黃連對(duì)羥苯基丙酮酸雙加氧酶的原核表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)

梁玉玲，佐藤文彥

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071002； 3. 京都大學(xué) 大學(xué)院，日本 京都 606-8502)

黃連對(duì)羥苯基丙酮酸雙加氧酶的原核表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)

梁玉玲1，2，佐藤文彥3

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071002； 3. 京都大學(xué) 大學(xué)院，日本 京都 606-8502)

為了研究黃連對(duì)羥苯基丙酮酸雙加氧酶(CjHPPD)的功能和性質(zhì)，在E.coli中異源表達(dá)其編碼cDNA得到了重組的CjHPPD． 經(jīng)HPLC和LC-MS檢測(cè)確定重組CjHPPD具有催化對(duì)羥苯基丙酮酸形成尿黑酸的酶活性．酶學(xué)特性分析表明，CjHPPD催化尿黑酸形成的最適pH值為6.5，產(chǎn)物尿黑酸的積累至少在反應(yīng)開始10 min內(nèi)隨時(shí)間呈線形增長，最適反應(yīng)溫度為30 ℃．以ρ-HPP為底物進(jìn)行底物親和性分析表明，CjHPPD符合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)曲線，Km值為43.2 μmol/L．結(jié)果表明，CjHPPD的Km值明顯高于其他已報(bào)道的植物HPPD的Km值，高Km使得CjHPPD具有較強(qiáng)除草劑抗性．

黃連；對(duì)羥苯基丙酮酸雙加氧酶；原核表達(dá)；酶學(xué)性質(zhì)；Km值

對(duì)羥苯基丙酮酸雙加氧酶(ρ-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD；EC.1.13.11.27)是生物體中酪氨酸分解代謝的重要酶[1]．催化對(duì)羥苯基丙酮酸(ρ-hydrotyphenylpyruvate，HPP)與O2形成尿黑酸(homogentisate)，包括了氧化脫羧、羥基化和分子內(nèi)重排等反應(yīng)過程[2-3]．HPPD廣泛存在于除少數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌之外的幾乎所有需氧生物中[4]，是一種含非血紅素Fe2+、依靠α-酮酸的雙加氧酶，鐵原子以非血紅素Fe2+作為酶的活性輔助因子參與了該復(fù)雜的反應(yīng)過程．在植物和光合細(xì)菌中，尿黑酸還參與質(zhì)體醌和生育酚生物合成途徑．HPPD是質(zhì)體中這兩類重要異戊二烯醌類物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶，HPPD酶活性喪失或者受到抑制時(shí)，對(duì)植物細(xì)胞的直接影響是抑制質(zhì)體醌和生育酚的合成，間接影響是抑制類胡蘿卜素的合成．后者引起類胡蘿卜素生物合成途徑的中間產(chǎn)物八氫蕃紅素的積累和質(zhì)體的光氧化發(fā)生[5]，導(dǎo)致植物生長緩慢、葉片白化、枯死,直至整株植物死亡．HPPD成為新型除草劑靶標(biāo)酶和生育酚代謝途徑工程的重要酶類．

盡管HPPD在植物體中具有重要的作用，到目前為止，只從少數(shù)幾種植物中克隆了HPPD的編碼基因或cDNA，包括紫蘇(Coleusblumei)、大麥(Hordeumvulgare)、胡蘿卜(Daucuscarota)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、丹參(Salviamiltiorrhiza)毛狀根、水麻(Amaranthustuberculatus)等[6-11]．在植物組織中HPPD酶活性是低水平的，直接從植物體中分離HPPD酶蛋白困難較大．Garcia等[12]利用Southern雜交技術(shù)檢測(cè)擬南芥基因組中HPPD的拷貝數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，編碼HPPD的基因在整個(gè)基因組中只存在1個(gè)拷貝．在大麥中也只是檢測(cè)到HPPD的1個(gè)拷貝[6]．HPPD為新型除草劑靶標(biāo)酶，目前發(fā)現(xiàn)玉米和水麻對(duì)HPPD抑制劑型除草劑表現(xiàn)出抗性，但是其抗性產(chǎn)生原因是植物對(duì)抑制劑的代謝，而不是其HPPD對(duì)抑制劑具有抗性[9,11]．前期研究發(fā)現(xiàn)黃連(Coptisjaponica)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)HPPD抑制型除草劑DTP(destosyl pyrazolate)具有抗性并克隆了HPPD cDNA[13]，本文通過在E.coli中異源表達(dá)具有活性的重組蛋白，研究其酶學(xué)特性，對(duì)進(jìn)一步研究其抗性產(chǎn)生機(jī)理具有重要意義．

