估中國人群心血管健康狀況《中國心血管健康指數(shù)(2017)》正式發(fā)布，報告指出把握心血管防控的重要因素包括：預(yù)防心血管疾病，減少吸煙、肥胖、污染等危險因素暴露，提高血壓、血脂、血糖篩查，提高公共衛(wèi)生政策與服務(wù)能力，提高醫(yī)療救治能力。同時，還需要來自社會(百姓認知、大眾媒體、公共設(shè)施)和政府(財政投入、政策保障)的共同支持。

2017年的心血管治療領(lǐng)域取得了諸多可能改寫指南的研究結(jié)論。在穩(wěn)定性冠心病治療策略上，COMPASS研究顯示，對于穩(wěn)定性動脈粥樣硬化性血管疾病患者，應(yīng)用超低劑量利伐沙班聯(lián)合阿司匹林治療，盡管出血風(fēng)險有所增加，但仍可產(chǎn)生顯著心腦血管獲益；FAME 2研究結(jié)果證實，成本效益相當(dāng)?shù)那闆r下，對于穩(wěn)定性冠心病患者，冠狀動脈血流儲備分?jǐn)?shù)(FFR)指導(dǎo)下行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)可顯著改善患者預(yù)后，減少不良事件發(fā)生。在ST段抬高的急性心肌梗死(STEMI)患者，DAPT STEMI研究顯示，在考慮了安全性、有效性和出血風(fēng)險后，應(yīng)用新一代藥物洗脫支架直接PCI的無事件的STEMI患者雙聯(lián)抗血小板藥物(DAPT)治療6個月不低于12個月； CAMPARE-ACUTE研究提出，STEMI患者行PCI后同期行完全血運重建安全可行，采用FFR指導(dǎo)的同期處理非罪犯血管，不良事件發(fā)生率更低。對于生物可降解支架的獲益可能并不體現(xiàn)在完全降解之前的短時間內(nèi)，需要長期的隨訪結(jié)果。在血脂領(lǐng)域，F(xiàn)OURIER研究是關(guān)于PCSK9抑制劑的第一項臨床終點研究，新型降脂藥物PCSK9抑制劑降低膽固醇幅度與心血管保護作用的關(guān)系與他汀類藥物幾近完全一致。但是，對于PCSK9抑制劑的安全性問題、個體化差異以及長期治療的持續(xù)獲益問題，仍需進一步的研究證實。房顫治療方面， PREVAIL研究結(jié)果表明，左心耳封堵對非瓣膜性房顫患者的卒中預(yù)防與口服抗凝藥療效相當(dāng)，除了明顯減少大出血，特別是出血性卒中，左心耳封堵組致殘或致死事件也少于華法林組。因此，對于那些無法長期口服抗凝藥的患者，左心耳封堵可以作為非瓣膜性房顫患者卒中預(yù)防的一種合理策略；RE-DUAL PCI研究顯示，相比于經(jīng)典的三聯(lián)抗栓治療，達比加群聯(lián)合一種P2Y12抑制劑的雙聯(lián)抗栓治療策略可有效降低出血風(fēng)險，同時不增加血栓風(fēng)險，顯示了雙聯(lián)療法的臨床凈獲益。在抗血小板和抗凝聯(lián)合方案中，新型抗凝藥物是一個更優(yōu)的選擇。因此，如何將不斷涌現(xiàn)的新觀點、新理念、新技術(shù)與我國國情相結(jié)合，加速推動我國心腦血管疾病事件“拐點”早日到來，是每一位心血管醫(yī)生的責(zé)任與使命。

本期欄目就血栓形成及纖溶、心衰與心絞痛的治療、糖尿病與心功能等心血管熱點問題進行了探討，對心血管疾病的防治提供了有益的參考。

心血管疾病研究專題欄目策劃專家楊穎博士簡介

楊穎，心血管內(nèi)科專業(yè)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。2000年畢業(yè)于川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，2007年、2013年先后在華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院獲得碩士、博士學(xué)位。2013年至2015年在四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)博士后流動站工作?，F(xiàn)為四川省醫(yī)學(xué)會心血管病專業(yè)委員會委員、四川省康復(fù)醫(yī)學(xué)會心血管專業(yè)委員會委員、第十二批四川省衛(wèi)生計生委學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人選。主要從事心血管疾病的臨床診治工作，研究領(lǐng)域為動脈粥樣硬化的流行病學(xué)及發(fā)病機制。近年來，主持國家自然科學(xué)青年基金項目1項及其他10余項國家級及省廳級科研項目，公開發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余篇。

廣西漢族人群MTHFR和MTRR基因多態(tài)性與深靜脈血栓的研究

胡長付1，王行海1，劉起理1，郭建剛1，唐前輝1，王澤2

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血管外科，廣西 桂林 541000；2.北京石景山醫(yī)院血管外科，北京 100041)

