CCR7在人肝癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

廖宇圣， 張 姮， 李 暉， 黃曼玲， 胡 美， 周婷婷， 吳 杰

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430070

CCR7在人肝癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

廖宇圣， 張 姮， 李 暉， 黃曼玲， 胡 美， 周婷婷， 吳 杰△

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430070

目的觀察趨化因子受體CCR7在肝癌中的表達情況，并探討CCR7表達水平與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)、免疫印跡(Western blot)及免疫組織化學技術(shù)檢測CCR7蛋白在肝癌組織和配對癌旁組織、人肝癌細胞HepG2和人正常胎肝細胞L02中的mRNA及蛋白表達量，比較其差異，并分析CCR7蛋白表達水平與肝癌臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果免疫組化檢測結(jié)果顯示CCR7在肝癌組織和癌旁組織中的蛋白表達均定位于細胞質(zhì)，且CCR7蛋白在癌旁組織與肝癌組織中的陽性表達率分別為24.2%(15/62)和66.1%(41/62)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=22.013，P<0.05)。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，CCR7在癌旁組織中的mRNA表達顯著低于肝癌組織[(0.512±0.109)vs.(1.591±0.221)，t=-34.403，P<0.01]，在L02細胞中的表達亦低于HepG2細胞[(0.485±0.106)vs.(1.768±0.281)，t=-33.629，P<0.01]。Western blot檢測結(jié)果顯示CCR7在癌旁組織中的蛋白表達同樣低于肝癌組織(P<0.05)、在L02細胞中的表達同樣低于HepG2細胞(P<0.05)。且CCR7蛋白表達量與腫瘤大小、門靜脈癌栓、肝外轉(zhuǎn)移、Child分級、BCLC分期顯著相關(guān)(均P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤數(shù)目、乙肝、肝硬化、血清AFP無明顯相關(guān)(均P>0.05)。結(jié)論CCR7在人肝癌組織中表達顯著增高，其表達水平與肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

趨化因子受體； 肝癌； 侵襲轉(zhuǎn)移

原發(fā)性肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)為我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居于我國惡性腫瘤的第2位[1]。HCC的5年生存率僅為10%，預后差，復發(fā)和轉(zhuǎn)移是導致患者長期生存率較低的主要原因，機制不明[2-3]。因此，闡明肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制、尋找特異性腫瘤分子標志物是進一步提高肝癌療效的關(guān)鍵。趨化因子(chemokines)是一類分泌型小分子蛋白質(zhì)，近年來發(fā)現(xiàn)其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]。研究表明：趨化因子受體CCR7是7次跨膜受體G蛋白偶聯(lián)受體，在腫瘤細胞的增殖、遷移、播散及腫瘤血管形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]。本研究旨在采用Real-time PCR、Western blot及免疫組化等技術(shù)檢測CCR7在人肝癌組織及配對癌旁組織中的表達，探討其表達水平與臨床病理特征的相關(guān)性。以期為尋找肝癌新的治療靶點提供有力依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例來源

選取武漢市中心醫(yī)院消化內(nèi)科2015年1月至2016年12月的62例人肝癌組織及配對癌旁組織標本，所有標本均經(jīng)本院病理科診斷證實為原發(fā)性肝細胞癌。62例肝癌組織標本及配對的癌旁組織標本(距腫瘤邊緣>2 cm處為準)離體后立即置入液氮中保存。所有標本的獲取均得到患者本人及家屬同意，并通過我院倫理委員會批準。

1.2 主要材料

兔抗人FAM96B單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體及二抗均購自Abcam公司，免疫組化試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購自武漢博士德生物公司，Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購于大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司，總蛋白抽提試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒及蛋白濃度檢測試劑盒均購自Invitrogen公司。DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、0.05%胰蛋白酶均購自Sigma公司。人肝癌細胞系HepG2、人正常胎肝L02細胞均保存于本院中心實驗室。CCR7引物序列：上游5′-AGGCTATTGTCCCCTAAACC-3′，下游5′-GGAGGACAGTGAAGAAAACG-3′；β-actin引物序列：上游5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，下游5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，均由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)公司設(shè)計并合成。

1.3 Real-time PCR檢測CCR7 mRNA表達

按照Trizol試劑盒操作說明書提取62例肝癌組織及配對癌旁組織的總mRNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，低溫保存?zhèn)溆?。Real-time PCR總反應體系設(shè)為20 μL，其中2×SYBR Green mix緩沖液10 μL，上下游引物各0.6 μL(濃度為10 μmol/L)，cDNA 2 μL，DEPC水補齊至20 μL。反應條件為：94℃變性20 s，58℃退火15 s，72℃延伸30 s；共35個循環(huán)。各組中CCR7的表達采用2-ΔΔCt法計算，以目的基因與內(nèi)參的比值反映相對表達量。

