安吉白茶愈傷組織增殖培養(yǎng)及茶多酚的積累

林昱星，肖澤豐，田璧瑞，郝娜，王俊麗

(中央民族大學 生命與環(huán)境科學學院，北京 100081)

安吉白茶愈傷組織增殖培養(yǎng)及茶多酚的積累

林昱星，肖澤豐，田璧瑞，郝娜，王俊麗

(中央民族大學 生命與環(huán)境科學學院，北京 100081)

為了有效利用安吉白茶資源，以安吉白茶幼葉作為外植體，探討了不同植物生長調節(jié)劑對愈傷組織誘導、增殖及茶多酚積累的影響.研究結果表明，TDZ有利于愈傷組織的誘導、增殖及茶多酚的積累，當TDZ的質量濃度為 1.0 mg/L時，愈傷組織的誘導率為92.1%，茶多酚的質量分數為20.6%，表兒茶素的相對含量為5.3%.

安吉白茶；愈傷組織；茶多酚；GC-MS分析

安吉白茶原產于浙江省安吉縣，是茶(Camelliasinensis(L.) O.Ktze.)的一種白化突變類型，春季幼葉呈白色.目前中國南方多地引種安吉白茶[1-3].

茶多酚是茶樹中重要的次生代謝產物，其具有多種藥理作用和保健功效.于淑池等[4]研究發(fā)現，安吉白茶所含的茶多酚是一種潛在天然抗氧化劑，可在食品和醫(yī)藥中廣泛應用.呂娜等[5]研究表明，安吉白茶含有黃酮類化合物，具有較強的抗氧化活性和清除自由基的作用.夏道宗等[6]研究發(fā)現，安吉白茶中的茶多糖可顯著抑制瘤株S180細胞和H22腹水型肝癌移植瘤的生長，可使荷S180實體瘤小鼠巨噬細胞的吞噬能力顯著提升.Hajiaghaalipour等[7]研究發(fā)現，白茶提取物能有效保護細胞系(3T3-L1)DNA免受損傷，并能抑制腫瘤細胞(HT-29)的增殖.此外，安吉白茶提取液對黃桿菌的生長有明顯的抑制作用，這種抑制作用是通過對菌體細胞膜的破壞和對磷代謝的干擾而實現的[8].

安吉白茶對高溫、干旱、低溫凍害、強光照射的耐受能力弱，加之采摘時間受限、產量較低，在市場中常出現供不應求的局面.因此本研究通過對安吉白茶的組織培養(yǎng)，探索細胞生物量快速增長的適宜條件，促進茶多酚的合成與積累，為茶多酚工業(yè)化生產奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與消毒處理

安吉白茶幼葉采自貴州省德江縣平原鄉(xiāng).幼葉先用自來水沖洗1 h，之后用體積分數為70%的乙醇消毒30 s，再用質量分數為0.1%的氯化汞溶液消毒8 min，最后用無菌水漂洗3～5次，備用.

1.2 接種與培養(yǎng)

在潔凈工作臺中，將無菌葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，進行接種培養(yǎng).所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，并添加蔗糖(30 g/L)和瓊脂(7 g/L)，pH值調至5.8左右，在121 ℃條件下滅菌20 min.培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強度為2 500～3 000 lx，光照時間為12 h/d.

1.3 愈傷組織的誘導

將消毒后的葉片外植體分別接種于含有不同質量濃度植物生長調節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，2,4-D、NAA、6-BA、KT、TDZ的質量濃度均為0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L.每個處理包含10瓶，每瓶接種5個葉片外植體，設置3次重復，于30 d后統(tǒng)計愈傷組織的誘導率.

1.4 愈傷組織增殖培養(yǎng)

選取生長狀態(tài)良好的愈傷組織切成小塊，接種到不同培養(yǎng)基中，每瓶接種0.8 g(鮮質量)，每個處理包含10瓶，設置3次重復，培養(yǎng)45 d后收獲愈傷組織并稱量鮮質量和干質量.

1.5 茶多酚含量測定

茶多酚含量測定方法參照GB/T 8313—2008，采用分光光度計進行測定.

