貞清方通過抑制活性氧產(chǎn)生改善2型糖尿病大鼠勃起功能*

李明超， 林 煌， 郭水明， 劉 卓， 王 濤△， 王少剛， 劉繼紅△， 葉章群

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院 1泌尿外科(泌尿外科研究所) 2腎內(nèi)科，武漢 430030

論 著

貞清方通過抑制活性氧產(chǎn)生改善2型糖尿病大鼠勃起功能*

李明超1， 林 煌1， 郭水明2， 劉 卓1， 王 濤1△， 王少剛1， 劉繼紅1△， 葉章群1

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院1泌尿外科(泌尿外科研究所)2腎內(nèi)科，武漢 430030

目的探索貞清方能否通過減少活性氧(ROS)的產(chǎn)生來改善糖尿病引發(fā)的勃起功能障礙(ED)。方法30只8周齡雄性SD大鼠，隨機分為對照組(Con組)，糖尿病ED組(DM組)，糖尿病ED+貞清方組(ZQR組)，其中DM組和ZQR組均采用高糖高脂喂養(yǎng)4周后行腹腔單次小劑量(30 mg/kg)注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)2型糖尿病模型，并于10周后使用阿撲嗎啡(APO)篩選2型糖尿病ED大鼠。ZQR組使用貞清方4 g/(kg·d)灌胃，DM組和Con組給予等量的生理鹽水灌胃。4周后測各組大鼠血糖、三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)、平均動脈壓(MAP)、陰莖海綿體內(nèi)壓(ICP)、丙二醇(MDA)，通過Western blot檢測內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)的蛋白表達。結(jié)果Con組和ZQR組大鼠血糖、TC、TG、和MDA水平均明顯低于DM組(均P<0.05)；Con組和ZQR組的最大陰莖海綿體內(nèi)壓/平均動脈壓(maxICP/MAP)明顯高于DM組(P<0.05)；Western blot結(jié)果顯示eNOS和nNOS在Con組和ZQR組的表達明顯高于DM組。結(jié)論貞清方可以通過抑制活性氧的產(chǎn)生來改善2型糖尿病大鼠的勃起功能障礙。

貞清方； 糖尿??； 勃起功能障礙； 活性氧

勃起功能障礙(erectile dysfunctions，ED)是指陰莖不能進行以及不能維持勃起以完成滿意的性交。ED是糖尿病的一種常見并發(fā)癥，在糖尿病患者中的患病率為25%～75%，且該比例隨患者年齡和發(fā)病時間增加而增加[1-2]。高糖高脂是2型糖尿病的主要特征[2-5]，高糖和高脂通過抑制陰莖NO生成以及促進超氧化物生成而導(dǎo)致ED，活性氧(reactive oxygen species，ROS)在ED的發(fā)病中起重要作用[6-10]。貞清方來自經(jīng)典中藥處方二至丸，包含墨旱蓮、女貞子、薯蕷等3種中草藥，目前用于治療糖尿病腎病[3]。貞清方可以降低糖尿病性的高糖和高脂，同時有抑制脂質(zhì)過氧化的作用[3，11]。本研究擬探索貞清方能否通過降低高糖和高脂以及ROS的生成來改善糖尿病性的ED。

1 材料與方法

1.1 貞清方提取制備

方法參照文獻[3]。貞清方由女貞子、墨旱蓮、薯蕷組成，這3種草藥的比例為1.2∶1.2∶1.5 。3種草藥混合，加水煎煮2 h，共煮2次，過濾，乙醇蒸發(fā)提純，最終濃度為1.0 g/mL，提取液于4℃儲存。

