青藤堿對肺癌模型大鼠抑癌基因P16和P53的影響＊

鄭化軍，王賢和，柯昌斌，李 莉

（1.湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院 十堰 442000；2.十堰市太和醫(yī)院十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學院 十堰 442000）

P53為編碼53的蛋白，是最常見抑癌基因之一[1]。P53參與調(diào)控細胞增殖和分化，在一定程度上維持基因的穩(wěn)定性，防止腫瘤細胞突變轉(zhuǎn)移。P53高表達與腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移有密切關系[2]。P16基因也是一種抑癌基因，參與調(diào)控細胞分化與增殖[3]。P53和P16直接或間接地參與細胞周期調(diào)控，這種負調(diào)控可抑制細胞無限分化與增殖，因此，任何引起P53和P16基因突變的因素均會引起細胞周期紊亂，導致腫瘤細胞逃避這種負性調(diào)控，細胞出現(xiàn)無緒分化與增殖而引發(fā)惡性腫瘤[4]。因此，糾正P53和P16基因過度表達可使細胞增殖與調(diào)亡周期維持在正常范圍內(nèi)，降低腫瘤的發(fā)生概率。青藤堿是目前已知的抗癌中草藥之一，其主要通過抑制腫瘤細胞G1-S期，對乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞的分化增殖均有肯定的抑制作用[5]。目前青藤堿對肺癌的治療機制鮮有實驗報告，其對肺癌極具研究價值，本實驗通過觀察其對WALKER-256移植性肺癌大鼠抑癌基因P53和P16及其基因表達的影響，研究其治療機制。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑

青藤堿（成都德思特生物技術有限公司，批號：017020293）；大鼠Walker癌肉瘤256瘤株購自上海鑫閔生命科學有限公司；鼠P16、P53ELISA試劑盒均購自上海雙贏生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠（上海前塵生物科技有限公司，批號：354230）；注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：0170123012）。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠50只，雄性，體重160±10 g，免疫缺陷的雄性BALB/c-nu/nu2裸小鼠4只，體重20±2 g，所有實驗動物均由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，動物許可證（SCXK（鄂）2017-0008），設施許可證號（SYXK（鄂）2017-0031）。

2 實驗方法

2.1 瘤源處理

取出儲存Walker癌肉瘤256瘤株的冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其全部融化，直接倒入含有10 mL新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)角瓶復蘇24 h，去除溶質(zhì)二甲基亞砜（Dimeth?yl Sulfoxide，DMSO），然后注入離心管低速1000 r?s-1離心，5 min，棄上清液，取底部Walker-256癌細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液配制成1×107mL-1的混懸液，注射到BALB/c-nu/nu2裸小鼠腹腔（0.2 mL/只），一周后抽取BALB/c-nu/nu2裸小鼠腹水，作為瘤源置于4℃冷凍管保存?zhèn)溆肹6]。

2.2 建立Walker-256移植性肺癌模型方法

參照文獻[7]，將儲存的Walker癌肉瘤256瘤株小鼠腹水，先用細胞計數(shù)儀計數(shù)，然后再用生理鹽水稀釋成1.5×106mL-1癌細胞混懸液備用。用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，碘伏消毒大鼠左胸皮膚，將1.5×106mL-1的WALKER-256細胞懸液與等體積的Matrigel基質(zhì)膠在冰面上混勻，用10注射器抽取以上混合液，于左肺5-6肋間注射0.5 mL（進針深度約0.6 cm），停針10 s后緩慢拔出針管，3周后可得Walker移植性肺癌模型。注射建模后單籠飼養(yǎng)，自然光照，自由飲水和攝食，動物房恒溫在20-22℃，恒濕60%-70%。本方法制備簡單、對大鼠損傷小、腫瘤病灶部位明確、單一、成瘤率高，且動物死亡率低。本實驗在注射瘤源3周后，死亡大鼠7只，經(jīng)影像學拍片檢查，成瘤大鼠30只，成腫瘤率為75%。

2.3 實驗動物分組與處理

挑選成瘤SD大鼠30只，采用隨機數(shù)字表編號后隨機分為模型組、環(huán)磷酰胺組、青藤堿治療組（n=10），另取10只健康SD大鼠設為正常對照組。青藤堿治療組按100 mg?kg-1?d的劑量背部皮下注射10%青藤堿，正常對照組和模型組按1 mL?kg-1?d劑量注射生理鹽水，環(huán)磷酰胺組按5 mg·kg-1·d的劑量注射作為陽性對照。4組均按1次/日，連續(xù)給藥10周。

