缺氧誘導(dǎo)因子-2α對基質(zhì)金屬蛋白酶-2啟動(dòng)子活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

李 娜 梁文輝 史 齊 王建強(qiáng) 王志慧 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

缺氧誘導(dǎo)因子-2α對基質(zhì)金屬蛋白酶-2啟動(dòng)子活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

李 娜 梁文輝1史 齊 王建強(qiáng) 王志慧 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的克隆基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2基因5′上游1.7 kb啟動(dòng)子，構(gòu)建啟動(dòng)子-螢光素酶報(bào)告基因載體pGL3-MMP-2 pro，探討缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-2α對MMP-2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。方法采用PCR擴(kuò)增MMP-2啟動(dòng)子上游區(qū)域基因片段，插入到含有螢光素酶報(bào)告基因的載體PGL3-basic中構(gòu)建重組子，經(jīng)雙酶切和測序鑒定后，將重組子轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，通過雙螢光素酶活性分析HIF-2α對MMP-2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果PCR擴(kuò)增的1.7 kb片段經(jīng)測序正確無誤，pGL3-MMP-2 pro轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48 h后，雙螢光素酶活性測定結(jié)果顯示加CoCl2誘導(dǎo)的pGL3-MMP-2 pro +HIF-2α組啟動(dòng)子活性顯著高于pGL3-MMP-2 pro組、陰性對照組和空白對照組(均P<0.05)。結(jié)論HIF-2α促進(jìn)了MMP-2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。

缺氧誘導(dǎo)因子-2α；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；啟動(dòng)子；MCF-7細(xì)胞

缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-2是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2，又稱Ⅳ型膠原酶或明膠酶，在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及間質(zhì)血管生成過程中起重要作用〔1〕。關(guān)于惡性腫瘤中HIF-2α與MMP-2表達(dá)的關(guān)系及MMP-2是否為HIF-2α促進(jìn)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用靶點(diǎn)，目前相關(guān)報(bào)道較少。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α的表達(dá)與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移之間存在明顯相關(guān)性，并且HIF-2α能夠上調(diào)MMP-2的表達(dá)〔2，3〕。本研究在構(gòu)建MMP-2啟動(dòng)子報(bào)告載體基礎(chǔ)上，探討乳腺癌細(xì)胞中HIF-2α對MMP-2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 pMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司，HIF-2α單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司(Neomarkers產(chǎn)品)，人成纖維細(xì)胞(NIH3T3)和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)購于中科院上海細(xì)胞庫；pGL3-basic螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)來自Promega公司。

1.2PCR擴(kuò)增MMP-2 pro cDNA 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔4〕，設(shè)計(jì)MMP-2 pro引物序列，上游：5′-ATGTCTGGTACCACACCCACCAGACAAGCCT-3'；下游：5'-ATAGTACTCGAG AAGCCCCAGATGCGC AGCCT-3'，交上海生工生物技術(shù)有限公司合成，LA Tag酶PCR擴(kuò)增 MMP-2 pro cDNA。

1.3pMD18-T-MMP-2 pro的構(gòu)建 酚氯仿抽提MMP-2 pro cDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將純化回收的 MMP-2 pro cDNA連接到pMD18-T上，EcoRv為pMD18-T上的克隆點(diǎn)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素進(jìn)行抗性篩選，挑選單克隆擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，Kpn I/Xho Ⅰ雙酶切鑒定。將鑒定連接成功的質(zhì)粒菌液送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4pGL3-MMP-2 pro載體構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切pMD18-T-MMP-2 pro，切取約1.7kb片段，Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ進(jìn)行雙酶切質(zhì)粒pGL3-basic，將純化回收的MMP-2 pro cDNA克隆于pGL3-basic的Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ之間。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素進(jìn)行抗性篩選，挑選單克隆擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。將鑒定連接成功的質(zhì)粒菌液送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5乳腺癌MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Promega)，將乳腺癌MCF-7細(xì)胞分別以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，至細(xì)胞密度長至60%～80%，吸去DMEM+10%FBS培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)液清洗，1 ml DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物加入每孔，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中溫育1 h，2 ml 10%FBS DMEM培養(yǎng)液加入每孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.6雙螢光素酶活性測定 按照螢光素酶檢測系統(tǒng)(Promega)說明進(jìn)行，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，每孔加入300 μl 1倍裂解液，將50 μl螢光素酶試劑Ⅱ加入到1.5 ml EP管中，取10 μl 細(xì)胞裂解液加入上述EP管中，吹打混勻，置于檢測儀測定pGL3中的螢光素酶活性及內(nèi)參海腎螢光素酶活性。二者比值為被檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所測得的螢光素酶相對活性。分組如下：①未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞(空白對照組)；②只轉(zhuǎn)染pGL3質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞(陰性對照組)；③只轉(zhuǎn)染pGL3-MMP-2 pro質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞；④CoCl2處理的轉(zhuǎn)染pGL3-MMP-2 pro質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞。以pGL3-MMP-2 pro的活性作為100%，各組重復(fù)測3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴(kuò)增 MMP-2 pro cDNA 采用PCR方法擴(kuò)增出MMP-2 pro cDNA序列，將擴(kuò)增的 MMP-2 pro cDNA基因PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，電泳圖譜見圖1，可見一長約1.7 kb清晰條帶，其基因片段大小與預(yù)計(jì)相符，表明已獲得MMP-2 5′啟動(dòng)子非編碼區(qū)基因片段。

