香砂六君丸對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟線粒體的影響

婁林潔，游艷婷，馬柯，陳澤偉，孫曉敏，周琳

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中醫(yī)科，浙江 溫州 325015；2.南方醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州 510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510515）

香砂六君丸對非酒精性脂肪肝大鼠肝臟線粒體的影響

婁林潔1，游艷婷2，馬柯2，陳澤偉2，孫曉敏2，周琳3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中醫(yī)科，浙江 溫州 325015；2.南方醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州 510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510515）

目的：研究香砂六君丸對非酒精性脂肪肝大鼠模型肝臟組織內(nèi)線粒體的影響。方法：24只正常成年雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組和治療組。采用高脂飼料喂養(yǎng)法來制作非酒精性脂肪肝大鼠模型，給予香砂六君丸（1.35 g·kg-1·d-1）灌胃4周治療后取材。檢測各組大鼠的體質(zhì)量、肝臟濕重、肝臟HE染色結(jié)果、血液生化指標(biāo)。用Real time PCR法、紫外分光光度計法對肝臟組織線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)、線粒體復(fù)合物I、IV活性的變化進行測定。結(jié)果：與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟濕重和質(zhì)量指數(shù)（肝臟濕重/體質(zhì)量）顯著升高，血清總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平明顯升高，肝臟組織mtDNA顯著降低，肝臟組織線粒體復(fù)合物I、IV活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。與模型組大鼠相比，治療組大鼠肝臟濕重和質(zhì)量指數(shù)顯著降低，血清TC和LDL-C水平明顯降低，肝臟組織mtDNA顯著升高，肝臟組織線粒體復(fù)合物I、IV活性顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。肝臟HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠肝細胞出現(xiàn)大量脂肪空泡，細胞核固縮；治療組大鼠肝細胞出現(xiàn)脂肪空泡量顯著減少，細胞核固縮情況減輕。結(jié)論：香砂六君丸可能通過調(diào)節(jié)mtDNA拷貝數(shù)與呼吸鏈酶復(fù)合物活性對非酒精性脂肪肝起到治療作用。

非酒精性脂肪肝；香砂六君丸；線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物；DNA，線粒體

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們的飲食與生活習(xí)慣也隨之改變。非健康的飲食會引起非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)生[1]。現(xiàn)如今，NAFLD已經(jīng)逐漸成為發(fā)病率最高的肝臟疾病之一，吡咯列酮、羅格列酮等噻唑烷二酮類胰島素增敏劑為臨床NAFLD經(jīng)典用藥，但該類藥物具有潛在的不良反應(yīng)，如體質(zhì)量的增加以及心血管病風(fēng)險的增加以及停藥以后肝酶的反彈等。中醫(yī)藥防治NAFLD積累了豐富的經(jīng)驗。其中，香砂六君丸為補脾益氣，燥濕化痰的代表方劑，對NAFLD有較好療效，但其治療機制尚未完全闡明[2]。線粒體為細胞內(nèi)氧化呼吸與產(chǎn)能的主要場所，通過氧化磷酸化過程提供維持正常生理活動的能量，NAFLD誘導(dǎo)的線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）過量產(chǎn)生并激活蛋白激酶C、己糖胺和多元醇等途徑是糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的共同機制[3]。因此，本研究通過香砂六君丸治療NAFLD大鼠，觀察大鼠肝臟組織線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷貝數(shù)與呼吸鏈復(fù)合體表達的改變，探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠24只，8周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購于廣東省實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（粵）2013-0002，飼養(yǎng)于廣州體育科學(xué)研究所實驗動物中心SPF級動物房，實驗過程符合廣州體育科學(xué)研究所動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。自由攝食與飲水，溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，每天光照與黑夜時間各為12 h。

1.2 主要試劑與儀器 香砂六君丸濃縮丸購自河南仲景宛西制藥股份有限公司；AU5800全自動生化分析儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Blood＆Cell Culture mini Kit試劑盒購自德國Qiagen公司；PCR引物購自南京金斯瑞生物科技有限公司；線粒體復(fù)合物I和IV的相關(guān)試劑均購自美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒與ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自美國Thermo公司；CFX-96熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；特氟龍組織研磨器購自美國Wheaton公司；全波長多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模及給藥：24只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分成3組：正常對照組、模型組和治療組，每組8只。模型組與治療組采用高脂飼料（80%基礎(chǔ)飼料、18%豬油和2%膽固醇）喂養(yǎng)來制作NAFLD大鼠模型[3]。8周后，治療組給予香砂六君丸濃縮丸，以劑量1.35 g·kg-1·d-1（按照人體等效劑量計算并結(jié)合預(yù)實驗）連續(xù)灌胃4周；正常對照組與模型組予以等體積的溶媒，連續(xù)灌胃4周。實驗結(jié)束后麻醉處死大鼠，取肝臟組織標(biāo)本。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測：10%水合氯醛（0.5 mL·kg-1）麻醉大鼠后，腹腔腹主靜脈取全血6 mL，分別注入肝素抗凝管6 mL，迅速混勻，低溫離心（3 000 r/min）后上機檢測。

