有效成分生源途徑解析與調控技術在中藥材生產(chǎn)實踐中具有廣闊應用前景＊

張 磊，陳軍峰，肖 瑩，譚何新，李 卿，陳萬生＊＊

（1.第二軍醫(yī)大學藥學院藥用植物學教研室 上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院藥學部 上海 200003）

中藥材資源是整個中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)鏈可持續(xù)發(fā)展的基礎。市場需求的持續(xù)增加，勢必需要不斷拓展藥材資源以保障臨床用藥的可及性。當前許多大宗藥材已經(jīng)實現(xiàn)了GAP種植模式。質量是中藥產(chǎn)業(yè)的生命線。“野生”到“家種（養(yǎng)）”的演變會導致藥材性狀發(fā)生改變，不能有效保障藥材的優(yōu)質穩(wěn)定。藥材質量低下或者不穩(wěn)定常常導致臨床治療難以持續(xù)有效，所謂“方靈藥不靈”，嚴重危及中醫(yī)藥全產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展?！爸嗅t(yī)將毀于中藥”等說法頻繁見于各種報道，使中藥質量成為行業(yè)關注的焦點，同時也對中藥的質量建設提出更高的要求?！吨兴幉谋Ｗo和發(fā)展規(guī)劃（2015-2020）》將中藥質量保障與提升納入中藥現(xiàn)代化發(fā)展綱要之中，使之成為國家戰(zhàn)略。雖然中藥科技工作者對藥材質量研究做了大量的工作，我國中藥材質量控制水平也有了長足的進步，但研究工作尚存在碎片化，缺少系統(tǒng)的思路和方法，仍未建立適合中藥材特點的質量研究、評價和控制的科學模式等諸多問題。

引起中藥材質量下降和變異的因素有很多，涉及到中藥材生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)，不僅包含野生撫育、野生引種和立地條件等，還包括種質種苗、田間管理、采收加工和貯藏運輸?shù)?。中藥有效成分是其具有確切臨床療效的物質基礎，有效成分的差異是引起中藥品質變異的關鍵因素。藥效物質的有無（真?zhèn)危┒喙眩▋?yōu)劣）是藥材質量的核心要素，直接決定了其臨床使用效果。藥效物質的含量是評價中藥品質的主要內容和制定質量標準的基本依據(jù)，其積累水平與原植物的遺傳背景密切相關。鑒于對生源途徑認識的局限，無法對影響有效成分在植物體內生物合成、積累的關鍵遺傳物質進行識別，當前藥材基地主要依據(jù)藥用植物的農藝性狀來制定人工種植技術體系，栽培品的種質選用與遺傳育種處于農藝性狀層面，基本沒有關注藥效物質的動態(tài)積累過程，無法與藥材的功效關聯(lián)，不可避免會產(chǎn)生品質退化問題。即使是GAP種植基地，藥材不合格率也可能高達40%以上。

闡明有效成分生源途徑，實現(xiàn)“品效關聯(lián)”（品質與功效密切相關）的種質資源保存、選用乃至遺傳育種、品質調控，建立中藥材生產(chǎn)全過程質量保證體系，是提高藥材質量，確保中藥安全有效的基礎和關鍵。但目前尚無成熟的技術體系，嚴重制約了該領域的發(fā)展。我們團隊長期從事中藥有效成分的生源途徑解析及代謝調控研究，開展“基于藥效物質形成機制的中藥品質調控”。我們認為，藥材生產(chǎn)必須關注藥效物質基礎的動態(tài)積累，對于藥效物質基礎明確、質量標準完善的中藥材，應吸收“質量源于設計”的現(xiàn)代質量理念，深入探索藥效物質生源途徑調控機制，構建技術體系，發(fā)掘關鍵質量控制因子，并將之應用于優(yōu)異種質種苗篩選、種植過程精準調控、優(yōu)質藥材采收分揀等生產(chǎn)實踐，確保藥材性狀的均一穩(wěn)定和臨床療效的持續(xù)有效。

