煙草反義Mlo基因表達載體的構建

鄔曉勇，時羽杰，李 杰，羅 倩，王躍華，唐 媛, 孫雁霞

(成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都 610106)

煙草反義Mlo基因表達載體的構建

鄔曉勇，時羽杰，李 杰，羅 倩，王躍華，唐 媛, 孫雁霞

(成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都 610106)

獲得煙草反義Mlo基因的植物表達載體pBI 121-Mlo，為進行煙草遺傳轉化，獲得該基因表達的缺陷型植株打下基礎.從煙草葉片中提取總RNA，利用RT-PCR技術擴增得到Mlo基因的cDNA，以此為模板設計反義引物，通過PCR擴增出反義Mlo基因，將此反義Mlo基因與T載體連接，測序正確后再將此反義片段與植物表達載體pBI 121連接，構建煙草反義Mlo基因的植物表達載體pBI 121-Mlo.經(jīng)Kan選擇篩選出反義重組菌落，堿裂解法小量提取質粒后，用XbaI和BamHI雙酶切后再進行電泳鑒定.結果表明，目的基因已與植物表達載體pBI 121連接成功.成功構建了煙草反義Mlo基因表達載體pBI 121-Mlo.

Mlo基因；pBI 121Mlo；RT-PCR；反義片段；雙酶切

0 引 言

植物在長期的進化過程中形成了一系列復雜而嚴密的防御機制，而使自身免受病原物的侵害，這涉及到一系列抗病相關基因的表達和調控，其中，Mlo基因就是植物抗病基因中的重要成員之一[1-2].研究發(fā)現(xiàn)，白粉病是由白粉菌引起的真菌性病害，能侵染多種單子葉植物和雙子葉植物[3-4]，野生型Mlo基因是大麥抗白粉病的負調控因子，可賦予大麥對白粉菌的廣譜抗性[5].

目前，科研人員已經(jīng)對擬南芥、水稻、玉米和楊樹中的Mlo基因家族進行了深入研究[6]，而對煙草的相關研究未見報道.對此，本研究以構建煙草Mlo基因反義表達載體為基礎，鑒定Mlo基因是否是抗白粉病的負調控因子，擬對其在煙草抗病方面的負調控作用提供實驗依據(jù).

1 實驗與方法

1.1 材 料

實驗所用材料包括：紅花大金元品種煙草的無菌苗葉片；DL2000 DNA Marker、GREENspspin多糖多酚類植物RNA快速提取試劑盒、高純度質粒提取試劑盒、pBLUE-T載體、小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購于北京莊盟生物有限公司，TIANgen midi purification kit試劑盒，購自于大連TaKaRa公司；JM109菌株由北京林業(yè)大學生物科學與技術學院陸海教授惠贈.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：5020型基因擴增儀(Thermo公司)，PAC300型電泳儀(BIORAD公司)，MDF-382E型超低溫冰箱(SANYO公司)，Eppendorf微量移液器、凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，ZF-90型暗箱式紫外透射儀(上海顧村電光儀器廠)，F(xiàn)A2004型電子天平(上海超平科學儀器有限公司)，AIRTECH超凈工作臺(安泰公司).

1.3 方 法

1.3.1 煙草Mlo基因的克隆.

1)煙草總RNA提取.通過GREENspspin多糖多酚類植物RNA快速提取試劑盒提取煙草的總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取情況.

2)NA反轉錄獲得cDNA.根據(jù)提取到的RNA，用TIANgen midi purification kit試劑盒轉錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?

反轉錄具體步驟：①在Ep管中依次加入下列溶液，Oligo(dT)18 Primer，1 μ、煙草RNA樣品，10 μL.此操作可在PCR儀中完成，70 ℃后立即置于冰上冰浴2～5 min.②依次加入下列試劑，AMV Reverse Transcriptase 2 μL、5*Reverse Transcriptase Buffer 5 μL、dNTP Mixture(10 mM each) 2 μL、ddH2O 5 μL.

3)cDNA擴增成煙草Mlo基因.以反轉錄獲得的cDNA為模板，利用設計的引物擴增煙草Mlo基因.

①上游引物(P1)：

CACGGATTAGCTAAAGGTTAGGGC

②下游引物(P2)：

GCTGAATTACTCCCAATCGGCATC

PCR反應體系(25 μL)如表1所示.

表1 PCR反應體系

PCR反應條件為：首先，94 ℃預變性5 min；其次，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min，獲得煙草Mlo基因的DNA序列.

4)煙草Mlo基因與T載體連接.擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后，用小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，回收的Mlo基因與pBLUE-T載體連接后由北京華大基因公司進行序列測定.

1.3.2 煙草Mlo基因反義表達載體構建.

