miR-186對膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖和凋亡的影響及機制

萬春花， 蔡 鈞， 楊世疆， 吳景冬， 郭清皓， 蔣林濤△

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 1麻醉科 2急診創(chuàng)傷外科，武漢 430014

miR-186對膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖和凋亡的影響及機制

萬春花1， 蔡 鈞2， 楊世疆2， 吳景冬2， 郭清皓2， 蔣林濤2△

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院1麻醉科2急診創(chuàng)傷外科，武漢 430014

目的研究轉(zhuǎn)染miR-186對膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖能力的影響并探討作用機制。方法采用熒光定量PCR檢測miR-186在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251、U87-MG及正常星形膠質(zhì)細胞系HA1800中的表達水平，將U251細胞分為miR-186模擬物組和對照組，分別轉(zhuǎn)染miR-186模擬物和陰性隨機對照序列，并用熒光定量PCR檢測miR-186在兩組中的表達量。采用CKK-8法檢測兩組細胞細胞增殖能力，流式細胞儀測定兩組細胞凋亡率，Western blot分析Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Cyclin D1蛋白的表達。結(jié)果miR-186低表達于膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251及U87-MG，高表達于正常星形膠質(zhì)細胞系HA1800。轉(zhuǎn)染24、48、72及96 h后，miR-186模擬物組細胞增殖(A450nm值)低于對照組(均P<0.05)。轉(zhuǎn)染48 h后，miR-186模擬物組凋亡率高于對照組；miR-186模擬物組Caspase-3、9的表達量高于對照組(均P<0.01)，Caspase-8與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。miR-186模擬物組Cyclin D1表達水平較對照組明顯降低(P<0.01)。結(jié)論miR-186抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖能力，并誘導(dǎo)凋亡，其機制可能與上調(diào)Caspase-3、9，下調(diào)Cyclin D1有關(guān)。

miR-186； 膠質(zhì)母細胞瘤； 增殖； 細胞凋亡

膠質(zhì)母細胞瘤是成年人最常見的原發(fā)性腦部腫瘤，具有很強的侵襲和增殖能力，病死率很高，患者中位生存期一般不超過1年[1-2]。MicroRNAs (miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，長度在21～25 nt，具有在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達的功能[3-4]。miRNA參與調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、凋亡，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系[5]。miRNA-186被證實在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者腫瘤組織中表達水平降低，且參與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移等過程[6]。它通過靶向SKP2抑制食管鱗狀細胞癌細胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡[7]。miRNA-186在非小細胞肺癌中通過靶向結(jié)合MAP3K2基因而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖和侵襲的作用[8]。細胞周期失調(diào)是發(fā)生癌變的重要原因，細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是G1期所必須的核蛋白，是G1/S期關(guān)鍵限速點的重要調(diào)節(jié)因子[9-10]。細胞凋亡是細胞死亡的調(diào)節(jié)性生理過程，Caspase引發(fā)的一系列級聯(lián)反應(yīng)被認為是細胞凋亡過程的重要途徑[11]。本研究觀察了miR-186基因轉(zhuǎn)染對膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞系增殖和凋亡的影響，分析了miR-186對細胞周期蛋白Cyclin D1及Caspase家族重要成員3、8、9的調(diào)控作用，探討miR-186在膠質(zhì)母細胞瘤中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251、U87-MG及正常星形膠質(zhì)細胞系HA1800購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗醫(yī)學(xué)中心，DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司，實驗所需的一抗購自美國Cell Signaling公司，二抗購自武漢博士德生物科技有限公司， miRcute miRNA提取分離試劑盒(DP501)購自北京天根生物科技有限公司，All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR 檢測試劑盒購自北京亞太恒信生物科技有限公司，SYBR Green Reagents 購自TaKaRa公司，Caspase-3、8、9活性檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，miR-186 mimics及scramble均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251、U87-MG及正常星形膠質(zhì)細胞系HA1800均加入DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后消化傳代。將膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251分為miR-186模擬物組和對照組，分別轉(zhuǎn)染miR-186 mimics和陰性隨機對照序列scramble,采用Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen,USA)對兩組進行轉(zhuǎn)染。miR-186模擬物組轉(zhuǎn)染序列：miR-186 mimics上游 5′-CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCU-3′,miR-186 mimics下游 5′-CCCAAAAGGAGAAUUCUUUG-UU-3′；對照組轉(zhuǎn)染序列：miR-186 NC上游 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,miR-186 NC下游 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.3 miRNA提取及qRT-PCR檢測