1.2 模型建立

30只SD雄性大鼠購于湖北省疾控中心實驗動物中心，8周齡，體重180～220 g。經(jīng)過1周的適應(yīng)后，大鼠被隨機分為3組：對照組(Con組，n=6)、糖尿病ED組(DM組，n=12)、糖尿病ED+貞清方治療組(ZQR組，n=12)。Con組給予普通食物喂養(yǎng)，DM組和ZQR組均給予高糖高脂飲食喂養(yǎng)。4周后，DM組和ZQR組單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，Sigma-Aldrich，美國)(30 mg/kg，溶解于枸櫞酸緩沖液，pH值4.5)，對照組注射等量的枸櫞酸緩沖液[3]。10周后使用阿撲嗎啡(100 μg/kg，溶解于含0.1 g/L維生素C的生理鹽水)篩選2型糖尿病ED大鼠。以大鼠陰莖頭充血及陰莖體增長、露出作為勃起的標志，可伴或不伴有彎腰舔食陰莖、打哈欠及射精等動作，30 min內(nèi)未出現(xiàn)陰莖勃起的大鼠，即為糖尿病ED大鼠[12]。ZQR組每天8：00～10：00貞清方提純液4 g/(kg·d)灌胃，DM組和Con組給予等量生理鹽水灌胃，共4周。灌胃劑量每周依據(jù)體重調(diào)整1次[3]。

1.3 勃起功能評估

腹腔注射0.4%戊巴比妥(35 mg/kg)麻醉大鼠，取仰臥位固定大鼠四肢和頭部。取頸部正中切口，分離頸部肌群，游離左側(cè)頸總動脈，絲線結(jié)扎遠心端，動脈夾夾閉近心端，取“V”型切口，插入充滿含肝素生理鹽水(250 U/mL)的PE-50管，尾端連接壓力換能器，監(jiān)測平均動脈壓(MAP)。腹部會陰取正中切口，于前列腺背外側(cè)找到陰莖海綿體神經(jīng)作為電刺激點，充分暴露陰莖海綿體，斜行穿刺插入充滿含肝素生理鹽水(250 U/mL)的PE-50管所帶的25號針，尾端連接壓力換能器，監(jiān)測陰莖海綿體內(nèi)壓(ICP)。這二者連接到Powerlab工作平臺(ADInstruments公司，澳大利亞)，平穩(wěn)后使用雙極電極絲，分別以2.5、5.0、7.5 V的電壓，以頻率15 Hz，波寬1.2 ms，持續(xù)1 min，間隔3 min方式電刺激海綿體神經(jīng)，監(jiān)測ICP/MAP的比值變化以評估大鼠的勃起功能。處死大鼠取陰莖海綿體標本，液氮速凍后儲存于-80℃的冰箱中。

1.4 血糖及血脂的檢測

大鼠海綿體測壓結(jié)束后取頸動脈血4 mL，使用羅氏血糖儀測定葡萄糖，使用酶偶聯(lián)比色法測定三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)。

1.5 Western blot檢測

將陰莖海綿體組織剪碎后，加入RIPA裂解液(江蘇碧云天生物公司)，并使用超聲波破碎組織，離心取上清液，加入上樣緩沖液后煮沸5 min，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜；使用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h；分別使用抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和抗神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)抗體(Abcam，英國)在4℃下孵育剪切好的PVDF膜過夜。洗膜后使用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h(Pierce，美國)；使用TBS洗膜后采用ECL化學發(fā)光試劑(Amersham，美國)顯色、曝光，凝膠成像分析系統(tǒng)采集分析圖像，以目的蛋白與β-actin的比值作為相對表達量。

1.6 氧化應(yīng)激水平評估

取陰莖海綿體組織，制備組織勻漿，利用丙二醇(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測MDA水平，評估陰莖組織的脂質(zhì)過氧化程度，從而分析組織的氧化應(yīng)激水平。操作按試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的生長情況

篩選2型糖尿病ED大鼠后，3組大鼠分別給予貞清方提取物或生理鹽水灌胃4周，各組大鼠生長情況均可。糖尿病大鼠造模成功19只，陰莖勃起功能障礙15只，其中DM組8只，ZQR組7只。DM組大鼠體重較Con組降低(P<0.05)，ZQR組大鼠體重較DM組大鼠體重增加(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組大鼠的代謝指標

血糖水平：DM組顯著高于Con組(P<0.05)，ZQR組的血糖水平較DM組有顯著降低(P<0.05)，見圖2。血清TG、TC水平：DM組顯著高于Con組(均P<0.05)，ZQR組的TG、TC水平較DM組有顯著降低(均P<0.05)，見圖3。

