經(jīng)后增殖方含藥血清對(duì)超排卵大鼠卵巢COCs及CCs中GDF9與Bim表達(dá)的影響*

楊 貞，郭新宇，劉佳子，鄧偉民，張金玉

(1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 510010；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣州 510405；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，廣東汕頭 515041)

論著·基礎(chǔ)研究

經(jīng)后增殖方含藥血清對(duì)超排卵大鼠卵巢COCs及CCs中GDF9與Bim表達(dá)的影響*

楊 貞1，2，郭新宇1△，劉佳子3，鄧偉民1，張金玉1

(1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣州 510010；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣州 510405；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，廣東汕頭 515041)

目的觀察經(jīng)后增殖方含藥血清對(duì)超排卵大鼠卵巢的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)及卵丘細(xì)胞(CCs)中生長(zhǎng)分化因子9(GDF9)及Bim表達(dá)的影響，探討其治療效果及作用機(jī)制。方法制備大鼠超排卵卵巢模型，收集COCs和CCs，分別與雌性SD超排卵大鼠空白血清和經(jīng)后增殖方藥物血清在體外共同培養(yǎng)，各分3組：空白血清組(空白組)、含藥血清組(對(duì)照組)、含藥血清+GDF9受體阻斷劑組(實(shí)驗(yàn)組)，共6組。24 h后收集COCs和CCs，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GDF9和Bim mRNA表達(dá)水平，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)GDF9蛋白表達(dá)水平。結(jié)果(1)對(duì)照組COCs中GDF9 mRNA表達(dá)水平明顯高于空白組和實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組COCs中Bim mRNA表達(dá)水平均明顯低于空白組(P<0.05)；對(duì)照組COCs中GDF9蛋白表達(dá)水平明顯高于空白組(P<0.05)，亦高于實(shí)驗(yàn)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)CCs中GDF9 mRNA表達(dá)水平在3組間的差異性比較結(jié)果與COCs中一致；對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組CCs中Bim mRNA表達(dá)水平均明顯低于空白組(P<0.05)；對(duì)照組CCs中Bim mRNA表達(dá)水平明顯低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；對(duì)照組CCs中GDF9蛋白表達(dá)水平明顯高于空白組和實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。(3)對(duì)照組COCs中GDF9 mRNA表達(dá)水平明顯高于CCs中(P<0.05)，其余組內(nèi)COSs和CCs比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論經(jīng)后增殖方含藥血清能提高COCs和CCs中GDF9的表達(dá)水平，維持COCs和CCs中Bim的低水平表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)卵泡發(fā)育；COCs較剔除卵母細(xì)胞的CCs更有利于GDF9 mRNA的表達(dá)。

經(jīng)后增殖方；超排卵；卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體；卵丘細(xì)胞；生長(zhǎng)分化因子9；Bim

控制性超排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)是體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)周期中的重要環(huán)節(jié)，常用方案為先使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)，然后用促性腺激素刺激卵巢，使多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育，從而同時(shí)獲取多個(gè)卵子進(jìn)行體外受精，有別于自然周期的單卵排卵。已有研究證實(shí)超排卵可能損傷卵細(xì)胞染色體的結(jié)構(gòu)和功能，影響胚胎的基因表達(dá)，從而降低胚胎的著床潛能[1]，導(dǎo)致胚胎著床率和妊娠率顯著下降[2]。中醫(yī)藥介入IVF-ET周期收效顯著，本課題組前期研究證實(shí)益氣血補(bǔ)肝腎中藥能提高胚胎移植成功率和妊娠率[3]。本研究提取COH大鼠卵巢中卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)和卵丘細(xì)胞(cumulus cells，CCs)，加入經(jīng)后增殖方含藥血清進(jìn)行體外培養(yǎng)，檢測(cè)COCs和CCs中生長(zhǎng)分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF9)和Bim的表達(dá)水平，探討益氣血中藥對(duì)提高IVF-ET周期卵泡質(zhì)量的效果及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD雌性大鼠42只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量180～220 g，由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號(hào)：44007200031374，44002100009700)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段，自然光照，自由取水和攝食，以陰道脫落細(xì)胞涂片檢查動(dòng)情周期。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品 醋酸曲普瑞林(GnRHa，瑞士輝凌公司，商品：名達(dá)必佳，批號(hào)：K18565B)；孕馬血清促性腺激素(PMSG，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBP4544V)；人絨毛膜促性腺激素(HCG，麗珠藥業(yè)有限公司，批號(hào)：160201)；經(jīng)后增殖方(顆粒劑，每袋10 g，廣東一方制藥有限公司，批號(hào)：Q1511004)，每袋相當(dāng)于生藥：黨參15 g,白術(shù)12 g,茯苓12 g,甘草6 g,熟地黃12 g,白芍12 g,當(dāng)歸6 g,川芎6 g,菟絲子15 g,鹿角霜20 g,杜仲15 g,山萸肉10 g,川椒3 g。

