產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌的篩選及水解大豆異黃酮糖苷研究

劉宏麗，郭曉軍，狄聰穎, 郭威，朱寶成

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000)

產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌的篩選及水解大豆異黃酮糖苷研究

劉宏麗，郭曉軍，狄聰穎, 郭威，朱寶成

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000)

為獲得能高效水解大豆異黃酮糖苷的芽孢桿菌，利用七葉苷平板分離法從動物的新鮮糞便中篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌菌株，然后對酶活最高的菌株進行種屬鑒定和水解大豆異黃酮糖苷的研究.結(jié)果顯示：篩選到1株酶活力較高的芽孢桿菌R2-2，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)；該菌株有較高的糖苷水解能力，黃豆苷水解率最高達到53.65%，染料木苷為48.80%.

β-葡萄糖苷酶；芽孢桿菌；篩選；大豆異黃酮糖苷

大豆異黃酮(soybean isoflavones)具有較好的抗氧化、延緩衰老、防癌抗癌、增強免疫力及改善動物生產(chǎn)性能等功能[1-3]，已被廣泛應(yīng)用于生物、飼料、醫(yī)藥和食品保健等領(lǐng)域.大豆中天然存在的大豆異黃酮通常以3種游離苷元、9種結(jié)合型糖苷形式存在，其中結(jié)合型糖苷約占總量的97%～98%，游離型苷元僅占2%～3%[4-5].豆粕中的大豆異黃酮以糖苷形式存在，而具有生理活性的成分主要是大豆異黃酮的游離苷元，只有轉(zhuǎn)化為苷元，才能提高大豆異黃酮的活性[6].β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)可水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-糖苷鍵，同時釋放葡萄糖和相應(yīng)配基[7].目前獲得的高活性大豆異黃酮糖苷水解酶主要來源于植物和微生物[8-9].微生物法轉(zhuǎn)化大豆異黃酮因具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、不易變性、成本低、無污染等優(yōu)點而成為研究熱點.

本實驗旨在篩選出產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌，能夠高效水解大豆異黃酮糖苷為游離苷元，為提高豆粕中大豆異黃酮的活性提供菌種材料.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

新鮮獺兔糞樣：來源于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程實驗室.

1.1.2 培養(yǎng)基

纖維二糖培養(yǎng)基：酵母膏 2.5 g，纖維二糖 2.5 g，蛋白胨 2.5 g，(NH4)2SO41.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.2 g，pH 7.2，蒸餾水1 000 mL[10].

七葉苷篩選培養(yǎng)基：酵母膏 5.0 g，蛋白胨 15.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，體積分?jǐn)?shù)為0.1%的七葉苷和3 g/L檸檬酸高鐵銨，pH 7.0，蒸餾水1 000 mL[11].

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 3.0 g，Mandels微量元素溶液(1 000×)，pH自然，蒸餾水1 000 mL.

1.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶芽孢桿菌的篩選

1.2.1 富集培養(yǎng)

取新鮮糞便樣品1.0 g置于99.0 mL加玻璃珠的滅菌生理鹽水中，振蕩30 min，接種于纖維二糖培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h.

1.2.2 篩選

取1.0 mL富集培養(yǎng)液進行梯度稀釋，然后取10-7～10-4倍稀釋液涂布七葉苷篩選平板，37 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察并挑選出菌落周圍或背面顯現(xiàn)黑色的菌落.將初篩分離得到的菌株接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后離心取上清液，采用DNS法測定酶活力[11-12].每個菌株進行3次重復(fù).選取酶活力最高的菌株進行后續(xù)研究.酶活單位采用國際定義方法：在實驗條件下，1 mL酶液每min分解底物生成1 μmol葡萄糖所需酶量定義為1個酶活單位，用U/mL表示.

1.3 菌株種屬鑒定

1.3.1 形態(tài)特征

將菌株接種于NB培養(yǎng)基及NA平板培養(yǎng)基上，分別進行菌體及菌落形態(tài)觀察.菌株革蘭氏染色、芽孢染色參考文獻[13]進行.

1.3.2 16S rRNA基因序列測定、分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

細(xì)菌基因組DNA 的提取和 16S rRNA基因的擴增參照楊繼業(yè)[14]的方法，PCR產(chǎn)物送交北京華大基因科技股份有限公司進行測序.與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進行在線同源性序列分析，選取同源性較高的序列，采用MEGA.5軟件進行多序列比對，建立進化樹.