2.2MMP-2 pro cDNA連接到pMD-18T載體 將經(jīng)LA Tag酶擴(kuò)增后純化的MMP-2 pro cDNA基因PCR產(chǎn)物連接到pMD-18T載體上，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Kpn I/Xho I雙酶切鑒定。分別切出一長約1.7 kb條帶和一長約2 692 bp條帶。電泳圖譜見圖2，上述酶切鑒定成功的質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果完全正確，未發(fā)現(xiàn)突變堿基。

M：DNA Marker；1：MMP-2 pro cDNA,下圖同圖1 PCR擴(kuò)增MMP-2 pro cDNA

圖2 MMP-2 pro cDNA片段連接到T載體后Kpn I/Xho I雙酶切鑒定

2.3pGL3-MMP-2 pro cDNA載體構(gòu)建 采用限制性內(nèi)切酶Kpn I/Xho I雙酶切pMD-18T-MMP-2 pro cDNA，MMP-2 pro cDNA片段經(jīng)電泳凝膠回收，將其克隆到pGL3的Kpn I/Xho I酶切位點(diǎn)之間。Kpn I/Xho I雙酶切后可得到約1.7 kb和4 818 bp的兩個(gè)條帶(見圖3)，說明連接成功。

2.4螢光素酶活性分析 以完整MMP-2啟動(dòng)子的活性為100，各組啟動(dòng)子活性比較結(jié)果顯示：加CoCl2誘導(dǎo)HIF-2α高表達(dá)的pGL3-MMP-2 pro +HIF-2α組啟動(dòng)子活性為136±0.866，顯著高于pGL3-MMP-2 pro組(100±0.765,P<0.05)、陰性對照組(37±0.565，P<0.01)和空白對照組(21±0.365，P<0.01)，提示HIF-2α增強(qiáng)了MMP-2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。

圖3 重組pGL3-MMP-2 pro cDNA鑒定

3 討 論

低氧微環(huán)境是大多數(shù)實(shí)體瘤的重要特征，低氧微環(huán)境可通過調(diào)控多種基因表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，盡管這些過程是由多種信號(hào)通路共同調(diào)控的〔5〕，其中HIFs在這一過程中發(fā)揮重要作用。HIFs是由HIF-α和HIF-β亞基組成的異二聚體。目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物中有三種HIF-α亞基：HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，均可與HIF-β亞單位結(jié)合〔6〕。隨著載體構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)、基因沉默實(shí)驗(yàn)等多項(xiàng)精細(xì)實(shí)驗(yàn)方法的使用及研究的不斷深入，近期有許多關(guān)于HIF這一調(diào)節(jié)系統(tǒng)的最新發(fā)現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α的靶基因涉及能量代謝、兒茶酚胺合成、鐵代謝、骨髓造血、血管生長和血管收縮等方面〔7〕。HIF-2被激活后可作用于一系列的靶基因，這些靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子中均含有1個(gè)小于100 bp的缺氧反應(yīng)元件(HRE)，其核心序列為5′-ACGTGCT-3′，是HIF-2與其結(jié)合的標(biāo)識(shí)序列，HIF-2與靶基因HRE上HIF-2的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物從而啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄〔8〕。MMP-2在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及間質(zhì)血管生成過程中起重要作用〔9〕。在人體內(nèi)至少有三種調(diào)控機(jī)制可能影響MMP-2的活化，包括：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，MMP-2蛋白的活化及金屬蛋白酶的組織抑制因子，其中基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控失調(diào)是腫瘤相關(guān)基因表達(dá)異常的常見機(jī)制之一〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)在胃癌中HIF-2α上調(diào)了MMP-2的表達(dá)并促進(jìn)了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移〔11〕。本文成功構(gòu)建了人MMP-2啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因，并在細(xì)胞內(nèi)證明了HIF-2α能夠增強(qiáng)MMP-2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。

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A

1005-9202(2017)24-6041-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.016

河南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(16230041220)；河南省高校青年骨干教師資助項(xiàng)目(2012GGJS-136)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院聯(lián)合培育基金資助項(xiàng)目(2014QN113)；河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(16A310002)；河南省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項(xiàng)目(201403133)

1 新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院

李 娜(1977-)，女，博士，副教授，主要從事惡性腫瘤分子病理學(xué)研究。

〔2016-10-27修回〕

(編輯 曹夢園)