1 高通量檢測手段和系統(tǒng)生物學策略為闡明中藥材有效成分生源途徑提供了有效手段和背景資料

藥材品質特征是其生長發(fā)育過程中有效成分相關的初生、次生代謝水平和不同形態(tài)建成與發(fā)育結果的綜合體現(xiàn)?；钚猿煞衷诮M織中的合成分布與其形態(tài)、組織結構特征共同作用形成中藥材的品質特征。依據(jù)傳統(tǒng)“辨狀論質”的藥材質量判別方法，丹參的粗細、長短、皮色、斷面等形態(tài)特征目前依然作為其藥材規(guī)格分級的重要依據(jù)。此外，葉型、株型、花色等性狀也與其品質顯著相關[1-4]?？梢姸喾N性狀都可作為優(yōu)質丹參的形態(tài)指標。初步研究顯示，不同丹參活性成分在根部各組織部位中具有不同的累積特征。這種組織特異性源于其生物合成途徑中的催化酶在轉錄水平上的組織特異性。另一方面，形態(tài)特征與組織結構的多樣性也源于丹參的遺傳多樣性，形成于丹參植株生長發(fā)育過程中不同因素引起的復雜調控機制。以上兩種因素相結合，最終形成了丹參種質特征的多樣性，引起其品質差異問題。只有探明丹參活性成分的合成特征以及生長發(fā)育、形態(tài)建成的機制，在此基礎上探索二者對丹參品質特征形成的關聯(lián)作用，才能從根本上闡明丹參品質形成的科學內涵。農作物領域的成功范例對藥用植物的研究極具參考價值。以調控黃瓜[5]、番茄[6]風味的關鍵代謝產(chǎn)物為切入點，通過基因組解析找尋影響蔬菜品質的遺傳因素。

高通量實驗技術以其高效準確的檢測平臺、標準化的分析策略、信息涵蓋全面等優(yōu)點極大推進了中藥材有效成分的研究。高效的代謝組分析方法能夠準確、精細的體現(xiàn)活性成分合成與累積特征，從而可以更清晰的監(jiān)測主要活性成分的合成和累積特征。陳士林、漆小泉課題組首次完成了丹參基因組測序，獲得了大小558 MB的丹參基因組，預測包含30478個蛋白編碼基因[7]。全基因組序列的獲得，可以快速獲得包括合成途徑催化酶、轉錄因子等所有可能參與丹參藥效物質生物合成的完整基因信息。在基因組注釋的基礎上,基于二代、三代高通量核酸測序平臺，已有諸多研究利用不同測序平臺從不同角度對丹參進行了轉錄組測序，并整合代謝組信息，建立“轉錄－代謝”變化關聯(lián)性，系統(tǒng)解析活性成分生物合成的特征及調控機制，從而對調控丹參藥效物質生物合成的關鍵調控因子進行有效識別。

隨著高通量測序技術和植物功能基因組學快速發(fā)展，傳統(tǒng)的作物表型檢測手段已成為植物研究主要限制因素。應對這一問題，植物表型組學應運而生。利用光電成像、自動化控制、計算機、機械制造等工程技術同時對植物性狀進行精確采集以及數(shù)字轉化，采用高通量分析策略找尋普遍規(guī)律或特異表型，進而結合基因組、轉錄組分析揭示表型特征的遺傳背景。表型組策略已廣泛應用于水稻[8]、大麥[9]等重要農作物的農藝性狀研究[8]。然而目前在中藥材及其基原植物中還沒有一套相應的技術體系針對其形態(tài)特征開展表型組研究。如前所述丹參品質相關研究中，雖然已經(jīng)把丹參的多種根部形態(tài)與其藥材品質進行了關聯(lián)研究，然而主要都體現(xiàn)在優(yōu)質品系的特征描述，缺少基于大樣本量的統(tǒng)計分析模式，無法涉及品質相關的普遍規(guī)律的挖掘，更難觸及其遺傳機制。隨著相關研究成果的積累越來越豐富，以丹參為模板建立藥用植物表型組學研究體系的條件已經(jīng)具備。

通過建立適合的高通量植物表型組、基因組、轉錄組和代謝組分析平臺，整合分析多重組學大數(shù)據(jù)，可以精確表征藥用植物活性成分在不同生長發(fā)育階段、不同組織的生物合成變化規(guī)律，構建形態(tài)特征、基因表達與活性成分含量的相關性網(wǎng)絡，快速篩選可以預測有效成分高含量的中藥材品質關聯(lián)分子標記（差異表達基因）；繼而通過功能基因組研究對預測基因進行功能驗證，探討其與中藥材生長發(fā)育、生長環(huán)境、營養(yǎng)成分等立地品質和栽培品質的關聯(lián)，依據(jù)基因功能特征指示影響中藥材品質的關鍵因素，檢驗其作為藥材品質相關分子標記的效用，為實現(xiàn)從種質優(yōu)選到栽培采收的全程管理與干預提供可靠的參考依據(jù)。