1.1.3主要儀器與試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)DBI公司，批號(hào)：DBI-2220)，熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Genecopoeia公司，批號(hào)：AOPR-1200)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(杭州弗德生物，批號(hào)：FD2001)，山羊抗大鼠GDF-9抗體(美國(guó)Santa公司，批號(hào)：sc-12244)，小鼠抗大鼠β-actin抗體(北京博奧森，批號(hào)：Bsm-33036M)，熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)：7500)。

1.2方法

1.2.1含藥血清的制備及滅活 12只雌性大鼠連續(xù)觀察2個(gè)動(dòng)情周期均正常，隨機(jī)分為含藥血清組和空白血清組，每組6只。陰道涂片為動(dòng)情后期(動(dòng)情周期第3天)，兩組大鼠均于每日上午9時(shí)腹腔注射GnRHa 2.0 μg/100 g，連續(xù)7 d，第7天同時(shí)注射PMSG 40 IU/100 g，48 h后注射HCG 100 IU/100 g。從第1天注射GnRHa開(kāi)始，同時(shí)含藥血清組大鼠每日上午9時(shí)給予經(jīng)后增殖方4.5 g/kg(相當(dāng)于3倍臨床等效劑量)，空白血清組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，至注射HCG日，共9 d。第9天灌胃及注射HCG后1.5 h，腹腔注射10%水合氯醛4.0 mL/kg，深入麻醉大鼠后腹主動(dòng)脈取血。將各組血液置于4 ℃放置2 h，3 000 r/min離心20 min，取上清液，56 ℃ 30 min滅活，用0.22 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾除菌，同組血清混勻分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2COCs和CCs的制備 30只雌性大鼠連續(xù)觀察2個(gè)動(dòng)情周期均正常。陰道涂片為動(dòng)情后期(動(dòng)情周期第3天)，于每日上午9時(shí)腹腔注射GnRHa 2.0 μg/100 g，連續(xù)7 d，第7天同時(shí)注射PMSG 40 IU/100 g，48 h后注射HCG 100 IU/100 g，2 h后頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下快速取出小鼠雙側(cè)卵巢，37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)過(guò)夜預(yù)熱的M199培養(yǎng)液中洗3次，37 ℃恒溫板上，立體顯微鏡下，10 mL注射器吸取大卵泡中的COCs，選取形態(tài)良好的COCs。(1)取一半COCs置于M199培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司)中，37 ℃ 5% CO2孵箱暫存?zhèn)溆谩?2)另一半COCs置于0.1%透明質(zhì)酸酶(美國(guó)Sigma公司)中，用一次性注射針頭刺破卵泡，使CCs釋放入培養(yǎng)液中，并輕輕吹打，使其分散成單個(gè)細(xì)胞，加入M199培養(yǎng)液終止消化，200目一次性細(xì)胞篩過(guò)濾。將含CCs的培養(yǎng)液收集在離心管中，以1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，培養(yǎng)液洗2次后，加一定量的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞存活數(shù)大于85%，M199培養(yǎng)液將CCs懸液調(diào)整為1×106cells/mL的單細(xì)胞懸液備用。