1.4 Western blot檢測CCR7蛋白表達

分別稱取0.08 g肝癌組織和癌旁組織，加800 μL全蛋白提取液提取蛋白，Bradford法蛋白定量。各組取120 μg上樣于5.0%濃縮膠，15%分離膠，行SDS-PAGE電泳分離。轉(zhuǎn)移蛋白于PVDF膜，5%脫脂奶粉稀釋的CCR7及β-actin一抗孵育，4℃過夜，HRP標記二抗，37℃溫育，化學發(fā)光法顯影檢測。免疫印跡條帶的灰度值經(jīng)灰度掃描儀分析后獲得。CCR7蛋白在肝癌組織中的表達量以肝癌組織CCR7條帶的灰度值與對應的β-actin的灰度值之比表示。

1.5 免疫組織化學染色及結(jié)果判定

免疫組織化學染色按試劑盒實驗步驟操作，常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，微波抗原修復，兔抗人CCR7單克隆抗體(1∶200稀釋)，4℃過夜孵育，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封片固定。用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作陰性對照，相同條件下每個樣本重復3次。結(jié)果判定標準：CCR7表達免疫組化結(jié)果根據(jù)陽性細胞率進行評定和分析。未見陽性細胞或陽性細胞率<5%判定為陰性(-)，將陽性細胞率5%～、25%～、50%～分別定為弱陽性(+)、中度陽性()、強陽性()。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學染色結(jié)果

CCR7蛋白主要表達于細胞質(zhì)，見圖1。在癌旁組織中，細胞質(zhì)著色多為淡黃色，CCR7為陰性、弱陽性或中度陽性，然而，在肝癌組織中染色較深，以棕黃色和棕黑色為主，CCR7為弱陽性、中度陽性或強陽性。將中度陽性及強陽性均判定為陽性表達，CCR7蛋白在癌旁組織與肝癌組織中的陽性表達率分別為24.2%(15/62)和66.1%(41/62)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=22.013，P<0.05)。

2.2 CCR7在肝癌組織中的表達

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，CCR7在癌旁組織中的mRNA表達低于肝癌組織[(0.512±0.109)vs.(1.591±0.221)，t=-34.403，P<0.01]。Western blot檢測結(jié)果顯示CCR7在癌旁組織中的蛋白表達同樣低于肝癌組織[(0.689±0.138)vs.(1.635±0.270)，t=-24.297，P<0.01]，見圖2。

A：癌旁組織；B：肝癌組織圖1 免疫組織化學法檢測CCR7蛋白的表達(×200)Fig.1 The mRNA and protein expression of CCR7 detected by immunohistochemistry(×200)

與癌旁組織比較，*P<0.05圖2 肝癌組織及癌旁組織中CCR7的mRNA(A)和蛋白(B)表達Fig.2 The mRNA (A)and protein(B) expression of CCR7 in liver cancer tissues and their adjacent non-tumor tissues

2.3 CCR7在HepG2細胞和L02細胞中的表達

CCR7 mRNA在L02細胞中的表達低于HepG2細胞[(0.485±0.106)vs.(1.768±0.281)，t=-33.629，P<0.01]，應用Western blot在L02細胞和HepG2細胞均可檢測到CCR7蛋白表達，但在L02中表達顯著低于HepG2[(0.546±0.117)vs.(1.554±0.161)，t=-39.994，P<0.01]。見圖3。

與L02細胞比較，*P<0.05圖3 HepG2細胞和L02細胞中CCR7的mRNA(A)和蛋白(B)表達Fig.3 The mRNA(A)and protein(B)expression of CCR7 in HepG2 cells and L02 cells

2.4 CCR7蛋白表達水平與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系

CCR7蛋白表達量與腫瘤大小、門靜脈癌栓、肝外轉(zhuǎn)移、Child分級、BCLC分期顯著相關(guān)(均P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤數(shù)目、乙肝、肝硬化、血清AFP無明顯相關(guān)(均P>0.05)。見表1。

表1 CCR7蛋白表達量與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系Table 1 The correlation between expression of CCR7 and clinicopathological characteristics of liver cancer(±s)

3 討論

趨化因子是指能使細胞發(fā)生趨化運動的分泌型小分子蛋白質(zhì)(相對分子質(zhì)量為8～11 kD)，趨化因子受體是能夠特異性結(jié)合趨化因子的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體[8-9]。CCR7為CC類趨化因子受體之一，越來越多的證據(jù)顯示，CCR7在黑色素瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌和胃癌等腫瘤細胞中過度表達，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-11]。然而，對于CCR7在肝癌生長、浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用研究甚少。