1 材料與方法

1.1 材料

攜帶有黃連hppd開放閱讀框架(ORF)的克隆載體pGEM-T easy/Cjhppd由本實(shí)驗(yàn)室保存;原核表達(dá)載體pET-21 d購自Novagen公司;大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3) 購自Promerga公司．

1.2 方法

1.2.1 Cjhppd原核表達(dá)載體構(gòu)建

用PCR方法從pGEM-T easy/Cjhppd擴(kuò)增Cjhppd片段．上游引物 Fw：5′-TACTAACCATGGTTCCCAGCACAGCCTCCA-3′，該引物引入1個(gè)包含翻譯起始密碼子ATG的限制性酶NcoI酶切位點(diǎn)(劃線部分)；下游引物 Rv：5′-TATGAATTCTCAAATGCAACTATGCAGCAACA-3′與cDNA的3'-末端序列互補(bǔ)，在終止密碼子TGA后面加上1個(gè)EcoRI 限制性酶切位點(diǎn)(劃線部分)．PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性 94 ℃ 2 min；30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括94 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min；最后68 ℃延伸5 min．PCR產(chǎn)物回收純化后，用限制性內(nèi)切酶NcoI/EcoRI消化，與經(jīng)同樣限制酶消化的表達(dá)載體pET-21 d連接得到pET-21 d/Cjhppd．轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，涂布LB+100 μg/mL Amp平板，37 ℃過夜培養(yǎng)．經(jīng)菌落PCR和限制性酶切鑒定的陽性質(zhì)粒pET-21 d/Cjhppd，以pET載體特異性引物T7 promoter primer 和T7 terminator primer對(duì)重組質(zhì)粒的插入DNA片段進(jìn)行雙向測(cè)序確保PCR擴(kuò)增中沒有引入錯(cuò)誤堿基后，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素篩選陽性菌落，經(jīng)菌落PCR和限制性酶切提取質(zhì)粒鑒定陽性轉(zhuǎn)化子．

1.2.2 Cjhppd在大腸桿菌中的異源表達(dá)與重組蛋白提取

挑取重組菌株單菌落，接種于5 mL LB+100 μg/mL Amp液體培養(yǎng)基中(50 mL三角瓶中)，37 ℃，150 r/min過夜預(yù)培養(yǎng)，取1 mL預(yù)培養(yǎng)菌液接種于100 mL LB+100 μg/mL Amp液體培養(yǎng)基中(500 mL三角瓶中)振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.6 時(shí)加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)后，8 000 r/min 4 ℃離心5 min收集菌體．用蛋白質(zhì)提取緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，10%(體積分?jǐn)?shù))甘油，10 mmol/L巰基乙醇)重懸菌體，超聲波破碎菌體，離心收集蛋白質(zhì)粗提液，按照GE Healthcare PD-10 column操作手冊(cè)脫鹽處理后得到重組CjHPPD酶液，每管200 μL分裝，-80 ℃保存，同時(shí)以空載體轉(zhuǎn)化菌pET-21d(BL21(DE3))做同樣處理作為對(duì)照．

1.2.3 重組蛋白CjHPPD的酶活性測(cè)定

1.2.3.1 酶促反應(yīng)體系和對(duì)照反應(yīng)體系 標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)體系為100 μL反應(yīng)體系中含100 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液(pH 6.5)，50 mmol/L抗壞血酸，10 μL(37.18 μg脫鹽蛋白)酶液，200 μmol/L對(duì)羥苯基丙酮酸(pH 7.7，購自Aldrich公司)．反應(yīng)以加入底物ρ-HPP開始，反應(yīng)體系在30 ℃保溫5 min．反應(yīng)體系中加入終質(zhì)量濃度為20 g/L的TCA停止反應(yīng)，渦旋混勻后-80 ℃保存．測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)取出凍存樣品冰浴融化后，14 000 r/min 4 ℃ 離心5 min沉淀反應(yīng)液中的蛋白質(zhì)成分(按照實(shí)驗(yàn)具體情況，此離心步驟也可在停止反應(yīng)后立即完成)，收集上清液用于HPLC和LC-MS測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物尿黑酸．酶學(xué)特性分析時(shí)對(duì)酶促反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH值、底物濃度等作相應(yīng)調(diào)整．米氏常數(shù)Km值計(jì)算利用Kaleida Graph(Synergy Software，Reading，PA)軟件．