與Con組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05圖1 各組大鼠的體重Fig.1 Body weight of the rats in the three groups

與Con組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05圖2 各組大鼠血糖水平Fig.2 Blood glucose levels of the rats in the three groups

與Con組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05圖3 各組大鼠TG、TC水平Fig.3 TG and TC levels of the rats in the three groups

2.3 各組大鼠的勃起功能

分別用2.5、5.0和7.5 V電壓刺激大鼠陰莖海綿體神經(jīng)，分析maxICP/MAP后發(fā)現(xiàn)：DM組大鼠的maxICP/MAP與Con組相比顯著下降(均P<0.05)，這充分說明了在DM組大鼠中存在勃起功能受損；與此同時，ZQR組大鼠的maxICP/MAP較DM組上升(均P<0.05)，說明ZQR組大鼠的勃起功能較DM組有明顯的改善。見圖4。

A：3組大鼠在2.5、5.0、7.5 V電壓刺激下的MaxICP/MAP；B：3組大鼠在5 V電壓刺激海綿體神經(jīng)下的ICP變化曲線和即時MAP的變化曲線；與Con組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05圖4 大鼠勃起功能評估Fig.4 Assessment of erectile function of the rats

2.4 各組大鼠陰莖海綿體中nNOS和eNOS的蛋白含量

Western blot檢測結(jié)果顯示：DM組大鼠與Con組相比，nNOS和eNOS蛋白表達明顯降低(均P<0.05)，ZQR組則較DM組有所增加(均P<0.05)，見圖5。

與Con組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05圖5 各組大鼠陰莖海綿體組織中eNOS和nNOS蛋白的Western blot檢測結(jié)果Fig.5 Protein expression of eNOS and nNOS in rat penis detected by Western blotting

2.5 各組大鼠的氧化應(yīng)激水平

通過檢測脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的水平來評估海綿體組織中的氧化應(yīng)激情況。DM組大鼠陰莖海綿體組織的MDA水平明顯高于Con組(P<0.05)，ZQR組則較DM組有明顯的降低(P<0.05)，見圖6。

與Con組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05圖6 各組大鼠陰莖海綿體組織中MDA水平Fig.6 MDA levels in rat penile tissue

3 討論

本研究認為貞清方可以通過降低血脂和血糖，從而減少ROS的生成以及恢復(fù)eNOS和nNOS的表達，進而改善2型糖尿病ED。

高糖和高脂都與糖尿病ED相關(guān)。高糖誘導(dǎo)的線粒體氧自由基過剩是通過以下幾個途徑實現(xiàn)的：(1)糖酵解增加；(2)葡萄糖自氧化；(3)多元醇通路通量增加；(4)晚期糖化終產(chǎn)物(AGE)的形成增加；(5)蛋白激酶C(PKC)亞型激活；(6)己糖胺通路通量增加[13-14]。高脂導(dǎo)致海綿體組織的內(nèi)皮依賴性舒張的損傷和過氧化物形成增加，高脂同樣導(dǎo)致GMP循環(huán)形成障礙和后續(xù)的信號通路障礙[8]。本研究中DM組大鼠較Con組的血糖、TG、TC升高，這與先前的研究是一致的[3，11]。已有研究表明，貞清方的3個草藥成分能改善葡萄糖和脂質(zhì)的代謝。墨旱蓮廣泛應(yīng)用于預(yù)防高脂血癥和動脈粥樣硬化[14]。薯蕷在地塞米松誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中可以減少血液中的胰島素和葡萄糖含量[15]。女貞子可以抑制由四氧嘧啶和腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠血糖水平的升高[3]。本研究中糖尿病大鼠經(jīng)過4周的貞清方治療后，血糖水平顯著降低，這與先前的研究一致[3，11]。與此同時，ZQR組還顯著降低了血清TG、TC水平，這也提示了貞清方可能是通過抑制高糖和高脂來治療糖尿病性ED。