2 解析有效成分生源合成的遺傳機制，開展中藥材優(yōu)異種質資源創(chuàng)新

“中藥材品質遺傳主導論”認為遺傳因素通過決定“代謝特質”與“形態(tài)特征”而對藥材品質形成發(fā)揮主導作用[10]。遺傳因素是中藥材的“種質品質”形成的基礎，是其品質所有范疇的決定因素。探明中藥材品質相關特征形成的遺傳背景，是解密復雜的中藥材品質問題的前提，而找尋影響品質性狀的關鍵基因，則是解析遺傳背景這一復雜命題的“鑰匙”。當前，丹參品質形成相關的研究主要集中在其活性成分的生物合成及調控機制。大量的研究詳盡刻畫了兩類活性成分（脂溶性丹參酮類與水溶性酚酸類）在丹參細胞中的合成過程及累積。丹參酮生物合成途徑起始于萜類化合物的通用途徑即生成IPP的MVA途徑和生成DMAPP的MEP途徑，兩個C5化合物經(jīng)GPPS催化結合生成GPP，繼而經(jīng) FPPS、GGPPS、CPS、KS生成次丹參酮二烯（Miltiradiene）[11]。位于丹參酮特異的合成支路的柯巴基焦磷酸合成酶（SmKSL）、貝殼杉烯合酶（SmCPS）、CYP76AH1（miltiradieneoxidase）、CYP76AH3 及CYP76AK1等催化酶功能相繼明確。在此基礎上如何發(fā)生環(huán)氧化，進一步生成丹參酮ⅡA等活性成分還待進一步探索。

課題組通過13C同位素示蹤探索丹參酚酸類成分的生物合成途徑，發(fā)現(xiàn)丹參迷迭香酸的生物合成途徑與報道的彩葉草、紫草等唇形科植物中迷迭香酸的生物合成途徑存在差異，雖然均從苯丙氨酸和酪氨酸起始，但在丹參中酪氨酸支路的4-羥基苯乳酸先經(jīng)過3位羥基化才與苯丙氨酸的4-香豆酰輔酶A結合，在迷迭香酸合成酶（RAS）作用下生成2-氧-（4-香豆酰）-3-（4-羥基苯）-乳酸，繼而經(jīng)CYP98A14催化生成迷迭香酸[12]。同時推測丹參酚酸B由兩個分別于2位、8位發(fā)生電子重排的迷迭香酸分子結合而成，漆酶（Laccase）家族基因可能參與了這一重要催化過程。

課題組將CRISPR/Cas9系統(tǒng)改造成可用于丹參基因組編輯的工具，建立了丹參的基因敲除系統(tǒng)，根據(jù)功能預測觀察基因敲除突變株的形態(tài)、生理、有效成分含量等表型特征，驗證目標基因對丹參種質形成的影響。通過對信號分子甲基茉莉酸（MeJA）干預后丹參毛狀根中迷迭香酸生物合成途徑基因表達及代謝流動態(tài)變化情況進行整合分析，構建“基因-化合物”關聯(lián)譜，獲得了調控丹參酚酸類成分合成的關鍵酶基因[13]。這些工作在探索研究丹參代謝、發(fā)育等方面科學問題的同時，還極大豐富了基因序列及表達譜數(shù)據(jù)庫等丹參遺傳背景資料，必將會全方位促進丹參次生代謝、遺傳進化、生長發(fā)育、品質鑒定方面的研究深度。

基于對活性成分合成途徑的深刻認知，丹參次生代謝工程育種取得成功。通過調控合成基因[14]和轉錄因子的表達[15]、激活內源茉莉酸信號轉導通路[16]和外源非生干預[17]等策略，提高了酚酸B、迷迭香酸和丹參酮的含量并獲得遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良株系。以上工作聚焦于藥用植物“代謝特質”的問題，融合“模式生物”研究方法，建立了在非模式藥用植物中快速確定關鍵功能基因，多角度表征藥用植物品質和全面闡明轉錄調控機制的研究體系，為開展高效精準遺傳育種提供了扎實的理論基礎及豐富的種質資源。