在確定酶催化活性實(shí)驗(yàn)中除標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系外，還設(shè)立了對(duì)照反應(yīng)體系，分別為： 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中不加入反應(yīng)底物對(duì)羥苯基丙酮酸； 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中不加入酶溶液；標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中加入經(jīng)100 ℃加熱處理10 min的變性酶液取代酶溶液．

1.2.3.2 HPLC 測(cè)定酶促反應(yīng)產(chǎn)物 通過測(cè)定酶促反應(yīng)體系中產(chǎn)物尿黑酸的形成及產(chǎn)量來確定酶的活性．HPLC檢測(cè)使用Shimadzu LC-10A型高效液相色譜儀，Shimadzu SPD-10A紫外檢測(cè)器，Shimadzu C-R7A色譜處理機(jī)，C18反向柱(Inertsil ODS-3 (4.6 mm×250 mm; GL Sciences Inc．)；流動(dòng)相為10 mmol/L乙酸∶甲醇=85∶15(體積比)，現(xiàn)用現(xiàn)配，超聲波處理10 min去除氣泡后使用；流速0．8 mL/min；柱溫40 ℃；樣品注入量50 μL；檢測(cè)波長280 nm，尿黑酸標(biāo)準(zhǔn)品(購自Sigma公司)作為對(duì)照．

1.2.3.3 LC-MS 檢測(cè)酶促反應(yīng)產(chǎn)物 采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS-2010A; Shimadzu，Kyoto，Japan)鑒定反應(yīng)產(chǎn)物尿黑酸．LC-MS 條件：流動(dòng)相為 20 mmol/L 醋酸銨(Ammonium acetate) pH 5.5，選擇SIM模式(掃描模式為負(fù)離子模式)，流速為0.5 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)280 nm UV吸收，尿黑酸標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照．

1.2.4 重組蛋白質(zhì)CjHPPD酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.4.1 酶促反應(yīng)時(shí)間 先在小離心管中分別加入上述反應(yīng)體系的緩沖液、抗壞血酸和底物，30 ℃恒溫水浴預(yù)保溫3 min，再加入酶溶液，開始計(jì)時(shí)．反應(yīng)時(shí)間分別為0、1、2、3、4、5、10、20 min，加入TCA終止反應(yīng)，HPLC法測(cè)定酶活性．

1.2.4.2 酶促反應(yīng)最適溫度 采用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，反應(yīng)溫度分別設(shè)定為10、15、20、25、30、37、40、45、50 ℃，反應(yīng)時(shí)間為5 min，加入TCA終止反應(yīng)，HPLC法測(cè)定酶活性．

1.2.4.3 酶促反應(yīng)最適pH值 使用不同的緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，醋酸-醋酸鉀緩沖液(KA Buffer，pH值分別為 4.5、5.0、5.5)；磷酸鉀緩沖液(KP Buffer，pH值分別為 5.5、6.0、7.0、7.5、8.0)；Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl Buffer，pH值分別為 7.5、8.0、8.5、9.0)．反應(yīng)條件為30 ℃，5 min．加入TCA終止反應(yīng)，HPLC法測(cè)定酶活性．

1.2.4.4Km值測(cè)定 100 μL標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)體系中改變底物的濃度，使底物終濃度分別達(dá)到2 、10、20、50、100 μmol/L，加入酶溶液開始反應(yīng)．反應(yīng)條件為30 ℃，5 min．加入TCA終止反應(yīng)，HPLC法測(cè)定酶活性．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Kaleida Graph(synergy software，reading，PA)軟件計(jì)算米氏常數(shù)Km值．

1.2.5 其他方法

采用質(zhì)量濃度100 g/L 的聚丙烯酰胺 SDS-PAGE分離重組蛋白，考馬斯亮藍(lán)(R250)染色，以確定重組酶蛋白分子質(zhì)量．采用Bradford方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[14]，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品．