1.3.3 生理生化特性測定

根據(jù)菌株的16S rRNA基因序列分析的初步結(jié)果，依據(jù)文獻[15]進行生理生化特征的測定，觀察并記錄結(jié)果.

1.4 水解大豆異黃酮糖苷研究

大豆異黃酮糖苷水解方法參考文獻[16].

大豆異黃酮糖苷水解率計算公式W=(A-B)/A×100%.

式中，W為大豆異黃酮水解率；A為酶解前大豆異黃酮糖苷含量；B為酶解后大豆異黃酮糖苷含量.

高效液相色譜分析條件為色譜柱：Waters C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：260 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；流動相：體積分?jǐn)?shù)為0.1%的冰醋酸+乙腈∶甲醇∶水=30∶10∶60(體積比).

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選

由于七葉苷(6,7-2-羥基-香豆素-β-D-葡萄糖苷)被β-葡萄糖苷酶分解會釋放出七葉素(6,7-2-羥基-香豆素)，七葉素能與Fe3+反應(yīng)形成黑色化合物，可依據(jù)菌落背面或周圍顯現(xiàn)黑色來篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，如圖1.經(jīng)纖維二糖培養(yǎng)基富集培養(yǎng)后，利用七葉苷分離培養(yǎng)基分離篩選、純化獲得18株產(chǎn)酶較高的菌株.

圖1 菌株篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of aesculin separation culture medium

將初篩獲得的菌株進行產(chǎn)酶發(fā)酵，提取粗酶液，按照酶活測定方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定菌株酶活，進行復(fù)篩.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為Y=0.009X+0.004，R2=0.998.各菌株的β-葡萄糖苷酶活性見表1，選取酶活最高且產(chǎn)芽孢的R2-2進行后續(xù)研究.

表1 各菌株發(fā)酵液的β-葡萄糖苷酶活力測定結(jié)果

2.2 產(chǎn)酶菌株的種屬鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

菌株R2-2的菌落、菌體和芽孢觀察結(jié)果如圖2所示，其形態(tài)特征見表2.

a.菌落；b.菌體(×1 000)；c.芽孢(×2 000).圖2 菌株R2-2的菌落、菌體和芽孢Fig.2 Colony，mycelium and spore of strain R2-2

項目形態(tài)項目形態(tài)菌落形狀圓形菌體形態(tài)桿狀菌落大小中偏小革蘭氏染色+菌落顏色白色，邊緣灰色菌體大小(1．82～1．93μm)×0．65μm菌落邊緣不規(guī)則異染粒染色+光學(xué)特性不透明芽孢形態(tài)圓柱形或橢圓形菌落表面干燥，有火山口芽孢著生位置端生或次端生

+代表陽性；-代表陰性.

2.2.2 16S rRNA基因序列測定、分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

經(jīng)測定，菌株R2-2的16S rRNA基因序列的長度為1 275 bp.將基因序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫獲得登錄號MF000350.與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進行在線同源性序列分析.采用 MEGA.5軟件進行多序列比對，用鄰位連接法構(gòu)建發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果顯示菌株R2-2與Bacillusamyloliquefaciens親緣關(guān)系最接近.

圖3 R2-2菌株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequence of strain R2-2

2.2.3 生理生化實驗

各菌株部分生理生化實驗結(jié)果見表3.根據(jù)菌株R2-2的形態(tài)學(xué)特征、16S rRNA 比對分析和生理生化實驗結(jié)果，參照中國典型培養(yǎng)物保藏中心、中國科學(xué)院微生物研究所提供的菌屬特征描述，可將菌株R2-2鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens).

表3 菌株R2-2部分生理生化實驗結(jié)果

2.3 水解大豆異黃酮糖苷

大豆異黃酮酶解前后產(chǎn)物的HPLC圖譜及分析見圖4、表4.