目的研究廣西漢族人群MTHFR、MTRR基因多態(tài)性與深靜脈血栓的關(guān)系，為臨床防治提供參考。方法選取90例廣西漢族下肢深靜脈血栓患者作為研究組，另選取同期接受健康體檢的90例廣西漢族正常人員作為對照組，通過等位基因序列的特異性引物相關(guān)聚合酶鏈反應(yīng)多態(tài)性技術(shù)對兩組人員的MTHFR、MTRR基因多態(tài)性進行分析，進而對兩組人員的基因型、等位基因相關(guān)分布頻率進行比較。結(jié)果研究組患者的MTHFR基因677位點的CC、TT、CT基因型及等位基因C、T的分布頻率分別是41.1%、32.2%、26.7%、54.4%、45.6%，與對照組的55.6%、18.9%、25.5%、70.6%、29.4%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而研究組人員的MTRR基因66位點AA、GG、AG基因型及等位基因A、G分布頻率分別是56.7%、18.9%、24.4%、68.9%、31.1%，與對照組的48.9%、14.4%、36.7%、66.7%、33.3%比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論廣西漢族人群的深靜脈血栓形成可能與MTHFR基因677位點的TT基因多態(tài)性存在相關(guān)性，而MTRR基因多態(tài)性與深靜脈血栓發(fā)生可能無相關(guān)性。

廣西漢族人群；亞甲基四氫葉酸還原酶；MTRR基因多態(tài)性；深靜脈血栓；相關(guān)性

深靜脈血栓是一種常見的多發(fā)性下肢靜脈回流障礙性疾病，血流緩慢及靜脈壁受損、血液高凝狀態(tài)時引起深靜脈血栓三大致病因素，若患者不及時接受有效診斷、治療，多數(shù)患者病情惡化成血栓形成后遺癥，對患者生活質(zhì)量造成長期嚴(yán)重影響；部分患者易并發(fā)肺栓塞，危害患者健康及生命安全[1-2]。近年來，隨著醫(yī)學(xué)對深靜脈血栓形成危險因素的深入研究發(fā)現(xiàn)，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因多態(tài)性、MTRR基因多態(tài)性可能與深靜脈血栓形成存在相關(guān)性[3]；若MTHFR、MTRR基因多態(tài)性發(fā)生異常，易造成同型半胱氨酸堆積，并產(chǎn)生高Hcys血癥，增高血漿Hcys水平，導(dǎo)致Hcys與金屬離子作用下進行自身氧化并形成氧自由基、過氧化物，破壞內(nèi)皮細胞功能、結(jié)構(gòu)，增加內(nèi)皮素-1釋放，減少血管內(nèi)皮衍生松弛因子、前列腺素釋放，造成血管舒縮因子相關(guān)平衡紊亂，進而形成血栓[4]。基于此，本研究對廣西漢族人群MTHFR和MTRR基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成相關(guān)性進行分析，為臨床防治提供參考?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月至2016年6月在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院接受診治的90例廣西漢族下肢深靜脈血栓患者作為研究組，所有患者均經(jīng)下肢深靜脈造影、彩超等相關(guān)檢查確診為下肢深靜脈血栓；無精神疾病、意識障礙；無血液系統(tǒng)疾病、急性心肌梗死、肝腎功能不全、急性腦血管事件、惡性腫瘤等情況；排除近期手術(shù)史及外傷史；排除妊娠期、哺乳期女性。其中男性49例，女性41例，年齡30～75歲，平均(48.6±10.3)歲。另選取同期來本院接受健康體檢的90名廣西漢族正常人員作為對照組，排除下肢深靜脈血栓癥病史，經(jīng)體格檢查、詢問病史及實驗室檢查等相關(guān)檢查顯示無異常，無心腦血管疾病[5]；其中男性47名，女性43名，年齡28～75歲，平均(48.3±10.9)歲。兩組在年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA 兩組人員均在空腹?fàn)顟B(tài)下抽取3 mL靜脈血，經(jīng)EDTA-k2抗凝過程后，取淋巴細胞分離液進行分離操作，提取DNA基因組，采用紫外分光光度計對DNA含量進行測量，置于冰箱(-20 ℃)環(huán)境下保存。

1.2.2 設(shè)計引物 提取等位基因，參考NCBI基因庫相關(guān)序列，通過Vector NTI 9.0軟件進行序列設(shè)計。①MTHFR：設(shè)計上游引物1為：5′-GAGAAGGTGTCT-GCGGGAGC-3′，與上游引物2為：5′-GGAGAAGGT-GTCTGCGGGAGT-3′；而下游引物為：5-CGCTGTG-CAAGTTCTGGACC-3′。②MTRR：設(shè)計上游：5′-TTTCATTATCGTTTCCACCG-3′，設(shè)計下游1：5′-GTACCACAGCTTGCCTCACAT-3′，設(shè)計下游2：5′-GTACCACAGCTTGCTCACAC-3′。