2 結(jié)果

2.1 Cjhppd基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以克隆載體pGEM-T easy/Cjhppd為模板，在DNA聚合酶KOD Plus DNA polymease 催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得1.3 kb特異DNA片段，與預(yù)期片段大小一致(圖1)，膠回收特異產(chǎn)物后，用NcoⅠ/EcoRⅠ雙酶切．同時(shí)雙酶切載體pET-21d，凝膠電泳檢測(cè)回收的酶切插入片段和載體(圖2)．用DNA Ligation Kit進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布LB+100 μg/mL Amp平板，37 ℃過夜培養(yǎng)．

1.1 kb plus DNA 標(biāo)記；2-4.ORF PCR產(chǎn)物.圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Cjhppd ORF DNA片段Fig.1 Analysis of PCR product Cjhppd ORF by electrophroesis through agarose gel

1.1 kb Plus DNA 標(biāo)記；2.pET-21d 的 NcoⅠ+Eco RⅠ雙酶切；3,4．ORF DNA 的 NcoⅠ+Eco RⅠ雙酶切. 圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)載體和目的片段酶切產(chǎn)物Fig.2 Analysis of degisted pET-21d and inster byelectrophroesis through agarose gel

2.2 原核表達(dá)載體的鑒定及轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株

挑取生長的菌落進(jìn)行菌落PCR，使用目的片段的正向引物Fw作為上游引物，載體的T7 terminator primer作為下游引物，擴(kuò)增插入片段，以檢測(cè)插入片段的長度和插入片段的連接方向，篩選出了1個(gè)插入片段長度和方向都正確的陽性克隆(圖3)．提取重組菌質(zhì)粒DNA，分別用NcoⅠ和EcoRⅠ單酶切得到了線形DNA；用NcoⅠ/EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒DNA得到了預(yù)期長度的酶切片段(圖4)．說明Cjhppd的 ORF成功地構(gòu)建到了表達(dá)載體pET-21d中，使Cjhppd處于T7轉(zhuǎn)錄元件的控制之下．

用鑒定好的重組質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑取生長的單菌落，培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒DNA，對(duì)質(zhì)粒DNA 進(jìn)行NcoⅠ/EcoRⅠ限制性酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切片段，得到了預(yù)期長度1.3 kb的片段．對(duì)重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物為位于載體多克隆位點(diǎn)上下游的T7 promoterprimer 和T7 terminator primer，測(cè)序結(jié)果表明，插入片段核苷酸序列與CjhppdORF核苷酸序列完全相同．至此，將Cjhppd的開放閱讀框克隆到了大腸桿菌表達(dá)載體pET-21d中，并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中，獲得了Cjhppd的重組菌．

1.1 kb plus DNA 標(biāo)記；2.陽性對(duì)照；3-8.菌落PCR.圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)重組質(zhì)粒菌落PCR產(chǎn)物 Fig.3 Analysis of colony PCR product by electrophroesis through agarose gel

1.質(zhì)粒 DNA；2.λDNA/Hin d Ⅲ marker；3.Nco Ⅰ+Eco RⅠ雙酶切.圖4 HPPD-pET-21d 質(zhì)粒DNA限制性酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Analysis the products of restriction enzyme digested HPPD-pET-21d plasmid DNA by electrophroesis through agarose gel

2.3 Cjhppd 基因在大腸桿菌中的表達(dá)

挑取含有重組質(zhì)粒pET-21d/Cjhppd的重組大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，用終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)．30 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間為8 h時(shí)獲得了目的蛋白的高表達(dá)，其表達(dá)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量與CjHPPD蛋白質(zhì)的推測(cè)分子質(zhì)量47.3 ku基本吻合，而在轉(zhuǎn)入空載體對(duì)照中沒有此蛋白質(zhì)條帶，圖5為SDS-PAGE電泳圖譜．

2.4 重組CjHPPD的酶活性測(cè)定

HPPD作為酪氨酸分解代謝中的重要酶類以及植物質(zhì)體醌和生育酚合成途徑的關(guān)鍵酶，催化對(duì)羥苯基丙酮酸(HPP)合成尿黑酸(HMG)的反應(yīng)．提取重組CjHPPD制備酶液加入標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物作HPLC分析．結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)體系反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)圖譜含有與產(chǎn)物尿黑酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同的色譜峰(圖6a，b)，即檢測(cè)到了產(chǎn)物尿黑酸的形成．而在空載體對(duì)照菌蛋白提取液的反應(yīng)體系中沒有尿黑酸產(chǎn)物形成，只檢測(cè)到了底物對(duì)羥苯基丙酮酸的色譜峰(圖6c)．同時(shí)在其他幾種對(duì)照體系中也沒有檢測(cè)出尿黑酸(圖略)．