用miRcute miRNA提取分離試劑盒按操作說明書提取細胞系中miRNA ，采用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR 檢測試劑盒進行反應(yīng)，操作按試劑盒說明書進行。反應(yīng)體系：2×All-in-OneTMqRT-PCR Mix 10 μL、引物序列(10 μmol/L)1 μL、反轉(zhuǎn)錄cDNA 1 μL，加雙氧水至20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 10 min、變性95℃ 10 s、退火60℃ 20 s、延伸72℃ 30 s，共35周期。miR-181引物序列：上游5′-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGCAGC-3′，下游5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，U6小核引物序列：上游5′-CGCAAGGATGACACG-3′；下游5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′。采用ABI Prism 7700型熒光實時定量PCR儀進行檢測分析，以U6小核RNA作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法定量分析miR-186相對表達水平。

1.4 細胞增殖能力測定

采用CCK-8法測定兩組細胞增殖能力。將miR-186模擬物組和對照組兩組細胞消化成單細胞懸液后，在96孔板上以2×103個/孔接種，每孔培養(yǎng)液體積200 μL。在分別培養(yǎng)0、24、48、72 、96 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，用酶標儀在450 nm波長下測定各孔吸光值(A)，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制膠質(zhì)瘤細胞增殖曲線。

1.5 細胞凋亡能力測定

采用流式細胞術(shù)測定兩組細胞凋亡能力。用Annexin Ⅴ/PI 染色檢測，將兩組細胞消化成單細胞懸液后，PBS清洗2次，并使用Binding Buffer重懸，加入相應(yīng)比例的Annexin Ⅴ抗體，避光染色10 min后加入適量PBS溶液以及PI染料，流式細胞儀檢測Annexin Ⅴ陽性細胞比例來確定細胞凋亡的變化。

1.6 Caspase-3、8、9酶活性測定

將miR-186模擬物組和對照組兩組細胞裂解后，離心處理(1 000 r/min,5min)，按Caspase-3、8、9活性檢測試劑盒說明書進行檢測。利用96孔板，將細胞裂解液與分別含有Caspase-3、8、9底物的反應(yīng)液共同孵育4 h，然后用TECAN酶標儀讀取405 nm的吸光度值，計算相對活力值。

1.7 Cyclin D1蛋白表達量測定

采用Western blot法。將miR-186模擬物組和對照組兩組細胞用RIPA細胞裂解液冰上裂解30 min后，變性、上樣，以每孔30 μg總蛋白上樣，濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠100 V電泳2 h。常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，加入Cyclin D1一抗(1∶300)，37℃孵育4 h，二抗(1∶500)孵育過夜， ECL液顯影，Quantity One 1-D分析軟件對蛋白質(zhì)印跡條帶進行定量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白測定值/ GAPDH測定值，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-186低表達于膠質(zhì)母細胞瘤細胞系

熒光定量PCR結(jié)果示，以正常星形膠質(zhì)細胞系HA1800中 miR-186相對表達量為1.0，miR-186在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251、U87-MG中的相對表達量分別是(0.20±0.04)、(0.30±0.05)，明顯低于正常星形膠質(zhì)細胞系HA1800(均P<0.01)，見圖1。

與HA1800細胞比較，**P<0.01圖1 miR-186在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251、U87-MG及正常星形膠質(zhì)細胞系中的表達Fig.1 The expression of miR-186 in glioblastoma cell line,U251 and U87-MG,and normal astrocyte cell line HA1800

2.2 miR-186過表達抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖

轉(zhuǎn)染miR-186 mimics 24 h后，熒光定量PCR結(jié)果示，以陰性對照組中miR-186表達量為1.0，膠質(zhì)母細胞瘤系U251中miR-186的相對表達量是(8.00±0.63)，明顯高于陰性對照組(P<0.01)，見圖2A。