1.2.3COCs和CCs的培養(yǎng) 將COCs和CCs分別隨機(jī)種入已用0.05% L-多聚賴(lài)氨酸涂布的6孔培養(yǎng)板中，COCs和CCs各隨機(jī)分為3組，每組3個(gè)復(fù)孔，加入大鼠血清及青鏈霉素雙抗(美國(guó)Gibco公司)，形成含10%大鼠血清[各組分別加入空白血清(空白組)，含藥血清(對(duì)照組)，含藥血清+GDF9受體阻斷劑(實(shí)驗(yàn)組，GDF9受體阻斷劑為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品)]、1%雙抗的M199培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞待測(cè)。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)GDF9 mRNA和Bim mRNA的表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。GDF9上游引物序列：5′-GCA GAT TCC TGT TGG GGG TT-3′，下游引物序列：5′-TAC AGG CAA CAG CAA GGA CC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度100 bp；Bim上游引物序列：5′-AGA GAT ACG GAT CGC ACA GG-3′，下游引物序列：5′-GTC TTC CGC CTC TCG GTA AT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度100 bp；內(nèi)參β-actin上游引物序列：5′-AGT TCA ACG GCA CAG TCA AG-3′，下游引物序列：5′-TAC TCA GCA CCA GCA TCA CC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度118 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 35 s，退火、變性、延伸，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)各組樣品的Ct值(Ct值為熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù))，以β-actin進(jìn)行參照，折算出各樣品起始模板數(shù)的相對(duì)數(shù)量關(guān)系。計(jì)算公式：目的基因的相對(duì)量以2-ΔΔCt值表示，ΔΔCt=[Ct(待測(cè)樣品目的基因)-Ct(待測(cè)樣品內(nèi)參基因)]-[Ct(對(duì)照組樣品目的基因)-Ct(對(duì)照組樣品內(nèi)參基因)]。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)GDF9蛋白的表達(dá) 提取大鼠COCs和CCs總蛋白液。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白水平后，各組樣品分別取60 μg蛋白，加適量5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣，濃縮膠電壓75 V，分離膠電壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即終止電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5%脫脂奶粉(含0.5% TBST)封閉1 h。加入用TBST溶解的5%脫脂牛奶稀釋的一抗(山羊抗大鼠GDF-9抗體1∶500，小鼠抗大鼠β-actin抗體1∶2 000)，4 ℃過(guò)夜；用TBST在室溫下洗3次，每次5 min；加入用TBST溶解的5%脫脂牛奶稀釋的二抗[辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-兔抗山羊IgG抗體1∶1 000，HRP-山羊抗小鼠IgG抗體1∶5 000)，室溫下孵育30 min后，用TBST室溫下洗3次，每次5 min。采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯影曝光。X線(xiàn)片曝光顯影。采用Image J軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的吸光度值(A值)。以GDF9/β-actin的相對(duì)A值表示結(jié)果。

A：Bim mRNA；B：GDF9 mRNA；C：GDF9蛋白；①：空白組；②：對(duì)照組；③：實(shí)驗(yàn)組

圖1 COCs和CCs中Bim mRNA、GDF9 mRNA和GDF9蛋白相對(duì)表達(dá)水平表1 COCs和CCs中Bim mRNA、GDF9 mRNA及GDF9蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

*：P<0.05，與空白組COCs比較；#：P<0.05，與空白組CCs比較；△:P<0.05，與實(shí)驗(yàn)組COCs組比較；▽?zhuān)篜<0.05，與實(shí)驗(yàn)組CCs比較；▲：P<0.05，與同組COCs比較

2 結(jié) 果

2.1COCs和CCs中Bim mRNA相對(duì)表達(dá)水平 熔解曲線(xiàn)均呈單峰分布，無(wú)基因組DNA的非特異擴(kuò)增。(1)COCs中：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Bim mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯低于空白組(P<0.05)，對(duì)照組Bim mRNA相對(duì)表達(dá)水平低于實(shí)驗(yàn)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；(2)CCs中：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Bim mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯低于空白組(P<0.05)，對(duì)照組Bim mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；(3)各組COCs中Bim mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于相對(duì)應(yīng)各組CCs中Bim mRNA相對(duì)表達(dá)水平，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1A、表1。

2.2COCs和CCs中GDF9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 熔解曲線(xiàn)均呈單峰分布，無(wú)基因組DNA的非特異擴(kuò)增。(1)COCs中：對(duì)照組GDF9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于空白組和實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；(2)CCs中：對(duì)照組GDF9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于空白組和實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；(3)各組COCs中GDF9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于相對(duì)應(yīng)各組CCs中，其中對(duì)照組COCs和CCs中GDF9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白組、實(shí)驗(yàn)組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1B、表1。

2.3COCs和CCs中GDF9蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 (1)COCs中：對(duì)照組GDF9蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯高于空白組(P<0.05)，亦高于實(shí)驗(yàn)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；(2)CCs中：對(duì)照組GDF9蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯高于空白組和實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；(3)各組COCs中GDF9蛋白相對(duì)表達(dá)水平與相對(duì)應(yīng)各組CCs中比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1C、圖2、表1。