1.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記；2.空載體對(duì)照 (pET-21 d)； 3.pET-21d/CjHPPD.箭頭所指為預(yù)期的重組蛋白.圖5 Coptis japonica HPPD 在E．coli中表達(dá)的SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE analysis of overproduction of CjHPPD in recombinant E.coli

a．反應(yīng)產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品尿黑酸(HMG)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度100 μmol/L，樣品用量為25 μL；b．CjHPPD酶促反應(yīng)體系，10 μL酶液 (37.18 μg脫鹽蛋白)；c．空載體對(duì)照菌反應(yīng)體系.HMG為反應(yīng)產(chǎn)物尿黑酸；HPP為酶作用底物對(duì)羥苯基丙酮酸.圖6 CjHPPD酶促反應(yīng)體系反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig.6 HPLC chromatogram of CjHPPD reaction production

2.5 LC-MS鑒定反應(yīng)產(chǎn)物

為了進(jìn)一步確定產(chǎn)物是尿黑酸，對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)物又進(jìn)行了LC-MS檢測(cè)，檢測(cè)圖譜如圖7．實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，表達(dá)的CjHPPD重組酶蛋白能夠催化由對(duì)羥苯基丙酮酸形成尿黑酸的生化反應(yīng)，是有活性的酶蛋白．

2.6 重組CjHPPD的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.6.1 產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品HMG的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

精確配制產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品尿黑酸溶液，濃度分別為25、50 、75 、100 、200 μmol/L，混勻后加入TCA，渦旋，14 000 r/min離心5 min，使其與酶促反應(yīng)產(chǎn)物的處理方式一致．分別取上清液在相同色譜條件下進(jìn)樣50 μL，以HPLC峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)用Microsoft Excel 2003做出曲線如圖8，色譜產(chǎn)物吸收峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間呈現(xiàn)出正線性關(guān)系，所以，酶促反應(yīng)產(chǎn)物的色譜吸收峰面積可以表示出酶促反應(yīng)產(chǎn)物的生成量，即酶的活性．

HPP為底物對(duì)羥苯基丙酮酸；HMG為反應(yīng)產(chǎn)物尿黑酸.圖7 CjHPPD酶促反應(yīng)體系反應(yīng)產(chǎn)物的LC-MS分析圖譜Fig.7 LC-MS analysis of CjHPPD reaction product HMG

圖8 反應(yīng)產(chǎn)物尿黑酸HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 HPLC standard curve of reactionproduct homogentisate

2.6.2 酶促反應(yīng)的時(shí)間曲線

選擇標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)體系，反應(yīng)溫度37 ℃，以加入底物開始反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別為0、5、10、15、20、30、60、120 min，加入TCA停止反應(yīng)后，離心取上清液，HPLC檢測(cè)不同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)物形成量，圖9a顯示，CjHPPD 催化對(duì)羥苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物尿黑酸的生成量至少在10 min以內(nèi)與反應(yīng)時(shí)間呈線性關(guān)系，即隨著時(shí)間的延長產(chǎn)物的積累成正比增加，但是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過10 min以后反應(yīng)產(chǎn)物的積累有所下降．所以選擇反應(yīng)時(shí)間5 min作為酶學(xué)性質(zhì)分析時(shí)的反應(yīng)時(shí)間．

2.6.3 CjHPPD的最適作用溫度

選擇標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)體系，先在選定溫度下預(yù)熱3 min，加入酶液開始反應(yīng)，保溫5 min，加入TCA終止反應(yīng)，渦旋混勻后離心，取上清液用于HPLC測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物．所用反應(yīng)溫度為10、25、30、37、40、45、50 ℃．圖9b顯示CjHPPD催化反應(yīng)的最適溫度為30 ℃，當(dāng)高于或低于這一溫度時(shí)，在相同的反應(yīng)體系中產(chǎn)物的生成量都會(huì)降低，即酶的活性降低．

