癌-睪丸抗原OY-TES-1致敏的樹突狀細(xì)胞體外抗膠質(zhì)瘤的免疫效應(yīng)*

劉 暢， 閉水清， 張慶梅， 謝小薰， 肖紹文△，付 駿， 葛盈盈， 陳 芳， 羅 彬△， 李 靜

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧 530021 2廣西醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，南寧 530021 3廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021

癌-睪丸抗原OY-TES-1致敏的樹突狀細(xì)胞體外抗膠質(zhì)瘤的免疫效應(yīng)*

劉 暢1， 閉水清1， 張慶梅2，3， 謝小薰2，3， 肖紹文1△，付 駿2， 葛盈盈2，3， 陳 芳2，3， 羅 彬2，3△， 李 靜2

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧 5300212廣西醫(yī)科大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，南寧 5300213廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021

目的研究負(fù)載癌-睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)OY-TES-1的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)體外抗膠質(zhì)瘤的細(xì)胞免疫效應(yīng)。方法細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)HLA-A2+健康人外周血單核細(xì)胞為DC，采用OY-TES-1重組蛋白致敏DC，流式細(xì)胞術(shù)檢測成熟DC表型分子；進(jìn)而使DC誘導(dǎo)同體T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，CCK8檢測T細(xì)胞增殖情況，ELISPOT檢測IFN-γ含量，乳酸脫氫酶釋放法檢測CTL對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251和A172的殺傷作用。結(jié)果負(fù)載OY-TES-1的DC低表達(dá)CD14，而高表達(dá)CD1a、CD83和CD80表型分子，能明顯促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖及其IFN-γ的分泌(P<0.05)；而OY-TES-1特異性CTL在效靶比為50∶1時(shí)對HLA-A2+和OY-TES-1+U251、HLA-A2-和OY-TES-1+A172均有明顯殺傷作用(均P<0.05)，但其對U251的殺傷作用更強(qiáng)。結(jié)論體外用OY-TES-1重組蛋白致敏的DC可誘導(dǎo)特異性抗膠質(zhì)瘤免疫應(yīng)答，提示OY-TES-1可能成為膠質(zhì)瘤免疫治療的靶點(diǎn)。

樹突狀細(xì)胞； OY-TES-1； 膠質(zhì)瘤； 免疫治療

膠質(zhì)瘤(glioma)是一類常見的侵襲性和惡性程度非常高的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，患者中位生存期通常不超過2年，預(yù)后不良。傳統(tǒng)治療仍然采用手術(shù)切除為主，術(shù)后輔以放療和化療，但由于腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長、腦解剖部位的特殊性以及血腦屏障的存在等多種影響因素，膠質(zhì)瘤的傳統(tǒng)治療效果并不令人滿意，因此急需探索新的治療方法。其中，腫瘤免疫治療由于具有創(chuàng)傷小、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)而備受關(guān)注，并且，以樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療是近年來的研究熱點(diǎn)之一[1-3]。

DC是目前已知的功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)。由于未成熟DC能攝取加工抗原，而成熟DC則能有效提呈可溶性抗原，同時(shí)激活靜息和幼稚的T細(xì)胞，因此能夠啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。經(jīng)研究證實(shí)，利用腫瘤抗原、腫瘤細(xì)胞RNA和腫瘤細(xì)胞裂解物致敏DC，可在體內(nèi)外有效地誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，從而激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)[4]。在過去20年里，基于DC的抗腫瘤療法不斷發(fā)展，并且展現(xiàn)出了良好的臨床應(yīng)用前景[5]。