①：空白組CCs；②：對(duì)照組CCs；③：實(shí)驗(yàn)組CCs；④：空白組COCs；⑤：對(duì)照組COCs；⑥：實(shí)驗(yàn)組COCs

圖2 COCs和CCs中GDF9蛋白表達(dá)電泳圖

3 討 論

COCs是哺乳動(dòng)物卵巢的基本功能單位，包括一個(gè)卵母細(xì)胞和圍繞其周?chē)腃Cs。CCs與卵母細(xì)胞關(guān)系密切，CCs直接影響卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟，進(jìn)而影響胚胎的質(zhì)量，而卵母細(xì)胞也可以通過(guò)分泌卵細(xì)胞分泌因子(oocyte secreted factors，OSFs)來(lái)調(diào)節(jié)CCs的生長(zhǎng)分化，在卵母細(xì)胞的成熟過(guò)程中，二者相互影響，缺一不可[4]。近年來(lái)通過(guò)卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞重建卵泡的研究提示，卵母細(xì)胞在調(diào)控卵泡發(fā)育中起主導(dǎo)作用，OSFs通過(guò)旁分泌作用促進(jìn)卵泡的形成，卵丘擴(kuò)張及某些代謝過(guò)程，同時(shí)OSFs被證實(shí)具有維持CCs低凋亡率的作用，而CCs保持良好生物學(xué)活性是卵細(xì)胞質(zhì)量的保證[5-6]。

作為其中一種OSFs，GDF9是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員，其表達(dá)可見(jiàn)于早期初級(jí)卵泡階段，對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖、分化、排卵及黃素化起調(diào)控作用，與卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育關(guān)系密切，是卵泡發(fā)育的重要因子，并可能與胚胎發(fā)育有關(guān)，卵泡液中的GDF9水平高低可以預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量[7-10]。因此，最近的一些研究已經(jīng)把GDF9列為評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量及其發(fā)育潛能的重要指標(biāo)[11-12]。顆粒細(xì)胞的凋亡促進(jìn)卵泡閉鎖，使卵泡無(wú)法回到正常的發(fā)育軌道[13]。目前已經(jīng)闡明有兩條凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑：(1)外源性死亡受體途徑，由Fas/TNF2A通路激發(fā)；(2)內(nèi)源性線(xiàn)粒體途徑，由Bcl-2基因家族激發(fā)[14]。Bim是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員，在機(jī)體多種組織包括生殖細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)[15]，在凋亡的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)上具有重要的作用。不同的Bim異構(gòu)體可通過(guò)直接激活Bax蛋白，或通過(guò)抑制Bcl-2的抗凋亡活性間接激活Bax/Bak引起線(xiàn)粒體途徑的細(xì)胞凋亡。因此其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是一種重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白[16]。因此，本研究選取GDF9和Bim作為檢測(cè)指標(biāo)，觀察具有益氣血作用的經(jīng)后增殖方對(duì)卵泡發(fā)育的作用機(jī)制。

