基于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的穴位-分子生物學(xué)效應(yīng)研究＊

黃滿婷，雷 蕾，李海燕，楊 策，聶 瑩，亢 力

（中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所 北京 100700）

復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)作為一種新興的科學(xué)研究方法和工具，為復(fù)雜系統(tǒng)的研究打開了新的視角，其研究涉及到系統(tǒng)科學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計物理學(xué)、計算機科學(xué)等多個學(xué)科[1]。近年來，中醫(yī)藥領(lǐng)域復(fù)雜性研究對復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用逐漸增多，大量研究表明，采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)方法和工具可以更加深入且直觀地體現(xiàn)出中醫(yī)藥復(fù)雜體系中的科學(xué)性[2]。針刺穴位的作用機制一直以來是研究者們關(guān)注的熱點問題，亦因此產(chǎn)生了大量的研究成果，前期本研究團(tuán)隊以疾病腦缺血為出發(fā)點，以文獻(xiàn)研究成果為數(shù)據(jù)來源，運用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的方法探討了針刺治療腦缺血的選穴規(guī)律及其分子作用機制[3]，為本次研究奠定了一定的基礎(chǔ)。本研究旨在探尋更多的穴位-分子效應(yīng)關(guān)系，以期為相關(guān)領(lǐng)域研究者及臨床應(yīng)用提供一些參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

采用檢索策略：針刺OR針灸OR電針（特征詞：動物），文獻(xiàn)年限為1956-2015年12月，從《中國知網(wǎng)》（CNKI）、《萬方數(shù)據(jù)資源庫》和《中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫》（CBM）三大數(shù)據(jù)庫中檢索針刺實驗文獻(xiàn)題錄，以“基因表達(dá)”和“蛋白表達(dá)”為關(guān)鍵詞和主題詞對文獻(xiàn)題錄進(jìn)行篩選，去重后獲得研究所需文獻(xiàn)。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：針刺療法的動物實驗研究文獻(xiàn)

排除標(biāo)準(zhǔn)：①文獻(xiàn)綜述；②人或動物的臨床實驗文獻(xiàn)；③以針刺作為對照組的文獻(xiàn)；④藥物注射對針刺效應(yīng)影響的相關(guān)文獻(xiàn)；⑤火針、刺血療法、電刺激療法及砭法相關(guān)文獻(xiàn)；⑥單純穴位療法及單純艾灸療法相關(guān)文獻(xiàn)；⑦按摩推拿療法、運動針療法及心理療法相關(guān)文獻(xiàn)；⑧針?biāo)幗Y(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)。

1.3 數(shù)據(jù)規(guī)范

根據(jù)原文采集針刺部位信息和其相對應(yīng)的有效調(diào)節(jié)的分子水平效應(yīng)信息，針刺部位數(shù)據(jù)參照中醫(yī)藥主題詞表（TCMeSH 2015）版＊＊ 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所.中國中醫(yī)藥主題詞表:[DB/OL].(2015-11-27)[2017-04-25].http://tcmks.cintcm.com:8080/cmtpub/mvccon?troller?pEvent＝USER_LOGIN.html＊＊ The National Center for Biotechnology Information.Genes&Expression：[DB/OL].[2017-04-25].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.html.進(jìn)行規(guī)范，分子效應(yīng)指標(biāo)數(shù)據(jù)參照NCBI-Gene and Protein＊＊＊ 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥信息研究所.中國中醫(yī)藥主題詞表:[DB/OL].(2015-11-27)[2017-04-25].http://tcmks.cintcm.com:8080/cmtpub/mvccon?troller?pEvent＝USER_LOGIN.html＊＊ The National Center for Biotechnology Information.Genes&Expression：[DB/OL].[2017-04-25].https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.html.進(jìn)行規(guī)范。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

對規(guī)范好的數(shù)據(jù)進(jìn)行審核去重后，運用Excel 2010、Access 2010軟件進(jìn)行頻次統(tǒng)計計算，運用Py?thon編程語言編寫的軟件進(jìn)行計算，構(gòu)建穴位-分子效應(yīng)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，通過復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)軟件Cytoscape3.3.0對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并結(jié)合MCODE聚類插件對針刺部位-分子效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行化模塊聚類分析和可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 分子和針刺部位的頻次統(tǒng)計

