線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體在匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)損傷中的作用

王亞麗， 王 翠， 余夢(mèng)嫣， 連亞軍， 謝南昌

線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體在匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)損傷中的作用

王亞麗1， 王 翠2， 余夢(mèng)嫣1， 連亞軍1， 謝南昌1

目的研究線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)在氯化鋰-匹魯卡品(pilocarpine，PILO)癲癇大鼠模型神經(jīng)損傷中的作用。方法將84只雄性SD大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照(CON)組、PILO組(2 h、8 h、24 h和72 h 4個(gè)亞組)、Ru360組和精胺(Spermine)組。觀察各組大鼠行為學(xué)改變，并熒光染色法測(cè)定海馬組織線粒體Ca2+濃度，TUNEL染色檢測(cè)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡，并采用Western Blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Cyt C和caspase-3表達(dá)變化。結(jié)果(1)與CON組比較，PILO組海馬神經(jīng)元線粒體Ca2+濃度明顯升高，凋亡明顯增加(P<0.05)；與CON組比較，PILO組海馬Bax表達(dá)水平、線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活明顯增多，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平明顯減少(P<0.05)。(2)與PILO組比較，Ru360組海馬神經(jīng)元線粒體Ca2+濃度明顯降低，凋亡明顯減少(P<0.05)；與PILO組比較，Ru360組海馬Bax表達(dá)水平、線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活明顯減少，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平明顯增多(P<0.05)。(3)與PILO組比較，Spermine組海馬神經(jīng)元線粒體Ca2+濃度明顯升高，凋亡明顯增加(P<0.05)；與PILO組比較，Spermine組海馬Bax表達(dá)水平、線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活明顯增多，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平明顯減少(P<0.05)。結(jié)論MCU在PILO癲癇大鼠海馬神經(jīng)損傷中發(fā)揮重要作用，抑制MCU可發(fā)揮對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。

癲癇； 線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體； 線粒體鈣離子； 凋亡

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，長(zhǎng)期反復(fù)癲癇發(fā)作嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此明確癲癇的發(fā)病機(jī)制及尋求新的治療靶點(diǎn)具有重要現(xiàn)實(shí)意義[1，2]。近年來(lái)研究表明細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制的失調(diào)在癲癇發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色[3，4]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣貯存庫(kù)，其調(diào)節(jié)的鈣離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)對(duì)細(xì)胞和線粒體均具有重要意義。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)線粒體鈣超載參與癲癇神經(jīng)損傷過(guò)程，且抑制線粒體鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)可以減輕線粒體鈣超載而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5，6]。

近年新鑒定的線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)在線粒體鈣離子攝取中發(fā)揮重要作用[7]，MCU定位于線粒體內(nèi)膜，單體大小為40 kDa，其攝取鈣離子是一個(gè)依賴于線粒體內(nèi)膜電勢(shì)、不需要額外能量、順鈣離子電化學(xué)梯度擴(kuò)散的過(guò)程[8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MCU在心肌及大腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[9～12]，但其在癲癇神經(jīng)損傷中的作用尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)擬采用氯化鋰-匹魯卡品(pilocarpine，PILO)癲癇大鼠模型，應(yīng)用MCU激動(dòng)劑精胺(Spermine)與抑制劑Ru360干預(yù)，觀察其對(duì)癲癇大鼠行為學(xué)及癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)后海馬組織神經(jīng)元凋亡的影響，并進(jìn)一步檢測(cè)大鼠海馬線粒體鈣離子濃度和Bcl-2、Bax、Cyt C及caspase-3等線粒體介導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白，以明確MCU在PILO癲癇大鼠海馬神經(jīng)損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取84只6～8 w的健康雄性SD大鼠[河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2015-0004]，體重250～300 g。飼養(yǎng)溫度18～26 ℃，濕度40%～70%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食水，自然光照射，換氣通風(fēng)。隨機(jī)分為CON組、PILO組、Ru360組、Spermine組4組，其中PILO組又分為SE 2 h、8 h、24 h及72 h 4個(gè)亞組。CON組、Ru360組、Spermine組及PILO各亞組均為12只大鼠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 氯化鋰及匹魯卡品購(gòu)自USA Sigma公司。兔抗大鼠Bax、Bcl-2、Cyt C及cleaved caspase-3多克隆抗體購(gòu)于UK Abcam公司，Ru360、Spermine購(gòu)自USA Santa Cruz公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，全蛋白、線粒體蛋白及胞漿蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。TUNEL試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司。組織線粒體分離試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。鈣離子熒光探針Fluo-3，AM購(gòu)于AAT Bioquest。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型及藥物干預(yù)模型建立 84只SD大鼠均予以氯化鋰(127 mg/kg)腹腔注射預(yù)處理，20 h后予以氫溴酸東莨菪堿(1 mg/kg)腹腔注射，30 min后予PILO(30 mg/kg)腹腔注射，CON組用等體積的0.9%Nacl溶液代替PILO。Ru360組及Spermine組在PILO注射前20 min分別給予Ru360 50 nmol/kg(即27.54 μg/kg)及Spermine 5 mg/kg腹腔注射。在SE 1 h后予以地西泮(10 mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作。