2.6.4 CjHPPD 的最適pH值

選擇標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，改變pH值緩沖液的使用，使反應(yīng)體系處于不同的pH值．使用醋酸鉀緩沖液(KA buffer)：pH值分別調(diào)整為 4.5、5.5、6.0；磷酸鉀緩沖液(KP buffer)：pH值分別調(diào)整為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0．反應(yīng)條件為30 ℃，5 min．反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC測(cè)定．圖9c顯示在底物HPP濃度為200 μmol/L，酶量為10 μL(37.2 μg蛋白質(zhì))，反應(yīng)溫度為30 ℃條件下，CjHPPD催化對(duì)羥苯基丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚝谒岬淖钸mpH值為6.5．

a.酶促反應(yīng)的時(shí)間曲線;b.溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響;c.pH值對(duì)酶活性的影響;d.底物HPP濃度對(duì)酶活性的影響.圖9 CjHPPD酶學(xué)特性分析Fig.9 Analysis of characteristics of CjHPPD

圖10 CjHPPD 催化底物HPP 形成HMG反應(yīng)的Km值計(jì)算Fig.10 Caculation of Km of CjHPPD for substrate HPP formation to HMG

2.6.5 底物濃度對(duì)CjHPPD活性的影響——Km值計(jì)算

為了研究CjHPPD與底物HPP的親和性，在不同濃度的底物條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)并測(cè)定酶的活性．底物濃度分別為2、10、20、50、100、200 μmol/L，酶的用量為10 μL (37.2 μg蛋白質(zhì))，反應(yīng)溫度設(shè)為30 ℃，pH值為6.5，反應(yīng)時(shí)間為5 min．以加入底物開始反應(yīng)，加入TCA終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC測(cè)定．以100 μmol/L尿黑酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量50 μL的吸收峰面積換算出生成產(chǎn)物的物質(zhì)的量(nmol)，以其代表酶的活力，制作出曲線如圖9d．以每mg酶蛋白每min催化酶促產(chǎn)應(yīng)產(chǎn)生HMG的物質(zhì)的量(nmol)作為酶促反應(yīng)速度(nmol/min/mg)，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Kaleida Graph(synergy software，reading，PA) 軟件處理并計(jì)算米氏常數(shù)Km值(圖10)，數(shù)據(jù)符合Michaelis-Menten酶促動(dòng)力學(xué)公式，結(jié)果顯示當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?0 μmol/L時(shí)，酶促反應(yīng)速度隨著底物濃度的增長呈直線增長；在底物濃度大于20 μmol/L低于100 μmol/L時(shí)，酶促反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而增加，但是增加速度減慢；當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到100 μmol/L時(shí)，酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大值，再增加底物濃度酶促反應(yīng)速度不再增加．vmax為11.13 nmol/min/mg，CjHPPD的酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值為43.2 μmol/L．

3 討論

對(duì)羥苯基丙酮酸雙加氧酶(ρ-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD；EC.1.13.11.27)是生物體中芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)分解代謝過程中的重要酶類．在植物體和光合細(xì)菌中，對(duì)羥苯基丙酮酸雙加氧酶除了參與酪氨酸等的分解代謝，它還是質(zhì)體醌和生育酚生物合成的關(guān)鍵酶．HPPD成為新型除草劑靶標(biāo)酶和生育酚代謝途徑工程的重要酶類．隨著HPPD抑制型除草劑的使用，研究者們利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物以擴(kuò)大該類除草劑的除草譜和用于敏感作物[15-16]．Garcia等[17]1997年從胡蘿卜培養(yǎng)細(xì)胞中分離出了胡蘿卜HPPD的cDNA，這是第1次從植物中分離克隆HPPD的cDNA．胡蘿卜培養(yǎng)細(xì)胞的天然HPPD和重組的胡蘿卜HPPD均受到其抑制劑的強(qiáng)烈抑制作用，即天然HPPD和重組HPPD均對(duì)除草劑高度敏感．已經(jīng)研究的動(dòng)物、植物和細(xì)菌等的HPPD均被其抑制劑強(qiáng)烈地抑制[18]．

本研究從對(duì)HPPD抑制劑具有抗性的黃連培養(yǎng)細(xì)胞中獲得的黃連HPPDcDNA進(jìn)行原核表達(dá)得到重組CjHPPD，以對(duì)羥苯基丙酮酸(ρ-HPP)為底物進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，經(jīng)HPLC檢測(cè)酶促反應(yīng)的產(chǎn)物為尿黑酸(HMG)，產(chǎn)物經(jīng)LC-MS檢測(cè)確定．結(jié)果表明重組蛋白具有HPPD酶活性．