3 挖掘具有品質識別功用的分子標記，形成中藥材科學栽培新技術

藥用植物栽培本身受環(huán)境的影響較大，表現(xiàn)為嚴格的地域性、明顯的季節(jié)性、技術的多變性等特點。栽培過程中影響藥材品質的影響因素復雜多變。課題組在明確中藥材品質內涵的基礎上，以決定其品質的關鍵基因為調控靶點，為藥材種植量身定制分子標記與生長干預措施，保證栽培管理過程的精確化與科學化，保障藥材質量穩(wěn)定可控。通過開展丹參田間種植試驗，在大樣本研究基礎上，對目標基因分別進行組織特異性表達、發(fā)育階段特異性表達等時空表達特征研究，評估其作為品質相關分子標記物的可能性和可信度。本課題組已發(fā)掘和驗證獲得了一批有效的具有品質識別功能的中藥材品質關聯(lián)分子標記（Q-Marker）（表1），得以高效鑒別生藥基原，指示環(huán)境控制，應用于中藥材生產(chǎn)全過程干預。在“育苗”階段，基于表達水平開展分子輔助育種，挑選品質相關基因高表達種質，淘汰先天不足者；在“移栽——種植——施肥——采收”等各環(huán)節(jié)，基于基因表達特征調整相應栽培條件誘導基因高表達，實現(xiàn)藥材生產(chǎn)全過程監(jiān)控與干預，促進植株優(yōu)良性狀的形成，實現(xiàn)藥材生產(chǎn)的“按需調控”?；诖诵纬傻闹兴幉姆N苗選育、品質預判、科學栽培的新技術，具有特異性高、調控效果顯著、易于施行等優(yōu)點，基本實現(xiàn)了藥材種植的精準控制。板藍根種植相關技術廣泛應用于黑龍江大慶等全國各地多個板藍根種植產(chǎn)區(qū)，丹參栽培管理關鍵技術長期應用于上海綠谷制藥有限公司山東丹參種植基地。該成果的推廣在極大程度上解決了中藥材有效成分過低或含量不穩(wěn)定，藥材差異品質大，產(chǎn)量不穩(wěn)定等關鍵問題，切實提高了藥材品質優(yōu)良率，保障了優(yōu)質藥材供應，提高了藥農及藥材種植企業(yè)的經(jīng)濟收入，產(chǎn)生了良好的社會效益。

表1 高效分子標記用于識別、預測有效成分累積及植株發(fā)育水平

圖1 丹參表型組學研究體系。A.高通量丹參表型檢測平臺；B.丹參根系組織組成、根系結構解析；C.丹參地上、地下部分生長規(guī)律數(shù)學模型；D.丹參品質特征關聯(lián)性模型。

4 建立基于傳統(tǒng)中藥“辨狀論質”科學內涵的藥材分級標準

自古以來，藥材的規(guī)格和分級標準主要依據(jù)在生產(chǎn)實踐中積累的對藥材特征、藥效的認知，依據(jù)經(jīng)驗積累而制定。所謂“辨狀論質”，即從藥材的尺寸、形狀、色澤、表面特征、切面等方面來判斷藥材的真假、優(yōu)劣。目前依舊是藥材市場中是劃分藥材商品質量等級規(guī)格的基本依據(jù)。形態(tài)特征與化學成分相關性是藥材“辨狀論質”科學內涵的具體體現(xiàn)[25,26]。我們以丹參品質特征研究為范例，整合包括高通量作物表型組學、代謝組學、基因組學等多層次研究手段，解析傳統(tǒng)“辨狀論質”理論的規(guī)律，發(fā)掘其科學內涵，并依據(jù)其對藥材生產(chǎn)、品質分級提出建議（圖1）。