1.3.3 肝臟組織病理變化檢測：將新鮮肝臟組織在冰磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中反復(fù)洗滌，在4%中性甲醛溶液（pH 7.4）中固定，乙醇梯度脫水，切片，HE染色，觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.4 Real time PCR檢測肝臟組織mtDNA拷貝數(shù)的表達量：取大鼠肝臟組織，Blood＆Cell Culture mini Kit提取肝臟組織總DNA，測定濃度后調(diào)整成一致濃度，選取線粒體基因編碼ND1為目的基因，核基因編碼的β-actin為內(nèi)參基因，ND1基因（正向序列：5’-ATTCTAGCCACAAGTCTTT-3’，反向序列：5’-GGAGGACGGATAAGAGGATAAT-3’）與β-actin基因（正向序列：5’-GAAATCGTGCGTGATTAAAG-3’，反正向序列：5’-ATCGGAACCGCTCATTG-3’）是通過NCBI全序列設(shè)計。擴增反應(yīng)體系：10 μL SYBR Green Supermix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，DNA模板2 μL，ddH2O為7 μL。PCR儀中Real time PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，39個循環(huán)。根據(jù)NTC反應(yīng)有無熒光信號檢出，并結(jié)合熔解曲線確認反應(yīng)體系是否有污染。以β-actin為內(nèi)參，計算樣品中mtDNA的相對表達量。

1.3.5 線粒體的提?。壕€粒體提取方法參照文獻[4]：剪取加入組織凍存液凍存的肝臟組織約2 g，組織復(fù)蘇液快速解凍組織（體積比為1∶4）。 4 ℃條件下勻漿棒反復(fù)勻漿50次，差速離心法提取線粒體，最后的沉淀使用預(yù)冷的線粒體緩沖液重懸，即為粗提取的線粒體。

1.3.6 復(fù)合物酶活性測定：采用BCA法檢測線粒體濃度，調(diào)成一致濃度后液氮反復(fù)凍融3次，破碎線粒體。根據(jù)文獻[5]配制復(fù)合物體系I和IV，使用紫外分光光度計分別在340 nm和550 nm條件下進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 使用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以 ±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 正常組大鼠體格健壯、反應(yīng)與行動迅速敏捷、被毛光澤緊密。高脂飲食8周的大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量增加、活動減少精神狀態(tài)疲乏、皮毛枯黃，與正常對照組大鼠體質(zhì)量相比，模型組大鼠體質(zhì)量顯著升高（F=8.892，P＜0.01）符合NAFLD大鼠的形態(tài)表現(xiàn)，提示大鼠模型造模成功。與模型組大鼠比較，治療組大鼠體質(zhì)量有一定程度的降低（F=11.332，P＜0.01），反應(yīng)力與活動情況有所改善，被毛光澤度增加。見表1。

2.2 香砂六君子丸對NAFLD大鼠肝臟質(zhì)量的影響與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟組織濕重增加，并且相應(yīng)質(zhì)量指數(shù)（肝臟濕重/體質(zhì)量）也顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.371、9.164，P＜0.01）。較模型組，治療組大鼠體質(zhì)量與肝臟濕重增加情況均顯著減輕，并且相應(yīng)質(zhì)量指數(shù)也顯著降低（F=13.668、11.032，P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠體質(zhì)量、肝臟濕重和質(zhì)量指數(shù)比較（n=8，±s）

2.3 香砂六君子丸對NAFLD大鼠血清生化指標(biāo)的影響 造模后第12周時，大鼠血清生化檢測結(jié)果顯示，模型組血清總膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平明顯高于正常對照組（F=6.917、8.332，P＜0.05）；而甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、葡萄糖（glucose）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）在2組大鼠間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比，治療組大鼠血清TC和LDL-C水平明顯降低（F=9.362、11.733，P＜0.05），而TG、HDL-C、glucose、AST、ALT在2組大鼠間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組大鼠血清生化指標(biāo)比較（n=8， ±s）

2.4 香砂六君子丸對NAFLD大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響 肝臟組織HE染色后光鏡下觀察：正常對照組大鼠肝小葉和肝細胞結(jié)構(gòu)正常，肝細胞排列整齊，無腫脹和脂肪變性，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠與正常對照組比，肝臟脂肪變性明顯，肝細胞間呈現(xiàn)大量脂肪滴，部分肝細胞呈氣球樣變，而治療組大鼠較模型組肝細胞脂肪滴及氣球樣變減少，無明顯炎性細胞浸潤，細胞結(jié)構(gòu)趨于正常，見圖1。