表1 P53，P16及β-actin引物序列表及其擴增產(chǎn)物大小

2.4 Walker-256移植性肺癌抑瘤率檢測及細胞周期比值檢測

于最后一次給藥后，處死大鼠，摘取左肺瘤體，分離包膜，稱重，用游標卡尺準確測量瘤體長、短徑各3次，取均其均值計算瘤體積。瘤體積=ax6/2，a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤重-青藤堿治療組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。將分離好的瘤體用生理鹽水沖洗干凈，編號，-4℃冷藏備檢。檢測時將腫瘤組織勻漿，采用美國Epics Altra流式細胞儀檢測WALKER-256癌細胞在G1、G2、M和S期的增殖周期比例。

2.5 免疫組化法檢測P53和P16

采用免疫組化法檢測瘤體P53和P16蛋白陽性表達率，P53和P16蛋白陽性為染色后棕黃色或黃褐色，檢測時在高倍鏡下隨機取10個視野，各計數(shù)100個細胞，分別計算P53和P16蛋白陽性表達率。

2.6 RT-PCR方法檢測瘤體P53，P16 mRNA表達

取瘤體組織50 mg，一步法提取瘤體組織總RNA，取1 μg總RNA，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴增，以β-actin為內(nèi)參，檢測P53和P16mRNA表達。引物序列見表1。PCR反應體系：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL、Taq酶（5 u·μL-1）0.45 μL、dNTPs（10 mmo1 ?L-1）1 μL、含 15 mmol/LMg2+緩沖液5 μL，β-actin的上、下游引物各1 μL，P53和P16上、下游引物各1 μL，用滅菌水補充至50 μL。PCR反應條件為：93℃，30 s；94℃，3 min；64℃，30 s；71℃，1 min；35個循環(huán)，71℃，7 min。以目的基因灰度值/β-actin灰度值之比值表示P53、P16mRNA的相對值[8]。

2.7 統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件處理實驗所測數(shù)據(jù)，先對各組進行方差分析，實驗所測數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間差異則采用兩樣本均數(shù)Dunnet-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 青藤堿對肺癌模型大鼠瘤體形態(tài)及抑瘤率的影響

青藤堿組瘤質(zhì)量、瘤體積均低于模型組，抑瘤率高于模型組，與模型組比較，P＜0.05，與正常對照組和環(huán)磷酰胺組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。結果見表2。

3.2 青藤堿對大鼠瘤體P53和P16蛋白及基因表達的影響

正常對照組大鼠肺組織上均有P53和P16蛋白陽性表達。模型組大鼠肺瘤體組織上有大量P53和P16蛋白陽性表達，P53mRNA和P16mRNA高表達，與正常對照組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。環(huán)磷酰胺組P53和P16蛋白陽性率明顯降低，P53mRNA和P16mRNA低表達，與模型組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，提示經(jīng)陽性藥治療后，瘤體P53和P16蛋白及基因表達均降低。青藤堿治療組P53和P16蛋白陽性率明顯降低，P53mRNA和P16mRNA低表達；與模型組比較，P＜0.05，但均未完全達到正常水平；與正常對照組和環(huán)磷酰胺組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。結果見表3。

3.3 青藤堿對腫瘤細胞G1、G2、M和S增殖周期比例的影響

模型組大鼠肺瘤體組織G1和G2期細胞增殖比值降低、S期顯著提高，與正常組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。環(huán)磷酰胺組G1和G2期細胞增殖比值提高、S期降低，與模型組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。青藤堿治療組G1、G2期細胞增殖比值提高、S期降低，與模型組比較（P＜0.05），但均未完全達到正常對照組水平，與正常對照組和環(huán)磷酰胺組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。結果見表4。