酶學(xué)特性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CjHPPD催化反應(yīng)的最適溫度為30 ℃，最適pH值為6.5；在最適條件下，底物ρ-HPP濃度對(duì)酶活性的影響符合米氏公式，Km值為43.2 μmol/L．關(guān)于植物HPPD的酶學(xué)特性前人有一些研究報(bào)道，例如玉米HPPD最適溫度為30 ℃，最適pH值為7.3，Km值為5 μmol/L[19]；胡蘿卜重組HPPD在反應(yīng)溫度30 ℃，pH值6.0的反應(yīng)條件下，Km值為(7．5 ± 2.5)μmol/L[18]；Garcia等[12]在研究擬南芥重組HPPD酶學(xué)特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，其最適pH值為一個(gè)較寬的范圍(6.5～7.5)，Km值為5～8 μmol/L；稗草barnyardgrass (Fchinochloacrus-galli) HPPD的Km值為4.3 μmol/L[20]．與其他植物HPPD相比較，CjHPPD的Km值明顯高于其他植物種類，但是低于經(jīng)過定點(diǎn)突變修飾的細(xì)菌HPPD G336W(Km值138 μmol/L)[3]．CjHPPD對(duì)于底物ρ-HPP的高Km值表明CjHPPD催化大量的底物HPP以增加質(zhì)體醌代謝流量，從而提高了黃連培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)其競爭性抑制劑DTP的抗性．然而在研究中發(fā)現(xiàn)，CjHPPD的氨基酸序列同源性與其他植物HPPD表現(xiàn)出較高的同源性，尤其是與鐵結(jié)合相關(guān)氨基酸殘基等活性位點(diǎn)的氨基酸序列相似性很高，CjHPPD的高Km值的分子機(jī)理需要進(jìn)一步的研究．HPPD抑制劑型除草劑作為HPPD的競爭性抑制劑影響敏感植物的生長，同時(shí)由于HPPD是質(zhì)體醌和生育酚生物合成途徑的限制因子[21]，筆者發(fā)現(xiàn)的對(duì)除草劑具有抗性的CjHPPD為植物生育酚生物合成代謝途徑工程以及抗除草劑基因工程提供了一個(gè)很好的途徑．

致謝：感謝日本京都大學(xué)大學(xué)院生命科學(xué)研究科Minami Hiromichi博士對(duì)本文LC-MS檢測(cè)的幫助；感謝國家留學(xué)基金委的資助.

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Prokaryoticexpressionandcharacterizationofρ-hydroxyphenylpyruvatedioxygenasefromculturedCoptisjaponicacells

LIANGYuling1，2，SATOFumihiko3

(1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China； 2.Biological Engineering Technology Research Center in Hebei Province,Baoding 071002,China; 3.Graduate School of Biostudies，Kyoto University，Kyoto 606-8502，Japan)

To characterize theρ-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase from culturedCoptisjaponicacells (CjHPPD)，recombinant protein was produced inE．coli． When the enzyme activity of recombinant CjHPPD was measured in vitro，the formation of homogentisate was determined by HPLC and confirmed by LC-MS analysis． Enzyme assays indicated that the optimum pH for the reaction of HPP transfer to homogentiaste was approximately 6.5． A time course study showed that the accumulation of homogentisate was linear with time for at least 10 min in the presence of 10 μL(37.18 μg) of desalted enzyme and 200 μmol/L hydroxyphenlpyruvate． The optimum temperature was 30 ℃． Characterization of the substrate affinity of recombinant CjHPPD using HPP as the substrate indicated that CjHPPD also followed Michaelis-Menten-type kinetics andKmwas estimated to be 43.2 μmol/L． TheKmof CjHPPD was much higher than the reported values for the HPPD enzyme from other plants． Since HPPD inhibitors are known to compete for the substrate for binding，the higherKmvalue of HPP might affect herbicide tolerance．

Coptisjaponica;ρ-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase; prokaryotic expression; characterization;Kmvalue

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.06.008

2017-05-26

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2013201126)

梁玉玲(1965—),女，河北定州人，河北大學(xué)教授，主要從事植物分子生物學(xué)與基因工程研究.

E-mail: yuling_liang@163.com

Q786

A

1000-1565(2017)06-0605-09

趙藏賞)