1.2.2 癲癇發(fā)作觀察與判定 采用Racine分級(jí)法[13]評(píng)估各組SD大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，其分為6級(jí)：0 級(jí)～Ⅴ級(jí)。大鼠出現(xiàn)前肢陣攣、后肢直立或跌倒伴全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作等Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作時(shí)造模成功。

1.2.3 取材 CON組、PILO組、Ru360組及Spermine組在注射地西泮后72 h各取6只大鼠，分別予以水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射，麻醉成功后將大鼠仰臥位固定于動(dòng)物解剖操作板，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，輸液針穿刺進(jìn)左心室，固定針避免滑動(dòng)，剪開(kāi)右心耳，先灌注200～250 ml的0.9%Nacl溶液，然后緩慢灌注200～250 ml的4%多聚甲醛。灌注成功后開(kāi)顱取腦，使用4%多聚甲醛浸泡固定，在4 ℃冰箱放置24 h后用于TUNEL染色。PILO組各亞組分別在注射地西泮后2 h、8 h、24 h及72 h 各取6只大鼠，Ru360組、Spermine組及CON組在注射地西泮24 h后各取6只大鼠，予以水合氯醛(300 mg/kg)麻醉處死，快速剝?nèi)∧X組織，冰上分離雙側(cè)海馬，凍存于液氮用于線粒體Ca2+濃度檢測(cè)及Western Blot檢測(cè)。

1.2.4 線粒體Ca2+濃度檢測(cè) 采用差速離心法提取海馬組織線粒體。取出海馬組織，玻璃勻漿器勻漿，按組織線粒體分離試劑盒說(shuō)明提取線粒體，冰上操作完成。用線粒體保存液混懸所得線粒體，用 BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定線粒體蛋白濃度。

采用熒光染色法測(cè)定線粒體Ca2+濃度。用D-Hank’s液將線粒體沖洗3次，加入探針Fluo-3，AM后放入37 ℃孵育箱孵育30 min，D-Hank’s液沖洗掉多余探針溶劑，于37 ℃孵育30 min。使用多功能酶標(biāo)分析儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為506 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為526 nm，整個(gè)過(guò)程避光。

1.2.5 TUNEL檢測(cè) 取出固定后的大腦，于視交叉和視乳頭間切取約3 mm厚的海馬組織，進(jìn)行脫水及石蠟包埋，以每層10 μm的厚度連續(xù)冠狀切片。按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，顯微鏡下觀察海馬CA3區(qū)的細(xì)胞凋亡。

1.2.6 Western Blot檢測(cè) 取出各組凍存的海馬組織，分別提取全蛋白、胞漿蛋白和線粒體蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂奶粉封閉2 h。洗膜3次后一抗孵育，兔抗大鼠Cty C(線粒體蛋白、胞漿蛋白，按1∶1000稀釋)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、cleaved caspase-3(1∶500)多克隆抗體，4 ℃冰箱過(guò)夜。洗膜3次后加入二抗山羊抗兔IgG(1∶8000)，室溫孵育1.5 h，洗膜3次，顯影成像。凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶光密度，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量用目的蛋白與內(nèi)參(Cox-Ⅳ、Actin)條帶光密度的比值來(lái)表示。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)觀察 CON組大鼠行為無(wú)異常，PILO組、Ru360組及Spermine組大鼠在腹腔注射氯化鋰后的20 h，均無(wú)行為學(xué)異常。注射PILO后3組大鼠均出現(xiàn)重復(fù)刻板動(dòng)作、毛發(fā)豎立等周圍膽堿能反應(yīng)，3組大鼠均在5～30 min后出現(xiàn)Racine Ⅰ級(jí)發(fā)作，11～60 min后出現(xiàn)Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí)發(fā)作，并出現(xiàn)SE。3組大鼠發(fā)作潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 各組致癇發(fā)作潛伏期比較