1)PCR獲得Mlo基因的反義片段.在成功克隆到與預期大小一致的Mlo基因后，通過反義引物克隆Mlo基因的反義片段，進一步構建反義表達載體.設計如下2條反義引物，同時為了將其與植物表達載體pBI 121連接，設計引物時還引入了帶有保護堿基的酶切位點.

GCTCTAGAGTTAGCAGCAGCTTGTGGACAAC

畫線部分為Xba I酶切位點.

②下游引物：

CGGGATCCTGAGATCTGTGGAATCCATAG

畫線部分為BamH I酶切位點.

PCR反應體系(25 μL)如表2所示.

表2 PCR反應體系

擴增程序為:首先，94 ℃預變性5 min；其次，94 ℃變性45 s，58 ℃退火45，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min，獲得煙草Mlo基因的反義片段后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測反義片段是否擴增成功.

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2)反義片段測序.擴增出的反義片段經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后，用小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒將此片段回收后與pBLUE-T載體連接，命名為pBLUE-Mlo，由北京華大基因公司進行序列測定.

3)反義Mlo基因與pBI 121連接.利用限制性內切酶Xba I、BamH I分別對反義克隆載體pBLUE-Mlo及植物表達載體pBI l21進行37 ℃過夜雙酶切.酶切反應體系(20 μL)如表3、表4所示.

表3 反義pBLUE-Mlo雙酶切體系

表4 pBI 121雙酶切體系

將反義Mlo基因片段定向連接到植物表達載體pBI 121中，命名為pBI 121Mlo(14 ℃連接至少48 h)，連接體系(10 μL)如表5所示.

表5 反義Mlo與pBI 121連接體系

反義Mlo基因片段與表達載體pBI 121連接重組載體pBI 121Mlo的構建過程如圖1所示.

4)大腸桿菌轉化與反義表達載體的鑒定.將pBI 121-Mlo熱激法轉化大腸桿菌JM109，菌液涂布于含Kan的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)14～16 h.挑取培養(yǎng)基上的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用質粒提取試劑盒提取質粒.

圖1煙草反義表達載體構建過程

5)經(jīng)Kan選擇篩選出反義重組菌落，利用堿裂解法小量提取質粒進行電泳后，用BamH I和XBa I對質粒進行雙酶切，酶切后用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定是否反義表達載體pBI 121-Mlo構建成功.

2 結果與分析

2.1 煙草總RNA提取結果

通過GREENspspin多糖多酚類植物RNA快速提取試劑盒提取煙草的總RNA,并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取情況，電泳圖如圖2所示.

圖2 RNA電泳圖

由圖2可以看出，2個煙草樣品分別有RNA的28 s與18 s 2個條帶，說明其RNA提取是成功的.

2.2 煙草Mlo基因克隆結果

2.2.1 RT-PCR結果檢測.

將提取到的煙草RNA通過反轉錄得到煙草cDNA.利用設計的P1、P2引物經(jīng)PCR反應擴增目的片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，結果如圖3所示.

由圖3可知，擴增產(chǎn)物的目的片段均在1 000 bp左右，與預期結果951 bp較為符合.

2.2.2 PCR產(chǎn)物與T載體連接結果.

PCR產(chǎn)物與T載體連接結果如圖4所示.

圖3煙草Mlo基因RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖4基因片段與T載體連接圖

由圖4可知，樣品1、6、8、10、11比其他剩余的樣品分子量小，說明這5個樣品中載體沒與基因片段連接上，剩余的樣品已連接成功.

2.2.3Mlo基因擴增產(chǎn)物測序結果.

Mlo基因擴增產(chǎn)物測序結果如下，

由產(chǎn)物測序結果可知，其31～945處的堿基為煙草Mlo基因編碼的開放閱讀框(ORF)，大小為915 bp.下劃線部分別為上游和下游引物的位置，加粗部分分別為起始和終止密碼子.結果表明，從煙草中成功克隆到了與預期大小一致的Mlo基因.

利用上述獲得的Mlo基因，由Bioedit軟件得到Mlo基因的反義序列如下，

其中，引物A，帶有Xba I酶切位點，為，

GCTCTAGAGTTAGCAGCAGCTTGTGGACAAC

引物B，帶有BamH I酶切位點，為，

CGGGATCCTGAGATCTGTGGAATCCATAG

2.3 反義片段擴增結果

反義片段擴增結果如圖5所示.

1，2為反義擴增樣品

圖5反義片段擴增電泳圖

由圖5可知，樣品電泳片段大小在500～1 000 bp之間，由Bioedit軟件得到Mlo基因的反義序列大小是577 bp，表明反義片段擴增成功.切下擴增的條帶用小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，并與T載體進行連接，再測序.

2.4 反義片段載體連接結果

反儀片段載體連接結果如圖6所示.

圖6反義片段載體電泳圖

由圖6可知，除了第4、8、11以外，其他反義片段擴增成功.