由圖4a知黃豆苷出峰時間為4 min左右，染料木苷出峰時間為5 min左右，黃豆苷元出峰時間為9 min左右，染料木素出峰時間為15 min左右.由圖4b可知大豆異黃酮酶解前圖中含有黃豆苷和染料木苷峰，而黃豆苷元和染料木素的峰非常小，未見黃豆黃苷與黃豆黃素.這是因為黃豆黃素苷類主要存在于大豆胚芽中，在豆粕的提取物中檢測不到[17].有少量苷元存在是由于大豆自身含有少量的大豆β-葡萄糖苷酶，有一定的水解能力，但酶活較低[18].將酶解后異黃酮產(chǎn)物進行HPLC檢測，結(jié)果如圖4c，仍可見到黃豆苷、染料木苷的峰，同時檢測到黃豆苷元和染料木素的峰，可以認(rèn)定實驗菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶具有水解大豆異黃酮糖苷的能力.

經(jīng)計算(表4)酶解之后大豆異黃酮糖苷含量明顯減少，苷元含量明顯增加.經(jīng)菌株R2-2所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶水解，黃豆苷的峰面積從54.20%降低到25.12%，水解率達到53.65%.染料木苷的峰面積從41.92%降低到21.59%，水解率達到48.8%.黃豆苷元的峰面積由2.02%增加到22.08%；染料木素的峰面積由1.5%增加到16.88%.大豆異黃酮糖苷總水解率達51.40%.黃豆苷元的含量增加了10.93倍，染料木素含量增加了11.25倍，游離型苷元含量明顯增加.由結(jié)果可知實驗所得菌株具有較高的糖苷水解能力，可大大提高大豆異黃酮的活性.

表4 大豆異黃酮酶解前后單體變化及糖苷水解率

a.大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品;b.大豆異黃酮酶解前;c.大豆異黃酮酶解后.1.黃豆苷;2.染料木苷;3.黃豆苷元;4.染料木素.圖4 大豆異黃酮酶解前后HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram before and after enzymatic hydrolysis of soybean isoflavone

3 討論

大豆異黃酮苷元可促進動物生長、提高繁殖能力、增強機體免疫，是一種優(yōu)質(zhì)的生物活性物質(zhì).豆粕中的大豆異黃酮主要為糖苷形式[19]，糖苷形式的大豆異黃酮不能被哺乳動物腸道直接吸收，必須經(jīng)微生物產(chǎn)生的糖苷酶除去糖基，生成的苷元才能發(fā)揮生物活性[20].用于轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷的酶有β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶等，研究最多的是β-葡萄糖苷酶[21].國內(nèi)外對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選及研究多集中在真菌(如曲霉[22-23]、木霉[24-25]、酵母菌[26-27]等)、雙歧桿菌[9，28]、乳酸桿菌[29]，對芽孢桿菌的研究較少.曲霉、木霉等真菌是好氧菌，而豆粕發(fā)酵為厭氧發(fā)酵；酵母菌雖然是兼性厭氧菌，但酶活較低[27]；雙歧桿菌和乳酸桿菌的產(chǎn)酶能力往往受到營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件的影響[30].以上各菌在應(yīng)用于豆粕發(fā)酵時均會受到不同的限制，不利于實際生產(chǎn).

Bau′等[31]檢測了開菲爾發(fā)酵劑發(fā)酵豆乳過程中大豆異黃酮成分含量變化，黃豆苷元增加了9倍，染料木素增加了4.8倍.Raimondi[28]利用22株雙歧桿菌轉(zhuǎn)化黃豆苷，B.adolescentisMB243菌株轉(zhuǎn)化48 h時β-葡萄糖苷酶酶活為0.47 U/mg，培養(yǎng)7 d黃豆苷水解率100%，苷元增加97%.本實驗利用菌株R2-2發(fā)酵的粗酶液進行大豆異黃酮糖苷水解，反應(yīng)30 min黃豆苷和染料木苷的水解率即達到53.65%和48.80%.黃豆苷元和染料木素的含量分別增大了10.93倍和11.25倍，水解大豆異黃酮糖苷效果顯著.王彩肖[32]等誘導(dǎo)S1酵母菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力提高到0.011 3 U/mL.陳紅漫[33]等篩選到1株β-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌ZL-110，酶活為0.277 U/mL.實驗篩得解淀粉芽孢桿菌R2-2酶活達0.283 U/mL，不低于以上報道.本實驗利用七葉苷顯色原理從動物糞便中篩選到產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌R2-2.芽孢桿菌由于具有其他菌屬不具備的生產(chǎn)和應(yīng)用的優(yōu)越性，如適應(yīng)性強、繁殖周期短、兼性厭氧等，有利于進行菌劑的工業(yè)生產(chǎn)，為進一步豆粕發(fā)酵研究奠定菌種基礎(chǔ)，對豆粕的綜合利用和提高其附加值具有重要意義.