注：其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05

2.2 各組大鼠海馬組織中線粒體Ca2+濃度 與CON組對(duì)比，PILO癲癇大鼠海馬線粒體Ca2+濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與PILO組對(duì)比，Ru360顯著降低海馬線粒體Ca2+濃度，而Spermine顯著升高海馬線粒體Ca2+濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

2.3 TUNEL法檢測(cè)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡 CON組僅見(jiàn)1～2個(gè)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，而PILO組可見(jiàn)大量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。與PILO組比較，Ru360顯著減少癲癇誘發(fā)的海馬神經(jīng)元凋亡，Spermine則顯著增加癲癇誘發(fā)的海馬神經(jīng)元凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖2、表2)。

表2 各組海馬CA3區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)

與CON組比較*P<0.05；與PILO組比較#P<0.05

2.4 各組大鼠海馬組織中Bax和Bcl-2表達(dá)變化 與CON組比較，PILO組海馬Bax表達(dá)水平明顯增多，Bcl-2表達(dá)水平明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與PILO組比較，Ru360顯著降低海馬組織Bax表達(dá)水平，增加Bcl-2表達(dá)水平，而Spermine則顯著增加海馬組織Bax表達(dá)水平，降低Bcl-2表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

2.5 各組大鼠海馬組織中Cyt C釋放和caspase-3激活 與CON組比較，PILO組海馬神經(jīng)元線粒體Cyt C釋放和caspase-3的激活顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與PILO組比較，Ru360顯著抑制海馬神經(jīng)元線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活，而Spermine則顯著增加海馬神經(jīng)元線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖4)。

圖1 各組大鼠海馬線粒體鈣離子濃度比較(與CON組比較*P<0.05；與PILO組比較#P<0.05)

圖2 各組大鼠海馬CA3區(qū)凋亡檢測(cè)(TUNEL，×400)。A：Control組；B：PILO組；C：Ru360組；D：Spermine組

圖3 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2表達(dá)水平(與CON組比較*P<0.05；與PILO組比較#P<0.05)

A：各組線粒體Cyt C(mito-CytC)、胞質(zhì)Cyt C(cyto-CytC)表達(dá)水平；B：各組cleaved caspase-3表達(dá)水平(與CON組比較*P<0.05；與PILO組比較#P<0.05)

3 討 論

癲癇發(fā)作可使鈣離子由多種途徑涌入細(xì)胞內(nèi)，而線粒體通過(guò)攝取胞漿中過(guò)多的鈣離子，降低胞漿中鈣離子濃度，發(fā)揮代償作用。但線粒體鈣離子超載也使線粒體跨膜電位下降及通透性增加，Cyt C釋放等，從而引起細(xì)胞凋亡和壞死，導(dǎo)致神經(jīng)元對(duì)癇性損傷更加敏感，形成惡性循環(huán)[14，15]。MCU在線粒體鈣離子攝取中發(fā)揮重要作用，是鈣離子由胞漿進(jìn)入線粒體基質(zhì)的主要通路[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)在 NMDA誘導(dǎo)體外培養(yǎng)海馬及皮質(zhì)神經(jīng)元的興奮性毒性損傷過(guò)程中，高表達(dá) MCU 導(dǎo)致線粒體鈣離子濃度升高，增加興奮毒性神經(jīng)元死亡，而降低 MCU 表達(dá)使線粒體鈣離子濃度降低，減少興奮毒性神經(jīng)元死亡[16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PILO誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬線粒體Ca2+濃度顯著增加，且在SE 2 h達(dá)峰值，海馬神經(jīng)元凋亡明顯增加，MCU抑制劑Ru360可通過(guò)緩解線粒體鈣離子超載，顯著減輕海馬神經(jīng)元凋亡，而MCU激動(dòng)劑精胺則加重線粒體鈣離子超載，顯著增加海馬神經(jīng)元凋亡。本研究表明，MCU調(diào)控的線粒體鈣通道可能在癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要作用。