中醫(yī)學(xué)的“腎氣-天癸-沖任”生殖軸與西醫(yī)學(xué)的“下丘腦-垂體-卵巢”性腺軸相對(duì)應(yīng)。中醫(yī)認(rèn)為，受孕的機(jī)理在于腎氣充，天癸至，沖任調(diào)和，精血津液充沛。不孕主要與腎氣不足，沖任氣血虧虛有關(guān)。因此在治療上通常以補(bǔ)腎、益氣、養(yǎng)血為主。本研究所用經(jīng)后增殖方由《太平惠民和劑局方》之八珍湯加減演化而來(lái)，方中四君子湯(黨參、白術(shù)、茯苓、甘草)健脾益氣；四物湯(熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎)補(bǔ)血活血；另加補(bǔ)腎精血之山萸肉，陰陽(yáng)并補(bǔ)之菟絲子，兩藥同用有養(yǎng)精種子之效；鹿角霜、杜仲、川椒溫陽(yáng)暖宮。全方使氣血雙補(bǔ)，氣生血長(zhǎng)，又得腎陽(yáng)溫煦，胎孕易成。筆者早前的臨床觀察表明該方在卵泡期可能通過(guò)增強(qiáng)“下丘腦-垂體-卵巢”性腺軸的調(diào)理功能，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量，促進(jìn)卵泡發(fā)育，增強(qiáng)胚胎著床潛能，提高胚胎的種植率[3]。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組COCs和CCs中GDF9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于空白組(P<0.05)，說(shuō)明經(jīng)后增殖方含藥血清能顯著提高GDF9 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，從而對(duì)抗細(xì)胞凋亡，促進(jìn)卵泡發(fā)育；加入GDF9受體阻斷劑能阻斷含藥血清對(duì)GDF9表達(dá)的影響(P<0.05)。而對(duì)照組COCs中GDF9 mRNA表達(dá)水平明顯高于CCs中(P<0.05)，說(shuō)明經(jīng)后增殖方含藥血清有助于卵母細(xì)胞和CCs之間的相互影響，促進(jìn)卵母細(xì)胞分泌GDF9 mRNA，二者相互依存，相互促進(jìn)。剔除了卵母細(xì)胞，GDF9 mRNA的表達(dá)顯著下降，CCs的功能將受到明顯影響。經(jīng)后增殖方含藥血清能明顯抑制COCs和CCs中Bim基因的表達(dá)(P<0.05)，而在加入含藥血清的同時(shí)加入了GDF9受體阻斷劑，COCs和CCs中Bim基因的表達(dá)水平仍然受到明顯抑制(P<0.05)，說(shuō)明GDF9受體阻斷劑能特異性阻斷GDF9受體的作用，但對(duì)Bim并無(wú)直接影響，因此經(jīng)后增殖方含藥血清仍能發(fā)揮對(duì)Bim表達(dá)的抑制作用。然而該水平仍高于未加入GDF9受體阻斷劑的含藥血清組(P<0.05)，說(shuō)明加入GDF9受體阻斷劑，GDF9的表達(dá)明顯降低，能間接影響經(jīng)后增殖方含藥血清對(duì)Bim基因表達(dá)的抑制作用，從而無(wú)法維持Bim表達(dá)的低水平。

綜上所述，具有益氣血作用的經(jīng)后增殖方能通過(guò)促進(jìn)GDF9的分泌，維持超排卵大鼠CCs和卵母細(xì)胞的功能及其相互之間的促進(jìn)作用，有利于卵泡的發(fā)育，提高卵泡質(zhì)量；GDF9具有維持CCs中Bim低水平表達(dá)的作用。而經(jīng)后增殖方提高GDF9表達(dá)水平的具體作用通路有待進(jìn)一步研究。

[1]Meng QX，Gao HJ，Xu CM，et al．Reduced expression and function of aquaporin-3 in mouse metaphase-II oocytes induced by controlled ovarian hyperstimulation were associated with subsequent low fertilization rate[J]．Cell Physiol Biochem，2008，21(1/2/3)：123-128.

[2]李培旭，李尚為，彭芝蘭，等．超排卵對(duì)小鼠胚胎著床潛能的影響[J]．實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2007，23(4)：232-234．

[3]鄧偉民，邵玉，張金玉，等．中藥益氣血補(bǔ)肝腎法對(duì)輔助生育胚胎種植率的影響[J]．廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25(2)：106-109．

[4]Eppig JJ，Wigglesworth K，Pendola FL．The mammalian oocyte orchestrates the rate of ovarian follicular development[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(5)：2890-2894.

[5]Su YQ，Sugiura K，Wigglesworth K，et al．Oocyte regulation of metabolic cooperativity between mouse cumulus cells and oocytes:BMP15 and GDF9 control cholesterol biosynthesis in cumulus cells[J]．Development，2008，135(1)：111-121.

[6]Hussein TS，F(xiàn)roiland DA，Amato F，et al．Oocytes prevent cumulus cell apoptosis by maintaining a morphogenic paracrine gradient of bone morphogenetic proteins[J]．J Cell Sci，2005，118(Pt 22)：5257-5268.

[7]Gilchrist RB，Lane M，Thompson JG．Oocyte-secreted factors:regulators of cumulus cell function and oocyte quality[J]．Hum Reprod Update，2008，14(2)：159-177.

[8]Regassa A，Rings F，Hoelker M，et al．Transcriptome dynamics and molecular cross-talk between bovine oocyte and its companion cumulus cells[J]．BMC Genomics，2011，12：57.

[9]Assou S，Haouzi D，De Vos J，et al．Human cumulus cells as biomarkers for embryo and pregnancy outcomes[J]．Mol Hum Reprod，2010，16(8)：531-538.