4 討論

肺癌是最為常見、多發(fā)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重危害著人類的生命及健康[9]。肺癌的治療以手術切除、抗癌藥、化療為主，其副作用及化療反應大，5年生存率不高。中醫(yī)中藥在對肺癌的治療上由來已久，至今有不少中醫(yī)家和學者對肺癌進行了系統(tǒng)的研究，積累了很多獨到診療經(jīng)驗，對提高患者免疫機能、減少腫瘤細胞復發(fā)或轉(zhuǎn)移，延長患者生存時間具有一定的優(yōu)勢，已成為肺癌等惡性腫瘤腫瘤的一種有效的治療方法[10]。在祖國醫(yī)學中肺癌以“積”名之，屬于“肺壅”、“肺積”之范疇，認為癌毒先侵襲于肺而導致肺部癥積。肺之氣陰不足是本、瘀血、痰濁、熱毒及內(nèi)停是標，癌毒阻于內(nèi)、阻礙肺氣，耗傷氣津、步入損途而致肺癌[11,12]。而從西醫(yī)的角度分析，肺癌的病理以身改變是由于P53和P16基因突變，G1、G2、M和S各細胞周期紊亂，由此導致腫瘤細胞的分化、生長和凋亡失控，引起細胞無限制性分化、增殖，并導致腫瘤細胞惡化和轉(zhuǎn)移[13]。P53和P16基因編碼的P53和P16蛋白能直接或間接地抑制細胞周期依賴激酶的活性，負調(diào)控細胞周期，抑制細胞增殖[14]。因此，從理論上講，任何影響P53和P16基因表達的藥物均可能與腫瘤細胞分化、生長和凋亡密切相關。本實驗基于這一理論，對青藤堿是否會影響肺癌P53和P16基因表達進行了系統(tǒng)的觀察和研究。

結果表明，模型組抑瘤率僅2.47%，P16mRNA和P53mRNA高表達，瘤體積、瘤質(zhì)量、P16和P53蛋白陽性表達率明顯高于正常對照組，肺瘤體組織G1和G2期細胞增殖比值降低、S期顯著提高，這證實P16和P53蛋白在Walker-256移植性肺癌起到了負調(diào)控作用，細胞增殖周期紊亂，高表達的P16和P53引起腫瘤細胞無限制性分化、增殖，使P16和P53無法起到抑癌調(diào)控作用，腫瘤瘤體積、瘤質(zhì)量因無限制性分化、增殖而增大。而在使用青藤堿注射治療10周后，青藤堿組抑瘤率達30.15%，瘤體積、瘤質(zhì)量、P16和P53蛋白陽性表達率明顯降低，P16mRNA和P53mRNA低表達。青藤堿（Sinomenine）又名防己堿，是從防己科植物青風藤的干燥根莖中采用化學方法分離提取的純生物堿[15]。在體外細胞培養(yǎng)中，青藤堿對腫瘤細胞G1周期阻滯，誘導腫瘤凋亡，對G2期也有一定的抑制作用[16,17]。在實驗中，青藤堿通過對P16和P53負調(diào)控作用而發(fā)揮抑癌作用，這一作用雖無陽性對照組環(huán)磷酰胺組強，但與其作用類似，調(diào)整腫瘤細胞周期，抑制腫瘤細胞分化、增殖。在青藤堿對照組中，經(jīng)流式細胞儀檢測，顯示本組G1和G2期細胞比值提高，S期細胞比例降低，這提示青藤堿通過誘導腫瘤細胞的G1、G2、S期這一細胞周期限制點，阻滯腫瘤的生長。環(huán)磷酰胺為抗腫瘤藥，在進入體內(nèi)后先在肝臟中經(jīng)微粒體功能氧化酶轉(zhuǎn)化成醛磷酰胺。而醛酰胺不穩(wěn)定，在腫瘤細胞內(nèi)分解成酰胺氮芥及丙烯醛，酰胺氮芥對腫瘤細胞有細胞毒作用。環(huán)磷酰胺是雙功能烷化劑及細胞周期非特異性藥物，可干擾DNA及RNA功能，尤以對前者的影響更大，它與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結，抑制DNA合成，對S期作用最明顯。在本實驗中，青藤堿抑癌機制與環(huán)磷酰胺相似，但作用沒有環(huán)磷酰胺強，青藤堿通過影響細胞周期這一節(jié)點抑制腫瘤細胞的生長。

表2 青藤堿對肺癌模型大鼠瘤形態(tài)及抑瘤率的影響（±s,n=10）

表2 青藤堿對肺癌模型大鼠瘤形態(tài)及抑瘤率的影響（±s,n=10）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，cP＜0.05

表3 大鼠肺組織P53、P16表達及其mRNA表達比較（±s,n=10）

表3 大鼠肺組織P53、P16表達及其mRNA表達比較（±s,n=10）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，cP＜0.05

表4 G1、G2、M和S四增殖周期細胞比例比較（±s,n=10）

表4 G1、G2、M和S四增殖周期細胞比例比較（±s,n=10）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與環(huán)磷酰胺組比較，cP＜0.05

綜上所述，青藤堿可能通過影響抑癌基因P16和P53表達，并調(diào)節(jié)G1和G2和S期細胞比值而起到抑制大鼠WALKER-256移植性肺癌腫瘤細胞的分化和增殖，降低了腫瘤細胞無限制的分化風險而發(fā)揮了抑瘤作用。

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