Bcl-2家族蛋白分為促進(jìn)凋亡的Bax亞族(Bax、Bak等)和抑制凋亡的Bcl-2亞族(Bcl-2、Bcl-xl等)[17]，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵[18，19]。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白可通過(guò)改變線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開(kāi)放和線粒體內(nèi)Cyt C、AIF等促凋亡因子的釋放來(lái)調(diào)節(jié)凋亡過(guò)程，Bcl-2蛋白過(guò)表達(dá)可減少mPTP開(kāi)放、Cyt C及AIF釋放，發(fā)揮抗凋亡作用，Bax蛋白過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致線粒體跨膜電位丟失、Cyt C及AIF釋放，引起細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，與CON組相比，PILO癲癇大鼠海馬組織Bax蛋白表達(dá)水平明顯增加，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)水平明顯減少。與PILO組相比，Ru360顯著降低海馬組織Bax蛋白表達(dá)水平，并且增加Bcl-2蛋白表達(dá)；而精胺則顯著增加Bax蛋白表達(dá)，并降低Bcl-2蛋白表達(dá)。本研究證實(shí)MCU可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，從而在癲癇海馬神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要作用。

線粒體鈣離子含量影響線粒體膜的功能結(jié)構(gòu)，正常情況下線粒體膜可阻止線粒體內(nèi)物質(zhì)的釋放，而癲癇發(fā)作使線粒體鈣離子超載，引起mPTP呈高開(kāi)放狀態(tài)[21～23]，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，位于線粒體內(nèi)膜的Cyt C、AIF等促凋亡蛋白通過(guò)開(kāi)放的mPTP從線粒體膜間隙釋放入胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，最終激活下游的凋亡執(zhí)行蛋白酶caspase-3，導(dǎo)致DNA斷裂，核染色質(zhì)凝聚，引起細(xì)胞凋亡[24]。本研究結(jié)果顯示：與CON組比較，PILO癲癇大鼠海馬線粒體Cyt C釋放及caspase-3激活均顯著增加，Ru360可明顯抑制線粒體Cyt C釋放和caspase-3活化，而精胺則增加線粒體Cyt C釋放和caspase-3活化。本研究證實(shí)MCU可能通過(guò)調(diào)控線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，從而在癲癇海馬神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，MCU在PILO癲癇大鼠海馬神經(jīng)損傷中發(fā)揮重要作用，抑制MCU可顯著緩解癲癇海馬神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能為通過(guò)抑制線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，為抗癲癇治療提供了新思路。

[1]張 倩，張宏偉，夏建華，等. 線粒體分裂蛋白抑制劑對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響[J]. 河南醫(yī)學(xué)研究，2014，23(2)：1-4.

[2]張 倩. 線粒體分裂蛋白抑制劑對(duì)匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D]. 鄭州大學(xué)，2014.

[3]Delorenzo RJ，Sun DA，Deshpande LS. Cellular mechanisms underlying acquired epilepsy：the calcium hypothesis of the induction and maintainance of epilepsy[J]. Pharmacol Ther，2005，105(3)：229-266.

[4]Gambardella A，Labate A. The role of calcium channel mutations in human epilepsy[J]. Prog Brain Res，2014，213：87-96.

[5]Steinlein OK. Calcium signaling and epilepsy[J]. Cell Tissue Res，2014，357(2)：385-393.

[6]Castaldo P，Cataldi M，Magi S，et al. Role of the mitochondrial sodium/calcium exchanger in neuronal physiology and in the pathogenesis of neurological diseases[J]. Prog Neurobiol，2009，87(1)：58-79.

[7]Wrighton KH. Calcium：mitochondrial channel calcium[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2011，12(8)：463.

[8]De Stefani D，Raffaello A，Teardo E，et al. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter[J]. Nature，2011，476(7360)：336-340.

[9]de Jesús García-Rivas G，Guerrero-Hernández A，Guerrero-Serna G，et al. Inhibition of the mitochondrial calcium uniporter by the oxo-bridged dinuclear ruthenium amine complex (Ru360) prevents from irreversible injury in postischemic rat heart[J]. FEBS J，2005，272(13)：3477-3488.

[10]Kumfu S，Chattipakorn S，F(xiàn)ucharoen S，et al. Mitochondrial calcium uniporter blocker prevents cardiac mitochondrial dysfunction induced by iron overload in thalassemic mice[J]. Biometals，2012，25(6)：1167-1175.

[11]梁 楠，王 鵬，王士雷，等. 線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷線粒體分裂的影響[J]. 國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志，2014，35(7)：585-589.