[1] 李萬林，鐘姣姣，王少龍,等.大豆異黃酮生理功能及其檢測方法的研究進展[J].飲料工業(yè)，2014，17(4):54-59.

LI W L，ZHONG J J，WANG S L,et al.Research progresses in physiological functions of and detection methods for soybean isoflavones[J].Beverage Industry，2014,17(4):54-59.

[2] 何恩銘，沈瑞池，林志楷，等.大豆異黃酮抗腫瘤效應(yīng)研究進展[J].亞熱帶植物科學(xué)，2013，42(4):356-360.DOI: 10.3969/j.issn.1009-7791.2013.04.019.

HE E M，SHEN R C，LIN Z K，et al.A review on anti-tumor effects of soy isoflavones[J].Subtropical Plant Science，2013,42(4):356-360.DOI: 10.3969/j.issn.1009-7791.2013.04.019.

[3] 羅佳捷，范覺鑫，張彬.大豆異黃酮在動物生產(chǎn)中的研究進展[J].飼料博覽，2012，1:9-11.DOI: 10.3969/j.issn.1001-0084.2012.01.004.

LUO J J，F(xiàn)AN J X，ZHANG B.Research progress of soybean isoflavone in animal production[J].Feed Review，2012,1:9-11.DOI: 10.3969/j.issn.1001-0084.2012.01.004.

[4] KUMAR N B，CANTOR A，KATHY A R D，et al.The specific role of isoflavones on estrogen metabolism in premenopausal women[ J].Cancer，2002，94(4): 1166 -1174.DOI: 10.1002/cncr.10320.

[5] 金鳳燮.天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2009:223 -243.

[6] ROUTLEDGE E J，PARKER J，ODUM J，et al.Some alkyl hydroxy benzoate preservatives (parabens) are estrogenic [J].Toxicology and Applied Pharmacology，1998，153 (1): 12-19.

[7] 楊曉寬.β-葡萄糖苷酶研究進展[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報，2012，26(1):77-81.DOI: 10.3969 / J.issn.1672-7983.2012.01.016.

YANG X K.Research progress onβ-glucosidase[J].Journal of Hebei Normal University of Science & Technology,2012,26(1):77-81.DOI: 10.3969 / J.ISSN.1672-7983.2012.01.016.

[8] HESSLER P E，LARSEN P E，CONSTANTINOU A I，et al.Isolation of isoflavones from soy-based fermentations of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea[J].Appl Microbiol Biotechnol，1997，47: 398-404.DOI: 10.1007/s002530050947.

[9] TSANGALIS D，ASHTON J F，MCGILL A E J，et al.Enzymatic transformation of isoflavone phytoestrogens in soy milk byβ-glucosidase-producingBifidobacteria[J].J Food Sci,2002,67:3104-3113.DOI: 10.1111/j.1365-2621.2002.tb08866.x.

[10] 潘艷，張益波，郭志敏，等.β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株篩選、誘變及其發(fā)酵的研究[J].食品研究與開發(fā)，2012，33(5):149-152.DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2012.05.043.

PAN Y，ZHANG Y B，GUO Z M，et al.Study on screening and mutation ofβ-Glucosidase-producing strain[J].Food Research and Development，2012，33(5):149-152.DOI: 10.3969/j.issn.1005-6521.2012.05.043.

[11] 黃琴，朱婷，蔣承建，等.產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌種的篩選鑒定及其酶學(xué)特性[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2011，30(5):590-595. DOI: 10.3969/gab.030.000590.

HUANG Q，ZHU T，JIANG C J，et al.Isolation，identification and the enzymatic characteristics of the strain producingβ-glucosidase[J].Genomics and Applied Biology，2011,30(5):590-595.DOI: 10.3969/gab.030.000590.

[12] 施特爾馬赫.酶的測定方法[M].錢嘉淵，譯.北京:中國輕工業(yè)出版社出版，1992：102-119.

[13] 沈萍，陳向東.微生物學(xué)實驗[M].第4版.北京：高等教育出版社，2007.