癌-睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)是一類具有免疫原性，高度腫瘤特異性的抗原，僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和生殖細(xì)胞，而在除睪丸之外的正常組織基本不表達(dá)[6-10]，因此被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)[11]。OY-TES-1屬CTA中一員[12]，在CT抗原數(shù)據(jù)庫中又稱CT23(http：//www.cta.lncc.br)。研究顯示，OY-TES-1在多種腫瘤組織中表達(dá)[13-16]，并在腫瘤患者體內(nèi)能夠引起體液免疫反應(yīng)[13-14，17]。目前已研究鑒定出一個(gè)OY-TES-1的HLA-A24限制性表位，經(jīng)證實(shí)該表位能在體外引起細(xì)胞免疫反應(yīng)[18]。同時(shí)，根據(jù)我們前期的研究顯示17.14%的膠質(zhì)瘤患者血清中存在OY-TES-1抗體，而正常人體內(nèi)血清均為OY-TES-1抗體陰性[17]。由此可見，將OY-TES-1用于腫瘤免疫治療具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。所以在此基礎(chǔ)上，本研究擬采用OY-TES-1重組蛋白致敏DC，然后使其誘導(dǎo)同體T細(xì)胞產(chǎn)生CTL，觀察CTL對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)，為今后開發(fā)基于OY-TES-1的腫瘤疫苗提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein，MBP)及其與OY-TES-1重組蛋白(OY-MBP)由本課題組制備；膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251(HLA-A2+)和A172(HLA-A2-)購自中科院上海細(xì)胞庫，按照常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)；人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)購于Sigma公司；細(xì)胞因子rhTL-4、rhTNF-α、rhGM-CSF購于Peprotech公司；rhIL-2購于山東泉港藥業(yè)有限公司；PE標(biāo)記的小鼠抗人CD83、CD80、CD14、IgG2b和FITC標(biāo)記的小鼠抗人CD1a、HLA-DR、IgG1、HLA-ABC抗體和HLA-A2抗體購于eBioscience公司；CD8+細(xì)胞磁珠分離試劑盒購于德國美天旎公司；IFN-γ ELISPOT試劑盒購于達(dá)科為公司；非放射性細(xì)胞毒檢測試劑盒購于Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DC的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)、致敏、表型分析 取50 mL HLA-A2+健康人外周血，F(xiàn)icoll密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，將3×106/mL的PBMC加入6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)2 h后，收集貼壁單核細(xì)胞，用含rhGM-CSF(100 ng/mL)和rhIL-4(50 ng/mL)的RPMI 1640進(jìn)行DC誘導(dǎo)培養(yǎng)，隔日半量換液，同時(shí)補(bǔ)充細(xì)胞因子，每天用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長和形態(tài)變化。

調(diào)整DC細(xì)胞密度至1×106/mL，在培養(yǎng)的第6天加入成熟因子rhTNF-α(50 ng/mL)，同時(shí)補(bǔ)充含rhGM-CSF(100 ng/mL)和rhIL-4(50 ng/mL)的完全培養(yǎng)液RPMI 1640。在培養(yǎng)的第7天分別加入不同的蛋白100 μL(100 μg/mL)，分為以下3組：OY-TES-1重組蛋白組(OY/DC)、MBP組(MBP/DC)和不加任何蛋白的對照組(PBS/DC)。3組細(xì)胞在蛋白致敏24 h后全量換液，同時(shí)補(bǔ)充含rhTNF-α、rhGM-CSF和rhIL-4的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

收集培養(yǎng)到第8天的致敏DC，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，然后加入CD14、CD1a、CD80和CD83抗體20 μL，4℃避光孵育30～60 min后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.2 效應(yīng)T細(xì)胞的分離 收集同體PBMC培養(yǎng)2 h后的非貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，采用磁珠陽選法分離CD8+T淋巴細(xì)胞。

1.2.3 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 收集致敏72 h后的DC(刺激細(xì)胞)，加入25 μL/mL絲裂霉素C培養(yǎng)30 min后，分別調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL和1×104/mL，分別以DC∶T為1∶1和1∶10加入上述分離的CD8+T淋巴細(xì)胞(反應(yīng)細(xì)胞)混合培養(yǎng)獲得CTL細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，終體積為200 μL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；于培養(yǎng)結(jié)束前2 h加入CCK-8溶液(20 μL/孔)，測各孔吸光度值(A450nm)，計(jì)算刺激指數(shù)(stimulation index，SI)：SI=(實(shí)驗(yàn)孔A值-本底A值)/(空白對照孔A值-本底A值)。