選取經(jīng)過規(guī)范后的穴位數(shù)據(jù)和分子數(shù)據(jù)，對文獻(xiàn)ID進(jìn)行去重合并，以確保每一篇文獻(xiàn)ID對應(yīng)一個詞條。將穴位數(shù)據(jù)與分子數(shù)據(jù)通過唯一的文獻(xiàn)ID號進(jìn)行匹配，去除同一文獻(xiàn)ID號下只有穴位或只有分子的條目，獲得最終有效數(shù)據(jù)。對所獲得的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行拆分并統(tǒng)計頻次，分別獲得與分子相匹配的針刺部位233個，分子793個，由高到低排序，分別選取兩項內(nèi)容的前十項見表1。從表中可以看出針刺部位前十項累計頻次56.12%，其中頻次最高的是穴位足三里（722）；分子指標(biāo)前十項累計頻次達(dá)22.87%，不足總指標(biāo)數(shù)的1/3，且頻次大于100的只有兩項，分別為BCL2（抗凋亡基因）和FOS（原癌基因），說明分子指標(biāo)較分散，反映出針刺實驗研究在分子水平的指標(biāo)選擇是多樣的，并沒有很集中地研究某一指標(biāo)的針刺效應(yīng)。

2.2 針刺部位-分子關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將穴位數(shù)據(jù)和分子數(shù)據(jù)以唯一的文獻(xiàn)ID號進(jìn)行匹配關(guān)聯(lián)，分子和針刺部位作為網(wǎng)絡(luò)的結(jié)點，針刺部位和針刺部位、針刺部位和分子、分子和分子同時出現(xiàn)在同一篇文獻(xiàn)并且有確定效應(yīng)關(guān)系時則形成一條邊，運用Python編程語言編寫的軟件進(jìn)行計算，構(gòu)建穴位-分子效應(yīng)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，定義網(wǎng)絡(luò)中的三種關(guān)系分別為針刺穴位的配伍關(guān)系、分子之間的相關(guān)關(guān)系及針刺部位的分子效應(yīng)關(guān)系，獲得一個含有1026個結(jié)點和8811條邊的網(wǎng)絡(luò)，此網(wǎng)絡(luò)結(jié)點度和邊權(quán)值較高的數(shù)據(jù)情況見表2和表3。

表1 針刺部位和分子頻次統(tǒng)計（前10項）

表2 針刺部位-分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)點度排名前15項

表3 針刺部位-分子網(wǎng)絡(luò)三類邊權(quán)值排名前5項

表4 針刺部位-分子網(wǎng)絡(luò)中點度中心度、中間中心度、接近中心度都較大的結(jié)點

圖1 模塊1

在網(wǎng)絡(luò)中，結(jié)點度越高，則表示與這個結(jié)點相連的結(jié)點越多，說明此結(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中處于中心位置。從表2可以看出，在針刺部位-分子網(wǎng)絡(luò)中，結(jié)點度最高的針刺部位是足三里穴，與其相鄰的結(jié)點有480個；結(jié)點度最高的分子是BCL2，與其相鄰的結(jié)點有98個，說明在此網(wǎng)絡(luò)中處于中心位置的穴位為足三里，處于中心位置的分子指標(biāo)是BCL2。根據(jù)文獻(xiàn)報道[4-8]，BCL2是與細(xì)胞凋亡過程關(guān)系最密切的基因，屬于抗凋亡基因，通過調(diào)控其表達(dá)量，可以有效控制細(xì)胞的凋亡，針刺穴位可有效促進(jìn)缺血狀態(tài)下BCL2的表達(dá)。

在網(wǎng)絡(luò)中，邊權(quán)值表示這條邊連接的兩個結(jié)點一同出現(xiàn)的頻率，邊權(quán)值越大，則兩結(jié)點同時出現(xiàn)的頻率越大。從表3三類邊權(quán)值排序可以發(fā)現(xiàn)以下幾點：第一，穴位共現(xiàn)頻次最高的是大椎和百會，并發(fā)現(xiàn)共現(xiàn)頻次較高的穴位亦是結(jié)點度較高的穴位，說明結(jié)點度較高的穴位常常相互配伍使用；第二，共現(xiàn)頻次最高的分子是BCL2和Bax，這兩個分子同屬凋亡基因家族，前者是抑凋亡基因，后者屬促凋亡基因，在研究過程中常常被同時觀測并計算兩者比值[9-12]；第三，分子和分子同時出現(xiàn)的頻率整體上低于穴位和穴位同時出現(xiàn)的頻率，因此可以推測針刺實驗在研究分子機制時對單個分子的研究較為普遍，而成族的研究較少；第四，從穴位和分子邊權(quán)值排序可以看出和BCL2最常同時出現(xiàn)的是百會穴，其次是足三里穴，表明在針刺實驗研究過程中常常選用百會穴和足三里穴來研究BCL2的變化。

為進(jìn)一步研究此關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的特征，將針刺部位-分子數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.3.0軟件進(jìn)行計算，得出該網(wǎng)絡(luò)的密度為0.017，網(wǎng)絡(luò)直徑為6，網(wǎng)絡(luò)集中化為0.452，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為1.765，聚類系數(shù)為0.779，說明此網(wǎng)絡(luò)結(jié)點之間聯(lián)系相對緊密；最短路徑為1051650，平均路徑長度為2.554，說明該網(wǎng)絡(luò)符合復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的小世界性；孤立點數(shù)為0，說明此網(wǎng)絡(luò)為閉合型復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。