[14] 楊繼業(yè)，郭曉軍，郭威，等.產(chǎn)有機酸芽孢桿菌的篩選、鑒定及產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化[J].飼料工業(yè)，2015，369(4):44-51.DOI:10.13302/j.cnki.fi.2015.04.010.

YANG J Y，GUO X J，GUO W，et al.Screening and identification of a strain ofBacillussp.producing organic acids and optimization of its spore production conditions[J].Feed Industry，2015,369(4):44-51.DOI:10.13302/j.cnki.fi.2015.04.010.

[15] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[16] 齊斌，劉賢金.產(chǎn)大豆異黃酮β-葡萄糖苷酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品科學(xué)，2007，28(8): 290-293.DOI: 10.3321/j.issn:1002-6630.2007.08.069.

QI B，LIU X J.Study on screen of soybean isoflavoneβ-glucosidase-producing strain and its enzymatic properties[J].Food Science，2007,28(8): 290-293.DOI: 10.3321/j.issn:1002-6630.2007.08.069.

[17] 潘利華，羅建平，羅水忠，等.高活性大豆異黃酮糖苷酶的分離原料篩選、純化及性質(zhì)研究[J].食品科學(xué)，2009，30(1):164-168.DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.01.039.

PAN L H，LUO J P，LUO S Z，et al.Seleetion of plant source used for separating isoflavone-glucosidase with high aetivity and its purification and properties[J].Food Science，2009,30(1):164-168.DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.01.039.

[18] 高榮海，劉長江，李長彪，等.大豆異黃酮糖苷水解研究進展[J].糧食與油脂，2006(8): 10-12.DOI: 10.3969/j.issn.1008-9578.2006.08.003.

GAO R H，LIU C J，Ll C B，et al.Research advance on hydrolyzation of soybean isonavone glycoside[J].Cereals & Oils，2006(8): 10-12.DOI:10.3969/j.issn.1008-9578.2006.08.003.

[19] 崔洪斌.大豆生物活性物質(zhì)的開發(fā)與應(yīng)用[M].北京:中國輕工業(yè)出版社，2001:178-179.

[20] 于卓騰.大豆黃酮對仔豬腸道微生物的影響和雌馬酚產(chǎn)生菌的分離及其特性的研究[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

YU Z T.Effects of daidzein on the gastrointestinal mcicrobial community of piglets and isolation and study characterisation of equol-producing bacteria[D].Nanjing Agricultural University,2007.

[21] 楊守鳳，徐建雄.β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化大豆異黃酮及其保健功能的研究進展[J].飼料研究，2014，01:6-12.

[22] 劉德海，馬煥，謝復(fù)紅，等.一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶煙曲霉菌株的鑒定及其產(chǎn)酶特性[J].中國釀造，2015，34(6):118-122.DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.026.

LIU D H，MA H，XIE F H，et al.Identification ofβ-glucosidase producingAspergillusfumigatusand its enzyme production characteristics[J].China Brewing，2015，34(6):118-122.DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.026.

[23] 朱婧，覃擁靈，陳桂光，等.β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的選育及酶法轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)龍膽低聚糖[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(4):21-25.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2010.04.024.

ZHU J，QIN Y L，CHEN G G，et al.Selection of the highβ-glucosidase mutant and production of gentiooligosaccharid[J].Food and Fermentation Industries，2010,36(4):21-25.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2010.04.024.

[24] 張秋卓，蔡偉民.纖維素酶高產(chǎn)菌株的復(fù)合交替誘變選育[J].工業(yè)微生物，2008，38(6):32-37.DOI:10.3969/j.issn.1001-6678.2008.06.007.

ZHANG Q Z，CAI W M.Selecuion of high cellulase-yielding mutant by compound mutagenesis[J].Industrial Microbiology，2008,38(6):32-37.DOI:10.3969/j.issn.1001-6678.2008.06.007.

[25] KRISHNA S H，PRASANTHI K，CHOWDARY G V.Simultaneous saccharification and fermentation of pretreated sugar cane leaves to ethanol[J].Process Biochemistry,1998,33(8):825-830.DOI.org/10.1016/S0032-9592(98)00051-X.

[26] RICCARDO N B，GIOVANNI S，ROSA P，et al.Selection,characterization and compareson of β-glucosidase from mould and yeasts employable for enological application[J].Enzyme and Microbial Technology,2004,35:58-66.