[10]Yeo CX，Gilchrist RB，Thompson JG．Exogenous growth differentiation factor 9 in oocyte maturation media enhances subsequent embryo development and fetal viability in mice[J]．Human Reproduction，2008，23(1)：67-73.

[11]Yang JL，Zhang CP，Li L，et al．Testosterone induces redistribution of forkhead Box-3a and Down-Regulation of growth and differentiation factor 9 messenger ribonucleic acid expression at early stage of mouse folliculogenesis[J]．Endocrinology，2010，151(2)：774-782.

[12]Sanchez F，Adriaenssens T，Romero S，et al．Quantification of oocyte-specific transcripts in follicle-enclosed oocytes during antral development and maturation in vitro[J]．Mol Hum Reprod，2009，15(9)：539-550.

[13]金艷梅．顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡發(fā)育的影響[J]．中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,37(8):69-72.

[14]Riedl SJ，Shi Y．Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis[J]．Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5(11):897-907.

[15]Sionov RV，Vlahopoulos SA，Granot Z．Regulation of bim in health and disease[J]．Oncotarget，2015，6(27)：23058-23134.

[16]Puthalakath H，Strasser A．Keeping killers on a tight leash:transcriptional and post-translational control of the pro-apoptotic activity of BH3-only proteins[J]．Cell Death Differ，2002，9(5)：505-512.

EffectofserumcontainingJinghouZengzhiRecipeonexpressionofGDF9andBiminovarianCOCsandCCsincontrolledovarianhyperstimulationrats*

YangZhen1，2，GuoXinyu1△，LiuJiazi3，DengWeimin1，ZhangJinyu1

(1.ReproductiveMedicineCenter,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryRegion,Guangzhou,Guangdong510010,China；2.GraduateSchool,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510405,China；3.DepartmentofRehabilitation,FirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou,Guangdong515041,China)

ObjectiveTo observe the effects of serum containing Jinghou Zengzhi Recipe (JHZZ) on the expression of growth differentiation factor 9 (GDF9) and Bim in cumulus-oocyte complexes (COCs) and cumulus cells (CCs) of controlled ovarian hyperstimulation (COH) rats,and to investigate its curative effect and mechanism.MethodsThe rat COH ovarian model was prepared for collecting COCs and CCs,which were respectively co-cultured in vitro with the blank serum of female COH SD rat and serum containing JHZZ,and the each group was divided into 3 subgroups:the blank serum group (blank group),serum containing JHZZ group (control group) and serum containing JHZZ plus GDF9 receptor blocker group (experimental group),total 6 subgroups.COCs and CCs were collected after 24 h.The expression levels of GDF9 and Bim mRNA were detected by real-time quantitative PCR.The GDF9 protein expression levels were detected by Western blot.Results(1) The expression level of GDF9 mRNA in control group COCs was obviously higher than that in the control group and experiment group COCs (P<0.05);the Bim mRNA expression level in COCs of control group and experiment group was significantly lower than that in COCs of blank group (P<0.05);the GDF9 protein expression level in the control group COCs was significantly higher than that in the blank group COCs (P<0.05),and also higher than that in the experiment group COCs,but the difference was not statistically significant (P>0.05).(2)The comparison results of GDF9 mRNA expression level in CCs among 3 groups were consistent with those in COCs;the Bim mRNA expression level in CCs of control group and experimental group was significantly lower than that in the blank group (P<0.05);the Bim mRNA expression level in the control group CCs was significantly lower than that in the experimental group CCs(P<0.05);the GDF9 protein expression level in the control group CCs was significantly higher than that in the blank group and experimental group CCs (P<0.05).(3)The GDF9 mRNA expression level in the control group COCs was significantly higher than that in CCs (P<0.05),and the other inter-group comparisons between COSs and CCs had no statistical difference (P>0.05).ConclusionSerum containing JHZZ can increase the GDF9 expression level in COCs and CCs,maintain the low expression of Bim in COCs and CCs,inhibit the ovarian cells apoptosis and promote the follicular development;COCs is more conducive to the expression of GDF9 mRNA compared with CCs eliminating oocyte.

Jinghou Zengzhi Recipe；superovulation；cumulus-oocyte complexes；cumulus cells；growth differentiation factor 9；Bim

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.004

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81403249)。

楊貞(1988-)，在讀博士，主要從事婦科生殖醫(yī)學(xué)方面研究?！?/p>

，E-mail：iris92@126.com。

R285.5

A

1671-8348(2017)35-4908-04

2017-06-25

2017-09-21)