1.6 愈傷組織醇提物的制備

準確稱取10 g磨碎的干愈傷組織或安吉白茶干葉片，加入250 mL體積分數為70%的甲醇，于70 ℃水浴中浸提10 min，重復浸提1次，合并上清液，抽濾，采用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，浸膏自然晾干.

1.7 醇提物GC-MS分析

準確稱取浸膏樣品0.12 g，取200 mL吡啶和100 mL的TMS在75 ℃水浴條件下硅烷化反應60 min，離心(8 000 r/min，10 min)，取上層液進樣，采用氣質聯用儀(AGILENT 5975/19091Z-433型)進行測定.所用毛細管柱為HP-35ms(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)，以He氣為載氣，液體流速為 1 mL/min，進樣量為1 μL，進樣口溫度為280 ℃.電子轟擊(El)源，電壓 70 eV，掃描 20～800 amu，借助質譜數據庫NISTOS進行成分分析.

1.8 統(tǒng)計方法

數據分析采用SPSS 18.0軟件中的ANOVA (one-way anova statistics)程序，采用Duncan比較法進行分析.

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的誘導

研究發(fā)現，培養(yǎng)基分別添加不同質量濃度的單一植物生長調節(jié)劑(2,4-D、NAA、6-BA、KT、TDZ)時，愈傷組織的誘導效應明顯不同(表1).

培養(yǎng)基中附加不同質量濃度(0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L)的2,4-D時，30 d后僅能誘導出少量乳白色愈傷組織.當2,4-D質量濃度為1.0 mg/L時，葉片愈傷組織的誘導率為75.7%，但隨著2,4-D質量濃度的升高，誘導率明顯降低.

表1 2,4-D、NAA、6-BA和TDZ對安吉白茶愈傷組織誘導的影響

培養(yǎng)基附加不同質量濃度的NAA時所誘導出的愈傷組織也為乳白色，且質地較硬.當NAA的質量濃度為1.0～4.0 mg/L時，愈傷組織的誘導率為86.0%～87.0%.將外植體接種于含有不同質量濃度6-BA的培養(yǎng)基中，30 d后能誘導出黃綠色的愈傷組織，但誘導率不高，最高值僅為60.6%.

培養(yǎng)基中分別附加不同質量濃度(0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L)的TDZ時，15 d左右就可誘導出疏松的紅色愈傷組織.當TDZ質量濃度為1.0 mg/L時，誘導率最高，達92.1%.

然而，當MS培養(yǎng)基中附加KT時，無論其質量濃度高低，均不能誘導出愈傷組織.

2.2 愈傷組織的生長動態(tài)

將愈傷組織切成小塊，接種在MS+TDZ 1.0 mg/L培養(yǎng)基上，每瓶接種0.8 g(鮮質量)，每隔5 d取3瓶稱量其鮮質量和干質量(于50 ℃烘箱中烘干)，重復3次.細胞生長動態(tài)如圖1.

a.鮮質量，b.干質量.圖1 愈傷組織生長動態(tài)曲線Fig.1 Growth curve of callus

從圖1可以看出，安吉白茶愈傷組織的鮮質量和干質量在第11～45 d處于快速增長期，至第45 d時生長量達到最大值.因此，第45 d是采收愈傷組織的最佳時間.

2.3 愈傷組織的增殖

將愈傷組織接種到添加不同質量濃度的IAA、6-BA和TDZ的MS培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，其增殖效應如表2所示.

表2 IAA、6-BA和TDZ對愈傷組織增殖的影響

從表2中可以看出，IAA和TDZ有利于愈傷組織的增殖.當IAA質量濃度為1.0 mg/L時，愈傷組織的鮮質量和干質量到達最大值，分別為10.7 g和0.83 g，分別增長了13倍和20倍.當培養(yǎng)基中添加不同質量濃度的TDZ時，所增殖的愈傷組織大部分呈紅色，質地較疏松.當TDZ質量濃度為1.0 mg/L時，愈傷組織的鮮質量和干質量達到最大值，分別為13.3 g和0.81 g，分別增長了16倍和20倍.

2.4 不同愈傷組織中茶多酚的含量

選取不同愈傷組織測定茶多酚的含量，以栽培植株葉片為對照組，其結果見表3.