2.5 反義片段測序結果

反義片段測序結果如下，下劃線部分為設計的反義引物.

2.6 構建反義表達載體雙酶切電泳結果

用已通過連接的pBI 121-Mlo熱激法轉化大腸桿菌JM109.經(jīng)Kan篩選出反義重組菌落，利用堿裂解法小量提取質粒后進行電泳鑒定，結果如圖7所示.

圖7反義表達載體雙酶切電泳圖

因為載體PBI 121和反義片段具有相同的酶切位點.由圖7可以看出，樣品1和樣品2分別產(chǎn)生了0.6 kb和2.4 kb的基因片段，說明目的片段成功插入PBI 121.此表明，煙草Mlo基因反義表達載體構建成功，圖7中PBI 121-Mlo為已構建成功的反義表達載體.

3 結 論

本研究以煙草的無菌苗葉片為材料，利用RT-PCR方法成功克隆了一個Mlo基因，同時，通過反義引物克隆Mlo基因的反義片段，測序后成功找到設計的反義片斷，并利用反義引物成功擴增了Mlo基因的反義片段.

反義片段與載體pBLUE-T連接后轉入大腸桿菌，Kan實驗提質粒后，用反義片段構建的pBI 121載體經(jīng)Bam HI和XBaI雙酶切，其電泳圖可以看見樣品分為0.6 kb和2.4 kb兩類大小的目的片段，說明插入成功，即成功構建了煙草Mlo基因反義表達載體.

利用反義RNA技術[10]獲得煙草Mlo基因的缺陷性植株的關鍵是獲取煙草反義Mlo基因.本研究從煙草葉片中提取總RNA，利用RT-PCR技術擴增得到Mlo基因的cDNA，并以此為模板，設計反義引物通過PCR擴增出反義Mlo基因.其中反義Mlo基因的長短選擇極為重要，因為反義Mlo基因過短可能無法起到抑制Mlo基因表達的作用，而過長則會給連接載體造成困難.對此，本研究選擇了長為577 bp的片段進行引物設計和反義序列擴增，以確保反義Mlo基因既能很好地與載體連接，又能抑制Mlo基因的表達.

由反義Mlo基因與植物表達載體pBI 121進行連接后的產(chǎn)物的雙酶切電泳鑒定結果可知，本研究已成功構建了煙草反義Mlo基因表達載體pBI 121-Mlo，并有望將攜帶反義Mlo基因的植物表達載體質粒導入根癌農桿菌，對煙草進行遺傳轉化研究，獲得該基因表達的缺陷型植株，進而研究其在煙草抗病方面的負調控作用.

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[2]鄔曉勇,孫雁霞,何鋼,等.一個玉米Mlo基因的電子克隆與生物信息學分析[J].玉米科學,2011,19(1):148-152.

[3]李凡,胡東維,陳鋒,等.小麥TaMlo基因的原核表達、抗體制備及細胞化學分析(簡報)[J].分子細胞生物學報,2005,38(6):550-553.

[4]羅臻,張敬澤,胡東維.大麥Mlo近等基因系與葉枯病菌互作的細胞學研究[J].植物病理學報,2009,39(1):362.

[5]Devoto A,Hartmann H A，Piffanelli P，et al.Molecularphylogenyandevolutionoftheplantspecificseven-transmembraneMolfamily[J].J Mol Evol,2003,56(1):77-88．

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ConstructionofTobaccoAnti-senseMloGeneExpressionVector

WUXiaoyong,SHIYujie,LIJie,LUOQian,WANGYuehua,TANGYuan,SUNYanxia

(School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

Tobacco anti-senseMlogene plant expression vector PBI 121-Mlowas constructed not only for tobacco genetic transformation,but also to lay the foundation for the defective plant gene expression.Total RNA was extracted from tobacco leaves and the cDNA ofMlowas obtained by PT-PCR amplification.The cDNA was served as a template to amplify the anti-senseMlogene by the anti-sense primers.Then the anti-senseMlogene was connected with T vector and sequenced and then the anti-sense fragment was connected to the plant expression vector named pBI 121.The plant expression vector of the tobacco anti-senseMlonamed pBI121-Mlowas constructed.The recombinant bacteria were selected through Kanamycin and a few plasmids were extracted by alkaline lysis method.The plasmid was identified by electrophoresis after double digestion by Xba I and BamH I.The results illustrated that the target gene was successfully connected to the plant expression vector pBI 121.The genetic expression vector named pBI 121-Mloof tobacco anti-senseMlowas constructed.

Mlogene;pBI 121-Mlo；RT-PCR；anti-sense fragment;double digestion

S572.032

A

1004-5422(2017)04-0333-05

2017-09-09.

成都大學藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室開放基金(10Y201409)資助項目.

鄔曉勇(1975 — )，男，博士，副教授，從事植物天然產(chǎn)物研究.