2.5 香砂六君子丸對NAFLD大鼠肝臟mtDNA拷貝數(shù)的影響 與正常對照組（1.001±0.080）相比，模型組大鼠肝臟組織mtDNA拷貝數(shù)（0.669±0.069）顯著降低（F=10.171，P＜0.01），治療組較模型組大鼠mtDNA拷貝數(shù)（0.864±0.065）顯著升高（F=8.221，P＜0.01）。

圖1 3組大鼠肝臟HE染色結(jié)果（×200）

2.6 香砂六君子丸對NAFLD大鼠肝臟線粒體復(fù)合物活性的影響 模型組大鼠肝臟組織線粒體內(nèi)復(fù)合物I和IV的活性較正常對照組均顯著降低（F= 14.221、9.873，P＜0.05）；治療組較模型組復(fù)合物I和IV的活性顯著升高（F=11.065、13.699，P＜0.05），但與正常對照組相比，2組復(fù)合物I和IV的活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.331、1.986，P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠肝臟組織線粒體復(fù)合物活性比較（n=8，

表3 各組大鼠肝臟組織線粒體復(fù)合物活性比較（n=8，

與正常對照組比：aP＜0.01；與模型組比：bP＜0.01

組別 線粒體復(fù)合物I 線粒體復(fù)合物IV正常對照組 0.563±0.088 2.638±0.124模型組 0.188±0.055a 1.285±0.186a治療組 0.312±0.038b 1.937±0.143b F 28.309 24.667 P 0.001 0.007

3 討論

NAFLD包括肝細胞脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化等一系列病理變化。現(xiàn)如今，該病隨著人們的生活品質(zhì)的提高發(fā)病率也逐漸增加，尤其在發(fā)達國家人群最為突出[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)NAFLD為代謝紊亂引起的代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，嚴(yán)重時會導(dǎo)致糖與脂肪代謝異常，并誘發(fā)心腦血管系統(tǒng)以及內(nèi)分泌系統(tǒng)相繼發(fā)生病變[7]。本研究發(fā)現(xiàn)較正常對照組，模型組大鼠血清TC和LDL-C水平明顯升高，肝臟組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)大量空泡化，細胞核固縮，表明NAFLD對肝臟造成了一定的損傷。

作為機體各項生命活動的核心與樞紐，線粒體主要為能量代謝和遺傳變異兩大機能提供了基本場所。線粒體的功能是否正常，在一定程度直接決定了細胞所在的臟腑以及整個機體的生命活動[8]。與核DNA不同，mtDNA無組蛋白包被，且線粒體內(nèi)酶修復(fù)的系統(tǒng)并不完善，更容易受到氧化磷酸化過程產(chǎn)生的ROS損傷而引起高發(fā)突變[9]。線粒體結(jié)構(gòu)損傷、電子傳遞鏈被抑制、酶活性降低、mtDNA的突變或缺失等都會引起能量代謝障礙，進而出現(xiàn)相互損傷的系列過程，即為線粒體功能異常[10-11]。較正常對照組，模型組大鼠mtDNA含量顯著降低，表明NAFLD造成了線粒體數(shù)量減少，mtDNA結(jié)構(gòu)損傷，有線粒體參與的相關(guān)能量代謝功能減弱。

氧化磷酸化是由線粒體呼吸鏈完成的，線粒體內(nèi)膜呼吸鏈?zhǔn)俏挥诰€粒體的一個重要酶系，由四個大分子跨膜蛋白（復(fù)合物I、I I、I I I和IV）和輔酶Q以及細胞色素C構(gòu)成的。mtDNA在復(fù)合物I和IV上分別編碼了7個和3個亞單位，占mtDNA上總的蛋白編碼區(qū)的83.6%。復(fù)合物I作為線粒體在呼吸鏈中重要的組成成分，減弱其活性可以削弱呼吸鏈整體傳遞電子與產(chǎn)生能量的能力；復(fù)合物IV是呼吸鏈中的關(guān)鍵酶之一，它又是最脆弱、最不穩(wěn)定、最易受損的酶，其酶活性的改變將直接造成整個呼吸鏈的功能變化[12]。在氧化磷酸化過程中，復(fù)合物I與復(fù)合物IV直接影響線粒體的能量代謝功能。較正常對照組，模型組復(fù)合物I與復(fù)合物IV活性顯著性降低，表明NAFLD不僅引起線粒體結(jié)構(gòu)損傷，也一定程度影響了線粒體的功能，導(dǎo)致氧化呼吸的過程減弱。模型組大鼠mtDNA以及線粒體氧化呼吸鏈的損傷導(dǎo)致了更多的電子泄漏，從而導(dǎo)致ROS產(chǎn)生量增加，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)斷裂，編碼的相關(guān)呼吸鏈上的亞基合成減少，能量代謝減弱，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，改變分子的結(jié)構(gòu)，能夠破壞核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，最終導(dǎo)致肝臟細胞功能損傷和凋亡，引起線粒體氧化應(yīng)激的惡性循環(huán)，從而產(chǎn)生NAFLD相關(guān)肝臟損傷的臨床表現(xiàn)。