陰莖勃起時海綿體平滑肌松弛，這是通過釋放NO來完成的，這一過程中，NO激活鳥苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生更多的環(huán)磷鳥苷，環(huán)磷鳥苷作用于鈣離子通道，使平滑肌松弛，允許血液進入陰莖動脈和海綿竇間隙從而形成陰莖的勃起。因此，這一過程中NO的減少會影響正常的勃起功能。在糖尿病模型中，已經(jīng)有報道表明eNOS和nNOS的表達水平降低[7]。本研究發(fā)現(xiàn)貞清方可提高eNOS和nNOS的蛋白表達水平。有研究表明超氧化物陰離子與NO發(fā)生反應(yīng)進而形成過氧硝基鹽，這將導(dǎo)致NO的生物利用度下降。與此同時，過氧硝基鹽是一種高毒性的分子，將導(dǎo)致細胞凋亡和造成陰莖的小動脈內(nèi)皮細胞的損害。高濃度的過氧硝基鹽會導(dǎo)致高水平的ROS的產(chǎn)生，并啟動一連串的氧化還原反應(yīng)從而引起細胞凋亡，造成對內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元細胞的影響。并且內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元細胞的凋亡和細胞毒性也會降低eNOS和nNOS的表達[16-17]。eNOS和nNOS是產(chǎn)生NO的主要來源，NO是產(chǎn)生和維持勃起的關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)，eNOS和nNOS的降低勢必會導(dǎo)致NO產(chǎn)生減少，NO的減少勢必會導(dǎo)致ED的發(fā)生。所以ROS最終通過減少eNOS和nNOS的表達，進而損害勃起功能。貞清方能有效地阻止糖尿病大鼠陰莖海綿體中ROS的產(chǎn)生，并恢復(fù)eNOS和nNOS的表達，中斷由糖尿病引發(fā)ED的惡性循環(huán)。

綜上，貞清方可以通過降低糖尿病大鼠血糖和血脂，以及ROS的生成，進而增加eNOS和nNOS的表達，并且最終改善糖尿病大鼠的勃起功能。

[1] Yohannes E，Chang J，Tar M T，et al.Molecular targets for diabetes mellitus-associated erectile dysfunction[J].Mol Cell Proteomics，2010，9(3)：565-578.

[2] Mitkov M D，Aleksandrova I Y，Orbetzova M M.Effect of transdermal testosterone or alpha-lipoic acid on erectile dysfunction and quality of life in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Folia Med(Plovdiv)，2013，55(1)：55-63.

[3] Wen X，Zeng Y，Liu L，et al.Zhenqing recipe alleviates diabetic nephropathy in experimental type 2 diabetic rats through suppression of SREBP-1c[J].J Ethnopharmacol，2012，142(1)：144-150.

[4] Liu R T，Chung M S，Chuang Y C，et al.The presence of overactive bladder wet increased the risk and severity of erectile dysfunction in men with type 2 diabetes[J].J Sex Med，2012，9(7)：1913-1922.

[5] Weinberg A E，Eisenberg M，Patel C J，et al.Diabetes severity，metabolic syndrome，and the risk of erectile dysfunction[J].J Sex Med，2013，10(12)：3102-3109.

[6] Morelli A，Chavalmane A K，F(xiàn)ilippi S，et al.Atorvastatin ameliorates sildenafil-induced penile erections in experimental diabetes by inhibiting diabetes-induced RhoA/Rho-kinase signaling hyperactivation[J].J Sex Med，2009，6(1)：91-106.

[7] Li M，Zhuan L，Wang T，et al.Apocynin improves erectile function in diabetic rats through regulation of NADPH oxidase expression[J].J Sex Med，2012，9(12)：3041-3050.

[8] Shukla N，Jones R，Persad R，et al.Effect of sildenafil citrate and a nitric oxide donating sildenafil derivative，NCX911，on cavernosal relaxation and superoxide formation in hypercholesterolaemic rabbits[J].Eur J Pharmacol，2005，517(3)：224-231.