采用CCK-8法測定U251細胞增殖。轉(zhuǎn)染后0、24、48、72及96 h后，miR-186模擬物組與對照組的A450nm值分別為(0.33±0.03)vs.(0.35±0.04)、(0.43±0.08)vs.(0.75±0.10)、(0.72±0.09)vs.(1.67±0.25)、(1.33±0.15)vs.(2.43±0.19)及(1.92±0.20)vs.(3.78±0.32) ，除0 h時兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余時間點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見圖2B。

2.3 miR-186過表達誘導(dǎo)膠質(zhì)母細胞瘤細胞凋亡

轉(zhuǎn)染miR-186模擬物48 h后，流式細胞術(shù)測定兩組細胞的凋亡率。miR-186模擬物組凋亡率為 (20.0±1.5)%，陰性對照組凋亡率為 (8.0±1.0) %， miR-186模擬物組凋亡率高于對照組(P<0.01)，見圖3A。

A：miR-186在miR-186模擬物組及陰性對照組中的表達；B：CCK-8實驗示miR-186模擬物組及陰性對照組的增殖曲線；與陰性對照組比較，*P<0.05 **P<0.01圖2 miR-186過表達抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖Fig.2 Over-expression of miR-186 inhibits the proliferation of glioblastoma cells

Caspase-3、8、9活性檢測試劑盒檢測Caspase-3、8、9活力。分別以陰性對照組Caspase-3、8、9的活力值為1.0，miR-186模擬物組Caspase-3、9的相對活力分別為(2.1±0.2)、(2.2±0.1)，均顯著高于陰性對照組(均P<0.01)，而Caspase-8相對活力為(1.1±0.1)，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3B。

A：miR-186模擬物組與陰性對照組凋亡率的比較；B：miR-186模擬物組與陰性對照組Caspase-3、8、9活性比較；與陰性對照組比較，**P<0.01圖3 miR-186過表達誘導(dǎo)膠質(zhì)母細胞瘤細胞凋亡Fig.3 Over-expression of miR-186 induces the apoptosis of glioblastoma cells

2.4 miR-186下調(diào)Cyclin D1表達

Western blot結(jié)果示，以陰性對照組為1.0，miR-186模擬物組Cyclin D1相對表達量為(0.33±0.05)，明顯低于陰性對照組(P<0.01)，見圖4。

A：Western blot示miR-186模擬物組與陰性對照組Cyclin D1的表達；B：miR-186模擬物組與陰性對照組Cyclin D1相對表達量的比較；與陰性對照組比較，**P<0.01圖4 miR-186下調(diào)Cyclin D1表達Fig.4 miR-186 down-regulates expression of Cyclin D1

3 討論

膠質(zhì)母細胞瘤是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，年發(fā)病率約為5.26/10萬，每年新增患者約17 000人[12-13]。其發(fā)病機制尚不清楚，目前治療上仍以手術(shù)切除、放療同時聯(lián)合替莫唑胺化療為主，但患者普遍預(yù)后差、生活質(zhì)量低、生存期短[14]。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，在調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡及多種信號途徑中起重要作用，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15]。比如，miR-21通過調(diào)控程序性細胞死亡因子參與乳腺癌細胞增殖[16]；miR-34a通過直接抑制CD44抑制前列腺癌干細胞的轉(zhuǎn)移[17]。miR-186也被證實與腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系，miR-186干擾肺腺癌細胞周期進程，且與預(yù)后不良有關(guān)[18]；miR-186調(diào)控PTTG1表達促進非小細胞肺癌遷移和侵襲[19]；miR-186靶向NSBP1抑制膀胱癌的生長和轉(zhuǎn)移[20]。但是，miR-186在膠質(zhì)母細胞瘤中的作用尚不清楚。

細胞凋亡是導(dǎo)致細胞程序性死亡的特定過程，通過激活線粒體通路或死亡受體通路或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路等途徑而誘發(fā)[21-22]。線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡通路通過激活細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中，與Apaf1結(jié)合形成復(fù)合物，引起Caspase-9等級聯(lián)反應(yīng)，最后導(dǎo)致Caspase-3的激活，繼而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-186模擬物組細胞凋亡率是(20.0±1.5)%,而對照組是(8.0±1.0)%，表明miR-186上調(diào)表達可誘導(dǎo)膠質(zhì)母細胞瘤細胞凋亡。通過檢測蛋白活力發(fā)現(xiàn)，miR-186模擬物組中Caspase-3和Caspase-9蛋白活力顯著升高。故而證實miR-186過表達激活了線粒體凋亡途徑進而促進膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞凋亡。