本研究采用的香砂六君丸濃縮丸包含黨參、白術(shù)（炒）、茯苓、半夏（制）、陳皮、甘草（蜜炙）、木香、砂仁、生姜、大棗，具有燥濕化痰、補脾益氣的功效，主治食量不多，氣虛痰多，腹脹便溏等的脾虛氣弱的癥狀[13]。在給予NAFLD大鼠香砂六君子丸治療后，治療組大鼠血清TC和LDL-C水平明顯降低，肝細胞脂肪變性減少，空泡化減輕，細胞結(jié)構(gòu)趨于正常。與模型組大鼠比較，治療組大鼠線粒體結(jié)構(gòu)與功能的損傷減輕，mtDNA拷貝數(shù)與復(fù)合物I與復(fù)合物IV活性顯著性升高，提示香砂六君丸可以減輕NAFLD大鼠氧化應(yīng)激引起的線粒體受損程度，從而提高線粒體對氧自由基的防御能力[14]。本研究發(fā)現(xiàn)香砂六君丸對NAFLD導(dǎo)致的線粒體mtDNA拷貝數(shù)與線粒體復(fù)合物活性損傷起到一定的調(diào)節(jié)作用，但其具體作用機制還有待深入研究。

利益沖突申明 本研究無任何利益沖突

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Effect of Xiangsha Liujunzi Pill on liver’s mitochondrial of rats with nonalcoholic fatty liver disease

LOU Linjie1, YOU Yanting2, MA Ke2, CHEN Zewei2, SUN Xiaomin2, ZHOU Lin3.
1.Department of Traditional Chinese Medicine, the First Aff i liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou, 510515; 3.Department of Endocrinology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, 510515

Objective： To observe the effect of Xiangsha Liujunzi Pill on liver’s mitochondrial in rats with nonalcoholic fatty liver disease. Methods： Under specific pathogen free (SPF) conditions, 24 male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into control group, high fat and high cholesterol diet group (HFD)and Xiangsha Liujunzi Pill (1.35 g·kg-1·d-1) treatment group. After 12 weeks, all rats were executed to get liver samples. Blood paramaters were analyzed by automatic biochemical. The copy number of mitochondrial DNA(mtDNA) and the activity of mitochondrial respiratory chain complex I, IV in liver samples was analysized with RT-PCR and UV spectrophotometer respectively. Results： Compared with control group, the hepatic wet weight and mass index (hepatic wet weight/body mass) increased signif i cantly, levels of total cholesterol (TC) and lowdensity lipoprotein cholesterol (LDL-C) in serum were signif i cantly increased, and the copy number of mtDNA and the activity of complex I, IV expression were signif i cantly decreased in HFD group. Compared with HFD group, the liver wet weight and quality index of rats were signif i cantly reduced, levels of TC and LDL-C in serum were signif i cantly increased, and the copy number of mtDNA and the activity of complex I, IV expression were signif i cantly increased in Xiangsha Liujunzi Pill treatment group. The HE staining of liver showed that the livers sections of HFD group were abundant of macrovesicular fat droplets in hepatocytes and large quantities ofballooned hepatocytes in centrilobular parenchyma with in fi ltration of in fl ammatory cells and fi brosis. The livers sections of HFD group showed that the macrovesicular fat droplets decreased and the nucleus consolidation was reduced. Conclusion： Xiangsha Liujunzi Pill would has effect on nonalcoholic fatty liver disease. Xiangsha Liujunzi Pill can regulate the disordered mitochondrial respiratory chain complex in nonalcoholic fatty liver disease.

nonalcoholic fatty liver disease; Xiangsha Liujunzi Pill; mitochondrial resporatory chain complex;DNA, mitochondrial

R2-031

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.11.004

2016-10-22

國家自然科學(xué)基金資助項目（81202622）；廣東省自然科學(xué)基金資助項目（2014A030313292）；廣州市產(chǎn)學(xué)研專項（2014Y2-00504）。

婁林潔（1985-），女，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

周琳，副主任醫(yī)師，Email：zlecho@163.com。

賈建敏）