表3 不同愈傷組織中茶多酚含量

從表3可知，MS培養(yǎng)基中附加TDZ 1.0 mg/L時，愈傷組織中茶多酚的質量分數高達20.6%，是栽培植株的葉片茶多酚含量的1.6倍，因此MS+TDZ 1.0 mg/L是茶多酚積累的最佳培養(yǎng)基.

2.5 不同愈傷組織中化學成分的比較

不同愈傷組織的醇提物的GC-MS分析結果如表4所示.從6個樣品中共檢出氨基酸類、多酚類、酯類、羧酸類、醇類、胺類、生物堿等48種成分.6個樣品中均檢測出表兒茶素，其相對含量分別為2.09%、2.08%、5.08%、2.14%、5.30%、2.90%，表兒茶素相對含量最高的是樣品5；此外，只在樣品2、3、5中檢測到了芥子酸.

表4 不同樣品的GC-MS分析

續(xù)表4

3 討論

3.1 愈傷組織的誘導與增殖

植物生長調節(jié)劑的種類和濃度是愈傷組織誘導成功的關鍵.本研究發(fā)現，KT不能誘導愈傷組織的產生.2,4-D、NAA、6-BA雖能誘導出愈傷組織，但愈傷組織均生長緩慢，且褐化嚴重，不利于增殖培養(yǎng).TDZ有利于愈傷組織的誘導和增殖，尤其是當TDZ質量濃度為1.0 mg/L時愈傷組織的誘導效果最好，誘導率可達到92.1%，且愈傷組織生長旺盛，增殖最快.薛寒青等[9]研究發(fā)現，TDZ有利于大蒜愈傷組織的誘導.康大力等[10]研究發(fā)現，質量濃度為1.0 mg/L 的TDZ有利于喜樹愈傷組織的生長.Wang等[11]研究也發(fā)現，單獨使用TDZ時，狼毒愈傷組織的增殖效應明顯.

3.2 愈傷組織中茶多酚的積累

本研究發(fā)現，在培養(yǎng)基中添加IAA、TDZ有利于茶多酚的積累，而培養(yǎng)基中添加2,4-D、NAA則不利于茶多酚的積累.MS+IAA 1.0 mg/L和MS+TDZ 1.0 mg/L培養(yǎng)的愈傷組織茶多酚含量分別為17.0%和20.6%，遠高于栽培植株的葉片茶多酚質量分數(12.94%).而杜鴻標等[12]研究發(fā)現，在培養(yǎng)基中附加KT、2,4-D時，有利于金牡丹茶愈傷組織茶多酚的合成，與本研究結果不一致，這可能是由于品種間的差異所致.

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CallusproliferationandaccumulationofteapolyphenolsofAnjiBaicha

LINYuxing，XIAOZefeng，TIANBirui，HAONa，WANGJunli

(College of Life and Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081，China)

For utilization of Anji Baicha，the effects of different plant growth regulators on callus，proliferation and accumulation of tea polyphenols of Anji Baicha were investigated using leaf as explants.The results showed that TDZ was more effective for callus induction，proliferation and accumulation of tea polyphenols.The callus induction frequency reached 92.1 % when the concentration of TDZ was as high as 1.0 mg/L.The mass fraction of tea polyphenols was 20.6%，and the relative abundance of epicatechin increased to 5.3%.

Anji Baicha; callus proliferation; tea polyphenols; GC-MS analyses

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.06.009

2016-09-20

國家重大科學儀器設備開發(fā)專項(2012YQ03026108)；高等學校學科創(chuàng)新引智計劃資助項目(B08044)；一流大學一流學科建設項目(ydzxxk201619)

林昱星(1992—)，女，新疆烏魯木齊人，中央民族大學在讀碩士研究生，主要從事生物資源保護和利用方面的研究.E-mail：1011421595 @qq.com

王俊麗(1964—)，女，河北新樂人，中央民族大學教授，博士生導師，主要從事植物細胞工程及資源利用研究.

E-mail：wangjunli1698@163.com

Q945

A

1000-1565(2017)06-0614-07

趙藏賞)