[27] 蔣文鴻.昌黎與濟源產(chǎn)區(qū)高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶野生非釀酒酵母的篩選及鑒定[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

JIANG W H.Screening and identification of high producingβ-glucosidase wild non-saccharomyces Yeast strain from JIYUAN and CHANGLI[D].Yangling: Northwest A & F University，2014.

[28] RAIMONDI S，RONCAGLIA L，LUCIA M D，et al.Bioconversion of soy isoflavones daidzin and daidzein byBifidobacteriumstrains[J].Appl Microbiol Biotechnol，2009，81:943-950.DOI:1007/s00253-008-1719-4.

[29] SUBROTA HATI，SHILPA VIJ，BRIJ PAL SINGH.et al.β- Glucosidase activity and bioconversion of isoflavones during fermentation of soymilk[J].J Sci Food Agric，2015，95: 216-220.DOI:10.1002/jsfa.6743.

[30] OTIENO D O，ASHTON J F，SHAH N P.Evaluation of enzymic potential for biotransformation of isoflavone phytoestrogen in soymilk byBifidobacteriumanimalis，LactobacillusacidophilusandLactobacilluscasei[J].Food Research International，2006，39(4): 394-407.DOI.:org/10.1016/j.foodres.2005.08.010.

[31] BAU′ T R，GARCIA S，IDA E I.Changes in soymilk during fermentation with kefir culture: oligosaccharides hydrolysis and isoflavone aglycone production[J].Food Sci Nutr，2015,66(8): 845-850.DOI:10.3109/09637486.2015.1095861.

[32] 陳紅漫，趙璐，楊佳影，等.一株產(chǎn)胞外中性β-葡萄糖苷酶菌株的鑒定及酶學(xué)特性研究[J].食品科學(xué)，2009，30(15)：160-163.DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.15.036.

CHEN H M，ZHAO L，YANG J Y，et al.Identification of a novelBacillusstrain capable of producing neutralβ-G lucosidase and characterization of its enzy matic properties[J].Food Science,2009，30(15): 160-163.DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.15.036.

[33] 王彩肖，武偉偉，李艷.產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶酵母菌的篩選及產(chǎn)酶性質(zhì)研究[J].釀酒科技，2014，10：14-18.DOI：10.13746/j.njkj.2014.0167.

WANG C X，WU W W，LI Y.Screening of yeast strains with high-yield ofβ-D-glucosidase and study on theirβ-D-glucosidase-producing properties[J].Liq-Mak Sci Technol,2014,10:14-18.DOI:10.13746/j.njkj.2014.0167.

ScreeningofBacillusstrainsproducingβ-glucosidaseandstudyonhydrolysisofsoybeanisoflavoneglycosides

LIUHongli，GUOXiaojun，DICongying，GUOWei，ZHUBaocheng

(College of Life Sciences，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China)

In order to obtainBacillusstrains capable of efficiently hydrolyze soybean isoflavone glycosides，this study screenedBacillusstrains producingβ-glucosidase from fresh feces of animals with the help of Aesculin separation culture medium.Then the strains with relatively higherβ-glucosidase activity were identified and the ability of hydrolyzing isoflavone glucosides were studied.The results showed that a strains ofBacillusR2-2 with relatively higherβ-glucosidase activity was screened out.The identity of strains R2-2 wasBacillusamyloliquefaciens.Strain R2-2 showed rather high efficiency in hydrolyzing isoflavone glucosides.The daidzin hydrolysis rate reached 53.65%，and genistin hydrolysis rate was 48.80%.

β-glucosidase;Bacillus; screen; soybean isoflavone glycosides

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.06.010

2017-03-28

河北省重點研發(fā)計劃農(nóng)業(yè)關(guān)鍵共性技術(shù)攻關(guān)專項(16226604D)；河北省技術(shù)創(chuàng)新引導(dǎo)計劃科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金專項(15C1303121015)；滄州市科技支撐計劃項目(161201007D)；保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(16ZN007)

劉宏麗(1990—)，女，河北衡水人，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生.E-mail:1559239136@qq.com

朱寶成(1962—)，男，河北滄州人，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)牧微生物應(yīng)用技術(shù)研究.

E-mail:zhu2222@126.com

S816

A

1000-1565(2017)06-0621-09

趙藏賞)