在腫瘤組織及其相應鄰近正常組織的差異性表達是分析基因與腫瘤關(guān)系的基礎(chǔ)，異常表達的基因可能在腫瘤的形成中扮演重要角色，被認為是潛在的新一類控制細胞增殖和凋亡的癌基因和抑癌基因[12]。本研究中Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果均顯示CCR7在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，且在人肝癌細胞系HepG2中的表達顯著高于人正常胎肝細胞系L02。以上結(jié)果表明：CCR7在肝癌組織和細胞中高表達。有研究表明：肝癌的發(fā)生發(fā)展是包括原癌基因激活和(或)抑癌基因失活在內(nèi)的多階段、多步驟過程[13]。本研究結(jié)果提示：CCR7在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，可能是癌基因，也可能通過間接作用促進肝癌和其他腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示：CCR7蛋白在癌旁組織與肝癌組織中的陽性表達率分別為24.2%和66.1%。其表達差異具有統(tǒng)計學意義。有研究表明，約80%的結(jié)腸癌組織表達CCR7，且多因素回歸分析得出CCR7高表達是與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的最重要因素[14]。本研究結(jié)果與這一結(jié)論基本相符。提示CCR7在肝癌組織中表達率升高參與了肝癌發(fā)生發(fā)展。

為進一步探討CCR7在肝癌發(fā)病機制中的作用，本研究通過統(tǒng)計分析CCR7蛋白表達與肝癌臨床病理特征之間關(guān)系得出：CCR7在肝癌組織中高表達與肝癌患者的性別、年齡、腫瘤數(shù)目、乙肝、肝硬化、血清AFP無明顯相關(guān)。目前，血清AFP是臨床上被用來篩查和早期診斷及評價肝癌預后的實用且可行的方法。但只有40%～60%的肝癌患者AFP增高，還有部分患者AFP的值沒有增高，而且并非所有肝癌細胞都分泌AFP。因此AFP用來診斷肝癌容易造成漏診[15]。而本研究提示：CCR7有望成為不依賴AFP的肝癌標記物。肝癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，究其原因侵襲轉(zhuǎn)移是導致肝癌患者死亡的關(guān)鍵因素，即使接受根治性手術(shù)治療的肝癌患者，由于高復發(fā)和轉(zhuǎn)移率，術(shù)后5年生存率亦較低[2]。本研究結(jié)果顯示：CCR7在肝癌組織中高表達與腫瘤大小、門靜脈癌栓、肝外轉(zhuǎn)移、Child分級、BCLC分期顯著相關(guān)。Mashino等[16]報道CCR7在胃癌組織中高表達與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)。本研究結(jié)果與其基本一致。

綜上所述，肝癌組織和肝癌細胞中CCR7的表達水平均升高，且CCR7在肝癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，提示CCR7可能成為一個新的肝癌生物學標志物，對肝癌的防治具有重要借鑒價值。相信隨著科研工作者對CCR7研究的不斷深入，將有助于進一步闡明肝癌的發(fā)病機制，進而為肝癌的臨床治療及預后提供新的靶點。

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ExpressionofChemokineReceptorCCR7inHumanLiverCancerTissuesandItsCorrelationwithClinicopathologicalCharacteristics

Liao Yusheng，Zhang Hen，Li Huietal

DepartmentofGastroenterology，TheCentralHospitalofWuhan，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430070，China

ObjectiveTo investigate the expression difference of chemokine receptor CCR7 in 62 cases of liver cancer and explore the correlation between CCR7 expression and clinical biological characteristics of liver cancer.MethodsReal-time PCR，Western blotting and immunohistochemistry were used to examine the expression and distribution of CCR7 in liver cancer tissues and their adjacent tissues，HepG2 cells and L02 cells.Furthermore，the correlation between the expression difference of CCR7 and clinicopathological characteristics of liver cancer was analyzed.ResultsImmunohistochemistry showed that CCR7 protein was located in cytoplasm.In addition，the positive expression rate of CCR7 in tumor-adjacent tissues and liver tissues was 24.2%(15/62)and 66.1%(41/62)，the difference was statistically significant(χ2=22.013，P<0.05).CCR7 mRNA levels were significantly lower in tumor-adjacent tissues than in liver tissues[(0.512±0.109)vs.(1.591±0.221)，t=-34.403，P<0.01] and lower in L02 cells than in HepG2 cells[(0.485±0.106)vs.(1.768±0.281)，t=-33.629，P<0.01].While CCR7 protein expression levels were lower in adjacent tissues than in liver tissues and lower in L02 cells than in HepG2 cells(allP<0.05).Moreover，the expression difference was correlated with tumor size，portal vein tumor thrombosis，Child-Turcotte-Pugh，extrahepatic metastasis，Barcelona Clinic Liver Cancer(BCLC)classification(P<0.05)，but not with gender，age，tumor number，hepatitis B virus，cirrhosis of the liver and serum AFP of patients(P>0.05).ConclusionThe CCR7 protein expression is significantly increased in liver cancer tissues as compared with its adjacent normal tissues.Additionally，CCR7 may be a good marker to evaluate the development，invasion and metastasis of liver cancer.

chemokine receptor； liver cancer； invasion and metastasis

廖宇圣，男，1977年生，醫(yī)學碩士，副主任醫(yī)師，E-mail：63669165@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：wujie988@sina.com

R735.7

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.011

(2017-04-10 收稿)