為了分析此網(wǎng)絡(luò)中每個結(jié)點的相互關(guān)系，本研究通過分析結(jié)點的點度中心度、接近中心度、中間中心度進(jìn)行對結(jié)點個體的研究，由此了解結(jié)點個體在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用，即每個穴位或分子在網(wǎng)絡(luò)中與其他穴位或分子的關(guān)系。由于此網(wǎng)絡(luò)結(jié)點數(shù)較多，故這里只展示三中心度都較大的結(jié)點作為示例進(jìn)行討論，見表4。

從表4中可以看出，三中心度都較大的結(jié)點均為穴位，說明在針刺實驗研究過程中不同的研究者在穴位的選取上是比較集中的；同時還反映出在網(wǎng)絡(luò)中表4中七個穴處于網(wǎng)絡(luò)的中心地位，并有很強的紐帶作用，表現(xiàn)為與其可配伍的穴位較多或其可調(diào)節(jié)的分子指標(biāo)較多，并且在配伍性和調(diào)節(jié)程度上均強于其他穴位。為了更進(jìn)一步地了解穴位配伍關(guān)系和其可調(diào)節(jié)的分子內(nèi)容，本研究引入了復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的化模塊聚類分析算法來對此網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊劃分。

2.3 針刺部位-分子網(wǎng)絡(luò)化模塊聚類結(jié)果分析

運用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)軟件Cytoscape3.3中的MCODE聚類插件計算針刺部位-分子效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)核心互作網(wǎng)絡(luò)模塊（Score＞2）。結(jié)果共獲得核心互作用模塊50個，其中Score＞10的有4個，見圖1-4。在模塊中，結(jié)點為穴位和分子，邊為結(jié)點之間的互作關(guān)系，其中穴位與穴位是配伍關(guān)系，分子與分子是相關(guān)關(guān)系，穴位與分子是調(diào)節(jié)關(guān)系。

圖2 模塊2

圖3 模塊3

圖4 模塊4

圖5 模塊2落入代謝通路（has01100：has01100:Metabolic pathways）的分子穴位關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

從圖中可以看出，模塊1包含40個分子和4個穴位，涉及946個互作關(guān)系（MCODE Score=44）；模塊2包含56個分子和5個穴位，涉及915個互作關(guān)系（MCODE Score=30.5）；模塊3包含56個分子和12個穴位，涉及638個互作關(guān)系（MCODE Score=19.045）；模塊4包含26個分子和9個穴位，涉及206個互作關(guān)系（MCODE Score=12.118）。由此說明，模塊中的分子和穴位在整個網(wǎng)絡(luò)中互作用關(guān)系緊密，那么可以推測處于同一模塊中的分子大都有相同的功能，或者都與同一疾病有關(guān)，又或者屬于同一個生物通路。為了驗證推測，本研究借助DAVID數(shù)據(jù)庫*＊ National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID),NIH.DAVID Bioinformatics Resources 6.8:[DB/OL].[2017-04-25].https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp.html對這4個模塊中涉及到的分子進(jìn)行分子功能注釋，從而了解其成族關(guān)系的具體內(nèi)容。

將這四個模塊中涉及到的分子分別丟入DAVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分子功能注釋，尋找與人類生理病理過程相關(guān)的基因及其代謝通路，并對結(jié)果結(jié)合臨床實際進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：模塊1有34個基因被找到，其中有21個基因分布在133個代謝通路中，聚集基因數(shù)較多的通路有4個；模塊2有44個基因被找到，其中有36個基因分布在163個代謝通路中，聚集基因數(shù)較多的通路有3個；模塊3有42個基因被找到，其中有38個基因分布在167個代謝通路中，聚集基因數(shù)較多的通路有2個；模塊4有21個基因被找到，其中有17個基因分布在106個代謝通路中，聚集基因數(shù)較多的通路有1個。部分結(jié)果詳見表5。

表5 針刺部位-分子網(wǎng)絡(luò)模塊分子功能注釋結(jié)果表

從表5中可以看出，相對于其他3個模塊，模塊2的分子之間功能更為集中，有1/3（12/36）的分子被聚集在代謝通路中（hsa01100:Metabolic pathways），其網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖見圖3。