死亡受體如Fas和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)，通過招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域和Caspase-8同型二聚體而自動酶解，Caspase-8被激活并釋放到胞質(zhì)中，作用于Caspase-3并使Caspase-3激活，從而誘導(dǎo)凋亡[24]。本研究中，蛋白活力檢測表明miR-186模擬物組與對照組中Caspase-8蛋白活力無顯著差異，表明細胞表面死亡受體途徑?jīng)]有參與到miR-186誘導(dǎo)的膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞凋亡過程。

細胞周期紊亂是導(dǎo)致惡性腫瘤轉(zhuǎn)化和失控性增殖的重要原因[25]。細胞周期調(diào)控激酶復(fù)合物CDK/Cyclin是調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵因素，G0/G1期阻滯是抑制細胞增殖的重要原因[26-28]。本研究也探討了miR-186過表達是否引起U251細胞阻滯于G0/G1期。Western blot結(jié)果顯示，miR-186模擬物組中Cyclin D1(G1/S轉(zhuǎn)換期的重要正向調(diào)控因子[29])的表達水平較對照組明顯下降。這表明，miR-186基因過量表達引起U251細胞阻滯于G0/G1期，抑制細胞的有絲分裂，進而抑制膠質(zhì)母細胞瘤增殖過程。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-186后，能顯著降低膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞的增殖能力，并促進凋亡，顯著提高細胞凋亡蛋白酶Caspase-3、Caspase-9的活力，降低細胞周期蛋白Cyclin D1的表達。說明，miR-186通過參與調(diào)控細胞凋亡和細胞周期途徑而抑制膠質(zhì)母細胞瘤U251的增殖能力。miR-186有望成為膠質(zhì)母細胞瘤治療的潛在標志物，為腫瘤治療提供了新靶點及思路。

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EffectofmiR-186onProliferationandApoptosisofGliblastomaCellsandItsMechanisms

Wan Chunhua1, Cai Jun2, Yang Shijiang2etal

1DepartmentofAnesthesiology2DepartmentofEmergencyTraumaSurgery,WuhanCentralHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430014,China

ObjectiveTo explore the role of miR-186 transfection in the proliferation and apoptosis of glioblastoma cells,as well as the regulatory mechanism.MethodsReal-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR) was performed to detect the expression of miR-186 in glioblastoma cell line,U251 and U87-MG,and normal astrocyte cell line HA1800.The U251 cells were divided into miR-186 mimic group and control group,which were transfected with miR-186 mimics and scramble sequence,respectively.MiR-186 expression levels of these two groups were detected by qRT-PCR.Cell proliferation ability of the two groups was evaluated by CKK-8 assay.Cell apoptosis rate was analyzed by flow cytometry.Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9,and Cyclin D1 protein levels were quantified by Western blotting.ResultsLower miR-186 levels were observed in glioblastoma U251 and U87-MG cells than in normal brain cell line.However,miR-186 level was significantly higher in miR-186 mimic group than in control group (P<0.01).After transfection for 24,48,72,and 96 h,A450 nmvalues were lower in the miR-186 mimic group than in the control group (allP<0.05).After transfection for 48 h,apoptosis rate was higher in the miR-186 mimic group than in the control group.Caspase-3 and Caspase-9 were significantly higher in the miR-186 mimic group than in the control group (bothP<0.01).However,there was no significant difference in the expression of Caspase-8 between miR-186 mimic group and control group(P>0.05).Cyclin D1 protein expression was significantly lower in the miR-186 mimic group than in the control group (P<0.01).ConclusionMiR-186 inhibits the proliferation and induces apoptosis of U251 cells via up-regulating Caspase-3 and 9 and down-regulating Cyclin D1.

miR-186; glioblastoma; proliferation; apoptosis

萬春花，女，1977年生，主治醫(yī)師，E-mail:wanchunhuahp@tom.com

△通訊作者，Correspondina author，E-mail:lintaojiang99@21cn.com

R739.41

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.005

(2017-05-17 收稿)