[9] Musicki B，Liu T，Lagoda G A，et al.Hypercholesterolemia-induced erectile dysfunction：endothelialnitric oxide synthase(eNOS)uncoupling in the mouse penis by NAD(P)H oxidase[J].J Sex Med，2010，7(9)：3023-3032.

[10] Fraga-Silva R A，Costa-Fraga F P，Savergnini S Q，et al.An oral formulation of angiotensin-(1-7)reverses corpus cavernosum damages induced by hypercholesterolemia[J].J Sex Med，2013，10(10)：2430-2442.

[11] Huang W，Yu J，Jia X，et al.Zhenqing recipe improves glucose metabolism and insulin sensitivity by repressing hepatic FOXO1 in type 2 diabetic rats[J].Am J Chin Med，2012，40(4)：721-733.

[12] Zhang Y，Yang J，Wang T，et al.Decreased endogenous hydrogen sulfide generation in penile tissues of diabetic rats with erectile dysfunction[J].J Sex Med,2016，13(3)：350-360.

[13] Amaral S，Oliveira P J，Ramalho-Santos J.Diabetes and the impairment of reproductive function：possible role of mitochondria and reactive oxygen species[J].Curr Diabetes Rev，2008，4(1)：46-54.

[14] Kim D I，Lee S H，Choi J H，et al.The butanol fraction of Eclipta prostrata(Linn)effectively reduces serum lipid levels and improves antioxidant activities in CD rats[J].Nutr Res，2008，28(8)：550-554.

[15] Gao X，Li B，Jiang H，et al.Dioscorea opposita reverses dexamethasone induced insulin resistance[J].Fitoterapia，2007，78(1)：12-15.

[16] Rosen R C，Kostis J B.Overview of phosphodiesterase 5 inhibition in erectile dysfunction[J].Am J Cardiol，2003，92(9A)：9-18.

[17] Gur S，Kadowitz P J，Hellstrom W J.A critical appraisal of erectile function in animal models of diabetes mellitus[J].Int J Androl，2009，32(2)：93-114.

ZhenqingRecipeImprovesDiabeticErectileDysfunctionthroughSuppressingROSProductioninExperimentalType2DiabeticRats

Li Mingchao1，Lin Huang1，Guo Shuiming2etal

1DepartmentofUrology(InstituteofUrology)，2DepartmentofNephrology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

ObjectiveTo investigate whether Zhenqing Recipe(ZQR)could ameliorate diabetes-related erectile dysfunction(ED)by reducing the reactive oxygen species(ROS)production.MethodsThirty 8-week-old healthy male SD rats were randomly divided into three groups：control group(group Con)，diabetic erectile dysfunction group(group DM)，and diabetic erectile dysfunction treated with Zhenqing Recipe group(group ZQR).Type 2 diabetic rat model was induced by intraperitoneal injection of small-dose streptozotocin after feeding with high glucose and high fat diets for four weeks.We screened out diabetic erectile dysfunction rats by apomorphine 10 weeks later.The course of treatment continued four weeks.And then blood glucose，triglyceride(TG)，cholesterol total(TC)，mean arterial pressure(MAP)，intracavernouspressure(ICP)，expression levels of nNOS and eNOS protein were measured by Western blotting.ResultsCompared with the control group，the levels of blood glucose and MDA were remarkably increased in diabetic rats.ZQR remarkably reduced levels of blood glucose and MDA of diabetic rats.Compared with the control group，the ratio of maximum ICP-to-MAP(maxICP/MAP)was significantly decreased in diabetic ED rats.ZQR improved erectile function of the diabetic ED rats.Expression levels of nNOS and eNOS protein were reduced as compared to those of control rats.ZQR significantly enhanced their expression levels in diabetic rats.ConclusionZQR can ameliorate type 2 diabetic ED by reducing the ROS production.

Zhenqing Recipe； diabetes mellitus； erectile dysfunction； reactive oxygen species

*國家自然科學基金資助項目(No.81300477)

李明超，男，1982年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學博士，E-mail：chaoren149@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：jhliu@tjh.tjmu.edu.cn(劉繼紅)；tjhwt@126.com(王濤)

R698.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.001

(2017-06-15 收稿)