圖中12個基因分別為線粒體ATP合酶（ATP5H）、腺苷酸激酶（adenylate kinase 1 AK1）、血小板激活因子乙酰水解酶1b催化亞基2（platelet activating factor acetylhydrolase 1b catalytic subunit 2 PAFAH1B2）、磷酸甘油酸酯變位酶1（phosphoglycerate mutase 1 PGAM1）、泛醌細(xì)胞色素 c還原酶（ubiquinol-cyto?chrome c reductase UQCRFS1）、磷酯酶Cβ1抗體（phos?pholipase C beta 1 PLCB1）、細(xì)胞色素c氧化酶亞基5 b（cytochrome c oxidase subunit 5B COX5B）、肌酸激酶B（creatine kinase B CKB）、過氧化物氧化還原酶6（per?oxiredoxin 6 PRDX6）、NME/NM23核苷二磷酸激酶1（NME/NM23 nucleoside diphosphate kinase 1 NME1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH）、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 4（fucosyl?transferase 4 FUT4），可以推測針刺穴位足三里、內(nèi)關(guān)、水溝、粱門、四白可能會對代謝通路有所調(diào)節(jié)。同時，穴位足三里、粱門、四白屬于足陽明胃經(jīng)腧穴，均可治療胃經(jīng)疾?。粌?nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)穴，是八脈交會穴之一，與陰維脈相通，陰維脈與足太陰脾經(jīng)相通，故內(nèi)關(guān)亦可治療脾胃腸疾病；水溝是急救要穴。那么可見這五個穴位均可用于治療脾胃腸系疾病及相關(guān)癥狀，可以推測針刺這些穴位治療疾病的生物學(xué)機制有可能是通過刺激這12個基因調(diào)節(jié)代謝通路，從而達(dá)到治療目的；亦可推測足陽明胃經(jīng)和代謝通路關(guān)系密切，有待進(jìn)行進(jìn)一步的的研究來證實。

3 結(jié)論

本文運用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的方法對針刺部位-分子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了計算分析，并引入MCODE算法，對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了模塊劃分，得到了穴位與分子之間更深層次的互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)足三里穴是針刺實驗研究的最常用穴位，足陽明胃經(jīng)可能與代謝通路關(guān)系密切，尤其是與一些相關(guān)生物因子相聯(lián)系，體現(xiàn)了中醫(yī)理論的現(xiàn)代化，為臨床及實驗研究提供新的研究思路。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)針刺實驗研究對于分子水平的研究較為松散，相互之間聯(lián)系不緊密，此現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是實驗研究對分子水平的研究較少且不成系列研究，針對這一可能的原因，在此后的研究過程中可以進(jìn)一步在針刺對分子水平的調(diào)節(jié)發(fā)面深入并成系統(tǒng)研究。

1 劉建香.復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)及其在國內(nèi)研究進(jìn)展的綜述.系統(tǒng)科學(xué)學(xué)報,2009,17(4):31-37.

2 嚴(yán)蓓華,楊銘,陳佳蕾,黃景山,許麗雯,汪文娟.復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)在中醫(yī)藥方面的研究和應(yīng)用.中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(7):276-280.

3 黃滿婷,雷蕾,李海燕.基于腦缺血動物模型的針刺作用機制及選穴規(guī)律的挖掘研究.國際中醫(yī)中藥雜志,2017,39(4):333-338.

4 余曉慧,孫國杰.針刺對局灶性腦缺血大鼠腦細(xì)胞凋亡及Bcl-2蛋白表達(dá)的影響.針刺研究,2004,29(1):15-17.

5 吳兆利,李春日,劉自力,張慶榮.針刺“足三里”對哮喘大鼠嗜酸細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響.中國針灸,2012,32(8):721-725.

6 羅勇,董為偉.電針上調(diào)大鼠局灶性腦缺血/再灌注時腦組織抗凋亡基因bcl-2蛋白表達(dá).中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2000,22(1):53.

7 唐偉,王威,孫忠人,張力.針刺預(yù)處理全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2mRNA的表達(dá).中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2007,12（2）:156-158.

8 劉星,宿寶貴,呂來清,等.電針上調(diào)腦梗塞大鼠皮質(zhì)缺血半影區(qū)Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá).解剖學(xué)研究,2010,32(2):88-92.

9 趙小文,董勤,沈梅紅.針刺對腦缺血后細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2Bax調(diào)節(jié)作用的研究.吉林中醫(yī)藥,2015,35(7):730-732.

10張業(yè)貴,龔鑫,李懷斌.電針對腦缺血再灌注大鼠額葉皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)Bcl-2、Bax表達(dá)的影響.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2014,33(2):95-98.

11王彤,于建春,邢海濤,等.“益氣調(diào)血,扶本培元”針刺法對多發(fā)梗塞性癡呆大鼠海馬bcl-2、bax蛋白表達(dá)的影響.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2006,20(3):58-60.

12袁青,俞裕天,謝津津,等.靳三針頭針對宮內(nèi)窘迫HIBD大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡與Bcl-2、Bax比值的影響.遼寧中醫(yī)雜志,2015,42(1):202-204.