1.2.4 ELISPOT法檢測IFN-γ 將致敏DC和CD8+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)后者為CTL，采用ELISPOT檢測培養(yǎng)液中CTL細(xì)胞IFN-γ的分泌量，按照試劑盒說明書進(jìn)行，共分為6組：背景負(fù)對照組(培養(yǎng)液)、負(fù)對照組(T細(xì)胞)、正對照組(陽性刺激劑+T細(xì)胞)、DC組(PBS/DC+T細(xì)胞)、MBP/DC組(MBP/DC+T細(xì)胞)和OY/DC組(OY /DC+T細(xì)胞)。

1.2.5 CTL對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用 采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定CTL對靶細(xì)胞的毒性。將CTL和靶細(xì)胞U251和A172細(xì)胞分別按12.5∶1、25∶1、50∶1的效靶比加入96孔板共孵育，4 h后加25 μL裂解液至靶細(xì)胞最大釋放孔，繼續(xù)孵育45 min，然后收集各組上清液至另一培養(yǎng)板，加入底物緩沖液，避光放置30 min后終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測其A490nm，并計(jì)算殺傷率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，并用最小顯著差法進(jìn)行組間的多重比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成熟DC表型分析

流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)至第8天的成熟DC表型分子，結(jié)果顯示：CD14為0.65%、CD1a為76.83%、CD83為80.25%、CD80為79.02%(圖1)，表明經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后大部分單核細(xì)胞能轉(zhuǎn)變成DC，且呈成熟DC表型。

A：IgG1 0.11%；B：CD14 0.65%；C：CD1a 76.83%；D：IgG2b 1.53%；E：CD83 80.25%；F：CD80 79.02%圖1 流式細(xì)胞儀檢測DC表型分子Fig.1 Detection of DC phenotype by flow cytometry

2.2 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

用CCK-8法檢測DC誘導(dǎo)CD8+T的增殖能力，結(jié)果顯示：OY/DC組能明顯促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖，與MBP/DC組和PBS/DC組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；在不同的2種DC∶T體系中，1∶1的刺激效應(yīng)更強(qiáng)(圖2)。

與OY/DC組比較，*P<0.05圖2 DC誘導(dǎo)同體T淋巴細(xì)胞增殖能力測定Fig.2 Proliferation of homologous T lymphocyte induced by DC

2.3 IFN-γ分泌量的檢測

為了進(jìn)一步明確致敏DC誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)能力，我們采用ELISPOT法檢測IFN-γ分泌水平，結(jié)果顯示：OY/DC組和正對照組能明顯上調(diào)CD8+T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 CTL對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用

LDH釋放法檢測CTL對靶細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果顯示：在各種效靶比中，OY-DC所誘導(dǎo)的CTL對靶細(xì)胞的殺傷效率均較其它對照組高，但僅效靶比為50∶1時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在該效靶比時(shí)，CTL對HLA-A2+和OY-TES-1+的U251細(xì)胞比HLA-A2-和OY-TES-1+的A172細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用，此外，我們也觀察到兩組靶細(xì)胞均出現(xiàn)隨著效靶比的增高，CTL對其殺傷作用也隨之增強(qiáng)的趨勢(圖4)。

與正對照組比較，*P<0.05；與OY/DC組比較，#P<0.05圖3 ELISPOT法分析分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞數(shù)量Fig.3 The number of CD8+ T cells secreting IFN-γ was analyzed by ELISPOT

與OY/DC-CTL+A172組比較，*P<0.05；與OY/DC-CTL+U251組比較，#P<0.05圖4 不同效應(yīng)CTL對膠質(zhì)瘤的特異性殺傷率Fig.4 Specific killing rate of different CTL in glioma