[12]Zhang L，Gao X，Yuan X，et al. Mitochondrial calcium uniporter opener spermine attenuates the cerebral protection of diazoxide through apoptosis in rats[J]. J Stroke Cerebrovasc Dis，2014，23(5)：829-835.

[13]Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation Ⅱ Motor seizure[J]. Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32(3)：281-294.

[14]Gao J，Chi ZF，Liu XW，et al. Mitochondrial dysfunction and ultrastructural damage in the hippocampus of pilocarpine-induced epileptic rat[J]. Neurosci Lett，2007，411(2)：152-157.

[15]Lin Y，Han Y，Xu J，et al. Mitochondrial DNA damage and the involvement of antioxidant defense and repair system in hippocampi of rats with chronic seizures[J]. Cell Mol Neurobiol，2010，30(6)：947-954.

[16]Qiu J，Tan YW，Hagenston AM，et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals[J]. Nat Commun，2013，4：2034.

[17]Stefanki C，Antoniou C，Stefanaki K，et al. Bcl-2 and Bax in congenital naevi[J]. Br J Dermatol，2006，154(6)：1175-1179.

[18]García-Sáez AJ. The secrets of the BcI-2 famiIy[J]. Cell Death Differ，2012，19(11)：1733-1740.

[19]Tsukaharas S，Yamamoto S，Shew TT，et al. Inhalation of low-level formaldehyde increases the bcl-2/bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice[J]. Neuroimmunomodulation，2012，13(2)：63-68.

[20]Reed JC. Bcl-2 family proteins[J]. Oncogene，1998，17(25)：3225-3236.

[21]Baines CP. The mitochondrial permeability transition pore and ischemia-reperfusion injury[J]. Basic Res Cardiol，2009，104(2)：181-188.

[22]Halestrap AP. What is the mitochondrial permeability transition pore[J]? Mol Cell Cardiol，2009，46(6)：821-831.

[23]Di Lisa F，Carpi A，Giorgio V，et al. The mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in cardioprotection[J]. Biochim Biophys Acta，2011，1813(7)：1316-1322.

[24]Juhaszova M，Wang S，Zorov DB，et al. The identity and regulation of the mitochondrial permeability transition pore：where the known meets the unknown[J]. Ann N Y Acad Sci，2008，1123：197-212.

Effectofmitochondrialcalciumuniporteronhippocampalneuronaldamageinpilocarpine-inducedseizures

WANGYali，WANGCui，YUMengyan，etal.

(DepartmentofNeurologyofFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450000，China)

ObjectiveTo investigate the effect of mitochondrial calcium uniporter (MCU) on hippocampal neuronal damage in pilocarpine-induced seizures.Methods84 male SD rats were randomly divided into 4 groups：control group，PILO group (divided into 4 subgroups：2 h，8 h，24 h and 72 h)，Ru360 group and Spermine group. The behavioral changes of each group were observed. Fluorescent staining was used to detect the free calcium concentration of hippocampus mitochondria and hippocampal neuronal apoptosis was detected by TUNEL staining. The expressions of Bax，Bcl-2，Cyt C and caspase-3 were detected by Western blotting.Results(1)Compared with control group，the mitochondrial calcium concentration and apoptotic neurons in PILO group increased (P<0.05). Compared with control group，expression of Bax，caspase-3 activation and Cyt C release in PILO group increased，while expression of Bcl-2 decreased (P<0.05). (2)Compared with PILO group，Ru360 reduced the mitochondrial calcium concentration and apoptotic neurons (P<0.05). Compared with PILO group，Ru360 reduced expression of Bax，caspase-3 activation and Cyt C release，while increased expression of Bcl-2 (P<0.05). (3)Compared with PILO group，Spermine increased the mitochondrial calcium concentration and apoptotic neurons (P<0.05). Compared with PILO group，Spermine increased expression of Bax，caspase-3 activation and Cyt C release，while reduced expression of Bcl-2 (P<0.05).ConclusionMCU plays an important role in hippocampal neuronal damage in pilocarpine-induced seizures. Inhibition of MCU can significantly attenuate hippocampal neuronal apoptosis，and the underlying mechanism maybe through mitochondria-mediated apoptosis pathway.

Epilepsy； Mitochondrial calcium uniporter； Mitochondrial calcium； Apoptosis

1003-2754(2017)11-0964-05

2017-09-10；

2017-10-15

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No. 81571260)

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000)

謝南昌，E-mail：xielanbor@163.com

R742.1

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