“植物表型組學”是近年提出的研究植物形態(tài)特征的概念，特別是對研究農作物品質特征具有極高的應用性。丹參的根系為應用部位，針對這一特征，我們開發(fā)出一套適應于丹參的根系特異研究平臺。首先，基于高通量的圖形采集和數(shù)字分析系統(tǒng)，采集可以表征丹參根系尺寸、體積、表面積、根系結構、顏色、根系組織分布等形態(tài)特征的150個參數(shù)；通過構建多種數(shù)學模型，表征這些形態(tài)特征的變化規(guī)律，篩選關鍵性狀。其次，利用高通量代謝組學分析平臺，快速檢測丹參中包括主效物質的約200個化合物。整合形態(tài)特征和化學特征研究，我們得以從兩個角度開展丹參品質內涵的研究，一是對不同品質特征的丹參開展大樣本量的研究；二是對丹參開展整個生長周期的動態(tài)觀測。通過整合不同層面、不同角度的數(shù)據(jù)，構建“有效成分—形態(tài)特征”關聯(lián)模型。通過以上一系列研究，深刻解析“辨狀論質”科學內涵。進而篩選合適的具有丹參品質指示作用的特征變量，實現(xiàn)“辨狀論質”的去偽存真。

除了追求產(chǎn)量以保障供應，出于不同的臨床需求，下游廠家對人工種植基地所產(chǎn)藥材品質特性也提出了更具體的要求。在深入認知品質特征內涵的基礎上，我們認為藥材的品質分級標準也應該從單一化的標準，逐漸根據(jù)生產(chǎn)要求實現(xiàn)靈活的藥材標準“精細化”。以丹參為例，以丹參酮為主要活性成分的成藥企業(yè)會要求藥材中丹參酮的含量更高；以酚酸類成分為制劑主要成分的藥企希望酚酸類化合物含量更高；而飲片廠則對藥材性狀、品相的要求更高。通過尋找真實體現(xiàn)藥材“狀”與“質”的內在關聯(lián)，可以突破經(jīng)驗總結的局限性，找到高品質藥材優(yōu)良性狀形成的關鍵控制點，實現(xiàn)品質精準調控和藥材快速揀選，對于中藥資源的高效利用和成本控制非常重要。

5 總結與展望

在人工種植面臨種質退化，質量低下，中藥產(chǎn)業(yè)已經(jīng)遭遇原材料供應瓶頸的背景下，面向重要中藥材品質保障與提升的國家需求，課題組秉承“通過闡明有效成分生源途徑，揭示藥材品質物質內涵形成機制，調控有效成分生物合成，進而實現(xiàn)藥材品質保障與提升”的研究理念，聚焦高活性中藥資源開發(fā)所面臨的“生物合成途徑不明”和“代謝調控效率低”兩個關鍵科學問題，結合中藥材自身特點，基于系統(tǒng)生物學思想，建立了解析藥材品質特征的整體研究策略。首先利用植物高通量表型組學方法，對植株藥用部位形態(tài)特征進行全面表征，解析分布規(guī)律；通過代謝組學研究，展現(xiàn)有效成分合成和累積的組織特異性；繼而采用系統(tǒng)生物學思路，整合分析多種高通量檢測平臺所產(chǎn)生的組學數(shù)據(jù)，構建“有效成分—形態(tài)特征”關聯(lián)模型，解析控制中藥材有效物質合成的遺傳網(wǎng)絡，挖掘生物合成關鍵基因和調控因子，闡明代謝通路調控機制，篩選合適的具有品質預測能力的特征變量，為開展基于分子標記的遺傳育種和生產(chǎn)全過程精準干預提供候選基因及靶點；在此基礎上將生源途徑調控技術應用于中藥材種質種苗篩選、種植過程精準管理、采收加工質量識別，建立了從選種到田間種植全程選擇、質控的優(yōu)質藥材生產(chǎn)模式，為通過遺傳改造促進有效成分高效合成和/或穩(wěn)定積累提供了成功范例，豐富了“中藥品質是生產(chǎn)出來的”現(xiàn)代中藥品質觀。相關研究成果可以為產(chǎn)區(qū)提供優(yōu)質種源，幫助建設穩(wěn)定、高產(chǎn)、優(yōu)質的規(guī)范化人工種植基地，為制劑生產(chǎn)提供質量穩(wěn)定的藥材，解決市場供求矛盾；更為做大做強成藥產(chǎn)品提供了堅實的上游支撐，必將提升相關產(chǎn)業(yè)的科技含量和國際競爭力，具有重要的基礎理論研究價值和商業(yè)化應用前景。

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