3 討論

DC是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)功能最強(qiáng)，也是唯一能激活初始T淋巴細(xì)胞的專職APC[5]。DC來源于骨髓CD34陽性細(xì)胞，能高水平地表達(dá)與抗原遞呈有關(guān)的MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子以及多種共同刺激分子，能夠攝取和處理抗原，并遞呈給T細(xì)胞，因此DC能夠激活相應(yīng)的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。雖然DC在人體內(nèi)分布廣泛，但含量稀少，占PBMC的1%以下，所以導(dǎo)致了體外或體內(nèi)研究其生物學(xué)特性具有一定困難，同時(shí)也限制了DC疫苗在臨床的廣泛應(yīng)用。隨著對DC基本生物過程的不斷認(rèn)識，如今已可以從外周血、骨髓、臍帶血等組織的單核細(xì)胞或造血干細(xì)胞CD34+中成功誘導(dǎo)分化為具有免疫功能的DC，其中從PBMC誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的方法，由于取材容易已在臨床上推廣應(yīng)用。本研究通過采用先由外周血將PBMC常規(guī)分離，經(jīng)反復(fù)貼壁后獲得粘附的單核細(xì)胞，再用rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，并對培養(yǎng)的DC進(jìn)行了鑒定。我們選擇了4個(gè)反映DC成熟狀況的細(xì)胞表面分子進(jìn)行檢測，其中CD14是單核細(xì)胞特異性表達(dá)分子，培養(yǎng)至第8天時(shí)其表達(dá)已明顯減少；CD83和CD1a是DC相對成熟的表面分子，CD80是與DC抗原提呈功能密切相關(guān)的表面分子，這些細(xì)胞表面分子的表達(dá)在培養(yǎng)至第8天的DC中已明顯提高，證明DC已趨成熟。

致敏的DC具有活化T淋巴細(xì)胞的功能，為驗(yàn)證DC這一功能，我們將經(jīng)蛋白致敏的DC與自體T淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，分別檢測T淋巴細(xì)胞的增殖情況及其IFN-γ分泌量。結(jié)果顯示，經(jīng)OY-TES-1融合蛋白致敏后的DC能顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，并使IFN-γ分泌量明顯增加。此外，由于DC受到抗原特異或非特異性的刺激后均會(huì)促進(jìn)CD8+T淋巴細(xì)胞活化和細(xì)胞因子分泌的增加，考慮到本研究所用的OY-TES-1蛋白是一種包含了MBP的重組蛋白，因此我們設(shè)立了MBP致敏DC組作為對照組來排除MBP蛋白對DC的作用。結(jié)果顯示，雖然各種蛋白致敏DC后均能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化，但經(jīng)OY-TES-1重組蛋白致敏的DC能更有效刺激T淋巴細(xì)胞的增殖并增加CD8+T淋巴細(xì)胞IFN-γ的分泌量。而DC促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的機(jī)制，我們推測可能與IFN-γ反向調(diào)節(jié)促進(jìn)DC成熟活化有關(guān)，進(jìn)而又促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞的活化，可能形成了具有放大效應(yīng)的反饋環(huán)路。CD8+T淋巴細(xì)胞經(jīng)DC刺激轉(zhuǎn)化而成的CTL是極其重要的腫瘤殺傷細(xì)胞，并且IFN-γ是CTL發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用的主要細(xì)胞因子。