1.2.3 制定序列引物聚合酶鏈反應(yīng) ①建立PCR體系：反應(yīng)體系內(nèi)含1 L 10×PCR緩沖液、0.5 L 10 pmol/L引物混合物、0.5 L 1U DNA聚合酶以及1 L 200 mol dNTP，并用10 L滅菌水補足[6]。②PCR的反應(yīng)條件：于PCR儀上進行5 min的95 ℃預(yù)變性，根據(jù)30 s(95 ℃)、50 s(63 ℃)、30 s(72 ℃)進行30個循環(huán)，后4 ℃恒溫[7-8]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基因型分析

MTHFR基因的第677位點多態(tài)性相關(guān)突變位點是rs1801133，而PCR產(chǎn)物片段的大小是277 bp，具體基因型表現(xiàn)為CC型、TT型、CT型，見圖1；MTRR基因的66位點多態(tài)性相關(guān)突變位點是rs1801394，而PCR擴增產(chǎn)物的片段大小是1 050 bp，期基因型表現(xiàn)為AA型、GG型、AG型，見圖2。

2.2 MTHFR、MTRR攜帶頻率

研究組人員基因型TT及等位基因C、T的分布頻率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組人員的基因型CC、CT分布頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組人員MTRR基因的66位點A/G攜帶頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、表2，圖3及圖4。

表1兩組人員MTHFR基因的第677位點C/T攜帶頻率情況[n(%)]

組別基因型頻率分布CCTTCT等位基因頻率分布CT對照組(n=90)50(55．6)17(18．9)23(25．5)127(70．6)53(29．4)研究組(n=90)37(41．1)29(32．2)24(26．7)98(54．4)82(45．6)χ2值3．7604．2050．0299．9679．967P值0．0530．0400．8650．0020．002

表2兩組人員MTRR基因的66位點A/G攜帶頻率情況[n(%)]

組別基因型頻率分布AAGGAG等位基因頻率分布AG對照組(n=90)44(48．9)13(14．4)33(36．7)120(66．7)60(33．3)研究組(n=90)51(56．7)17(18．9)22(24．4)124(68．9)56(31．1)χ2值1．0920．6403．1680．2040．204P值0．2960．4240．0750．6520．652

3 討論

深靜脈血栓屬于常見臨床病癥，多受骨折外傷、遺傳、口服避孕藥及手術(shù)等相關(guān)外在因素影響，其中最為顯著的是遺傳因素，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)深靜脈血栓發(fā)生、發(fā)展過程中具有多種風(fēng)險因子[9]。近年來，隨著臨床醫(yī)學(xué)深入研究深靜脈血栓發(fā)現(xiàn)，凝血因子VG16912A基因多態(tài)性及MTHFR基因C677T多態(tài)性、凝血酶原基因G20210A多態(tài)性和印度人、白種人的深靜脈血栓形成有關(guān)[10]；且MTHFR基因C677T多態(tài)性、MTRR基因A66G凝固可增加兒童同型半胱氨酸、葉酸表達[11]。

目前，臨床醫(yī)學(xué)檢測基因多態(tài)性方法較多，常規(guī)分析基因多態(tài)性多以限制性的片段長度多態(tài)性、聚合酶鏈反應(yīng)寡核苷酸探針雜交PCR-SSO法及聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性法等為主，PCR-RFLP能特異性的對酶切片段進行擴增，但其酶切圖譜較為復(fù)雜[12]；而PCR-SSO具有較高的分辨率，但使用的探針較為昂貴，且臨床操作繁瑣。PCR-SSP通過模板DNA進行設(shè)計，若3′端的堿基無法互補易導(dǎo)致Taq酶延伸作用因3′，若5′-磷酸二酯鍵的形成障礙出現(xiàn)受阻，通過凝膠電泳對HLA等位基因型進行檢測擴增分析[13]。研究表明，和PCR-SSP比較，上述相關(guān)方法對操作技術(shù)的要求較高，且臨床操作較為復(fù)雜，檢測費用昂貴，分型檢測所需時間長，難以在實驗室進行廣泛開展與應(yīng)用。PCR-SSP法存在高分辨率、強特異性，臨床操作簡便及快速，便于推廣應(yīng)用，故本研究應(yīng)用PCR-SSP法對MTHFR、MTRR基因多態(tài)性進行檢測分析[14-15]。