CTL在腫瘤免疫治療中發(fā)揮十分重要的作用，其介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)的多為CD8+，其殺傷效應(yīng)受MHC-Ⅰ類分子限制，通過釋放毒性顆粒及死亡受體途徑而介導(dǎo)靶細(xì)胞死亡。此外約10%的CTL為CD4+，其殺傷效應(yīng)受MHC-Ⅱ類分子限制，主要通過分泌細(xì)胞因子以及激活巨噬細(xì)胞從而介導(dǎo)細(xì)胞免疫效應(yīng)。鑒于我國大部分人群HLA抗原表型為HLA-A*02陽性，因此我們首先研究基于HLA-A*02的免疫治療策略。本研究從HLA-A2+外周血中由DC前體細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC，然后再采用OY-TES-1重組蛋白致敏該DC，并將致敏后的DC與自體T細(xì)胞共同孵育，誘導(dǎo)出OY-TES-1特異性CTL，使得這些CTL能夠特異性殺傷HLA-A2+并表達(dá)OY-TES-1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。而對HLA-A2-的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，盡管其OY-TES-1蛋白表達(dá)較高，但CTL對其殺傷作用明顯減弱，這表明CTL的特異性殺傷作用具有MHC-Ⅰ類分子限制性。另外，本研究還提示了HLA-A2+的OY-TES-1特異性CTL對HLA-A2-的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株也有一定的殺傷作用，對于這一現(xiàn)象，我們推測可能有以下原因：①可能與MHC的兼并性有關(guān)；② HLA-A24單體型是許多種群中最為常見的等位基因之一，尤其在中國人群有較高的表達(dá)(33%)，本實(shí)驗(yàn)中獻(xiàn)血者與膠質(zhì)瘤細(xì)胞株可能也同時(shí)表達(dá)HLA-A24。

綜上所述，OY-TSE-1融合蛋白致敏DC而誘導(dǎo)的CTL對膠質(zhì)瘤細(xì)胞株具有較強(qiáng)的殺傷作用，這為臨床上將該蛋白運(yùn)用于膠質(zhì)瘤的免疫治療提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)也存在一些不足之處：如DC的活化和成熟狀態(tài)不穩(wěn)定，這將影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。針對這些問題，在我們接下來的實(shí)驗(yàn)中可進(jìn)一步優(yōu)化DC的培養(yǎng)，并進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，從而進(jìn)一步探討負(fù)載OY-TES-1抗原的DC瘤苗對腫瘤的殺傷效應(yīng)。

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ImmuneEffectagainstGliomaMediatedbyDendriticCellsPulsedwithCancer-testisAntigenOY-TES-1InVitro

Liu Chang1，Bi Shuiqing1，Zhang Qingmei2，3etal

1DepartmentofNeurosurgery，TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China2DepartmentofHistologyandEmbryology，3CentralLaboratory，SchoolofPre-ClinicalMedicine，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China

ObjectiveTo detect immune effect against glioma mediated by dendritic cells(DCs)pulsed with cancer-testis antigen(CTA)OY-TES-1invitro.MethodsCytokines induced HLA-A2+healthy human peripheral blood mononuclear cells into DCs，which were loaded by OY-TES-1 recombinant protein.Then flow cytometry was used to detect the phenotype molecules of mature DC.T cell proliferation was tested by CCK8，and IFN-γ level was assessed by ELISPOT assay.Lactate dehydrogenase release method was used for the killing effect of CTL on glioma cells U251 and A172.ResultsDCs loaded OY-TES-1 showed the low expression of CD14 and high expression of CD1a，CD83 and CD80，and could significantly promote the proliferation of CD8+T cells and the secretion of IFN-γ(P<0.05).OY-TES-1 specific CTL had significant killing effect on HLA-A2+and OY-TES-1+U251 and HLA-A2-and OY-TES-1+A172 at the target-target ratio of 50∶1(P<0.05)，but its killing effect was much stronger on U251 than on A172.ConclusionDCs loaded OY-TES-1 can induce specific anti-glioma immune response，suggesting that OY-TES-1 may be the target for glioma immunotherapy.

dendritic cell； OY-TES-1； glioma； immunotherapy

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360371，No.81360374，No.81460382，No.81560408)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2016 GXNSFAA380257，No.GXNSFBA380159)；廣西生物靶向診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No.GXSWBX201505)；廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究課題(GKE2015-ZZ02)

劉 暢，男，1989年生，碩士研究生，E-mail：249738984@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：xsw57@yahoo.com(肖紹文)；1561148680@qq.com(羅彬)

R739.41

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.003

(2017-08-23 收稿)