研究表明，MTHFR缺陷易造成Hcys轉(zhuǎn)化成蛋氨酸出現(xiàn)障礙，使Hcys堆積于血液內(nèi)，引發(fā)同性半胱氨酸血癥；而血漿內(nèi)Hcys表達增加，能導(dǎo)致Hcys于金屬離子的介導(dǎo)作用下進行自身氧化形成或氧化物、氧自由基，對人體內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)、功能造成損害，而血管內(nèi)皮細胞受損后，能增加內(nèi)皮素-1釋放，降低前列腺素、內(nèi)皮衍生松弛因子釋放，擾亂血管舒縮因子相關(guān)平衡，進而促使血栓形成，引發(fā)心血管疾病[16]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，人體缺乏葉酸、高同型半胱氨酸血癥為血栓栓塞發(fā)生獨立危險因素；故分析MTHFR基因突變多為引起葉酸表達減少的一種遺傳因素，由此提示MTHFR基因C677T多態(tài)性分布存在一定復(fù)雜性，可能與民族、人種、地理及地域等相關(guān)因素共同影響有關(guān)[17]。MTRR基因主要定位在染色體5p15.2～15.3，而人類編碼序列包含2094堿基對，四氫葉酸水平及保持合理的Hcys濃度具有重要作用；若MTRR出現(xiàn)變異，易導(dǎo)致血漿內(nèi)Hcys濃度增高[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，MTRR基因66A-G多態(tài)性能造成葉酸代謝異常，引發(fā)高同型半胱氨酸血癥，損傷血管內(nèi)皮組織，進而刺激血管平滑肌細胞，造成血管舒縮因子相關(guān)平衡受損，進而形成深靜脈血栓，但有待進一步研究[20]。本研究結(jié)果顯示，研究組人員MTHFR基因型分布頻率、等位基因分布頻率與對照組比較存在差異，但兩組人員的MTRR基因多態(tài)性分析無明顯差異；提示廣西漢族人群的深靜脈血栓形成可能與MTHFR基因677位點的TT基因多態(tài)性存在相關(guān)性，而與MTRR基因多態(tài)性可能無相關(guān)性，分析原因可能與選取樣本量能較少有關(guān)，后面可增加樣本量進行深入性研究。

綜上所述，MTHFR基因677位點的TT基因多態(tài)性可能與廣西漢族人群的深靜脈血栓形成存在相關(guān)性，故TT基因型可能為引發(fā)深靜脈血栓的獨立性危險因子，而MTRR基因多態(tài)性與深靜脈血栓發(fā)生可能無相關(guān)性。

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StudyonMTHFRandMTRRgenepolymorphismanddeepvenousthrombosisinGuangxiHanpopulation

HU Chang-fu1,WANG Xing-hai1,LIU Qi-li1,GUO Jian-gang1,TANG Qian-hui1,WANG Ze2

(DepartmentofVascularSurgery,1.AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege，Guilin541000,Guangxi;2.BeijingShijingshanHospital,Beijing100041,China)

Objective：To study the relationship between MTHFR and MTRR gene polymorphism and deep vein thrombosis in Guangxi Han population,and to provide reference for clinical prevention and treatment.Methods90 cases of patients with deep vein thrombosis of the lower limbs of Guangxi were selected as the study group.In the same period, 90 cases of normal Chinese people in Guangxi were selected as the control group.The MTHFR and MTRR gene polymorphisms of the two groups were analyzed by the specific primer-related polymerase chain reaction polymorphism (PCR),to compare the genotype and allele-related distribution frequency data of the two groups of researchers.ResultsThe frequency of CC,TT,CT genotype and allele C and T of the MTHFR gene in the study group were 41.1%,32.2%,26.7%,54.4% and 45.6%,respectively,compared with 55.6%,18.9%,25.5%,70.6% and 29.4% of the control group (P<0.05).The frequencies of AA,GG,AG genotype and allele A and G were 56.7%,18.9%,24.4%,68.9% and 31.1%,respectively,compared with 48.9%,14.4%,36.7%,66.7% and 33.3% of the control group (P>0.05).ConclusionThe deep vein thrombosis of the Han population in Guangxi may be related to the TT gene polymorphism of the 677 locus of the MTHFR gene,and the MTRR gene polymorphism may not correlate with the occurrence of deep vein thrombosis.

Guangxi Han population;MTHFR;MTRR gene polymorphism;Deep vein thrombosis;Relativity

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.06.001

廣西省桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(20150206-1-9)

2017-07-25

胡長付(1976-)，男，博士，副主任醫(yī)師。E-mail：Huhu661000@163.com

時間： 2017-12-27 16∶44網(wǎng)絡(luò)出版地址http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171227.1643.002.html

1005-3697(2017)06-0812-04

R394.3

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(學(xué)術(shù)編輯：馮超)