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    普拉格雷干預(yù)對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響及可能機制

    2018-01-05 04:33:53劉克洪李景琦武警浙江省總隊杭州醫(yī)院康復(fù)中心浙江杭州310051
    中國老年學雜志 2017年24期
    關(guān)鍵詞:普拉格腦組織神經(jīng)功能

    劉克洪 李景琦 高 堅 (武警浙江省總隊杭州醫(yī)院康復(fù)中心,浙江 杭州 310051)

    普拉格雷干預(yù)對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響及可能機制

    劉克洪 李景琦 高 堅 (武警浙江省總隊杭州醫(yī)院康復(fù)中心,浙江 杭州 310051)

    目的考察普拉格雷對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響及可能機制。方法雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組,模型組和普拉格雷組3組,每組40只。假手術(shù)組與模型組灌胃給予生理鹽水,普拉格雷組給予普拉格雷10 mg·kg-1·d-1,連續(xù)給藥14 d。記錄或檢測各組行為障礙、組織病理學改變、腦內(nèi)半胱天冬酶(Caspase)-3及程序化死亡基因(PDCD)-5表達情況,外周血超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及S-100β蛋白表達情況。結(jié)果與假手術(shù)組比,模型組及普拉格雷組神經(jīng)功能評分升高顯著(P<0.05);與模型組比較,普拉格雷組神經(jīng)功能評分顯著降低(P<0.05)。假手術(shù)組腦組織細胞結(jié)構(gòu)完整;模型組細胞排列紊亂,水腫嚴重,血管充血;與模型組比較,普拉格雷組腦組織結(jié)構(gòu)較完整,且壞死及水腫程度降低。與假手術(shù)組比,模型組可見大量Caspase-3和PDCD-5細胞(P<0.05),SOD明顯降低(P<0.05),MDA、NSE和S-100β明顯增高(P<0.05);與模型組比,普拉格雷組Caspase-3和PDCD-5細胞顯著降低(P<0.05),SOD明顯增高(P<0.05),MDA、NSE和S-100β明顯降低(P<0.05)。結(jié)論普拉格雷可以通過抑制Caspase-3及PDCD-5凋亡因子,調(diào)控SOD、MDA、NSE及S-100β表達從而改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能障礙。

    普拉格雷;腦梗死;半胱天冬酶-3;程序化死亡基因;超氧化物歧化酶;丙二醛;神經(jīng)元特異性烯醇化酶;S-100β

    腦梗死后神經(jīng)功能的改善成為近年來研究的難點和熱點,針對腦梗死動物模型的研究發(fā)現(xiàn),抑制凋亡及保護神經(jīng)成為治療的重點〔1〕。普拉格雷作為第三代血小板抑制劑,可與P2Y12受體相結(jié)合,從而發(fā)揮更強更迅速的抗血小板聚集作用,是一種已處于Ⅲ期臨床試驗的藥物〔2〕,然而有關(guān)普拉格雷可否改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能的研究至今缺如,其可改善神經(jīng)保護的機制也未知。本文探究普拉格雷對腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響及可能機制。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 雄性Wistar大鼠(北京維通利華公司)120只,8~10周齡,體重180~220 g,隨機分為假手術(shù)組,模型組和普拉格雷組各40只。

    1.2腦梗死大鼠的制備 大鼠全麻后置于操作臺上,分離右側(cè)頸總動脈(CCA),頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA)。結(jié)扎ECA及CCA近心端。在CCA近分叉處插入備用魚線,將栓線送至大腦中動脈分叉處,平均進線(18.5±0.5)mm(ECA與ICA分叉處為起點),栓線尾端留于皮膚外,栓塞90 min后抽線實現(xiàn)再灌注。以大鼠清醒后爬行時右轉(zhuǎn)圈,提尾時右前肢內(nèi)收屈曲為納入標準。假手術(shù)組操作同上,僅暴露各組血管,而不進行線栓插入〔3〕。

    1.3給藥 假手術(shù)組和模型組均灌胃給予生理鹽水,劑量10 ml·kg-1·d-1,普拉格雷組給予普拉格雷10 mg·kg-1·d-1,連續(xù)給藥14 d。

    1.4神經(jīng)功能評分〔3〕記錄所有大鼠治療后的神經(jīng)功能評分。0分:活動自如,未有障礙;1分:存在活動障礙,左側(cè)前爪無力;2分:存在活動障礙,推手術(shù)側(cè)肩部,發(fā)現(xiàn)對側(cè)的移動阻力降低;3分:存在活動障礙,大鼠出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)圈;4分:活動障礙明顯,無肢體活動。分值越高提示行為障礙越明顯。

    1.5腦組織病理 治療后,水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠處死,取腦組織,參照固定-脫水-包埋-切片-染色等步驟,光鏡觀察病理形態(tài)。

    1.6Caspase-3及程序化死亡基因(PDCD)-5在腦組織的表達 選擇1.5的切片,按照脫蠟-透明-脫水-抗原修復(fù)-抗體孵育-染色等步驟,光鏡觀察Caspase-3及PDCD-5表達情況。按染色強度與陽性細胞數(shù)比例確定陽性情況,無著色0分,<1%為1分、1%~10%為2分,11%~33%為3分,34%~66%為4分,67%~100%為5分,染色強度按無、弱、中和強分別為0、1、2和3分,陽性細胞百分率評分+細胞染色強度評分≥3為陽性,否則為陰性。

    1.7外周血超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)表達 治療前后,自大鼠眼球取血,靜置2 h,離心取血清,按照說明書操作步驟〔3〕,并應(yīng)用儀器檢測吸光度并計算SOD和MDA的相對含量。SOD和MDA試劑購于美國CST公司。

    1.8外周血神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及S-100β蛋白表達 治療前后,自大鼠眼球取血,高速離心取上清,以酶標儀采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定NSE及S-100β水平,嚴格按照試劑盒說明書操作,NSE及S-100β試劑盒均購于R&D公司。

    1.9統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1各組治療前后的神經(jīng)功能評分 治療前,與假手術(shù)組比較,模型組及普拉格雷組神經(jīng)功能評分較治療前顯著升高(P<0.05),治療后,普拉格雷組神經(jīng)功能評分較治療前顯著降低(P<0.05),與模型組比較,普拉格雷組神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05),見表1。

    2.2各組腦組織病理學比較 假手術(shù)組腦組織細胞結(jié)構(gòu)完整;模型組細胞排列紊亂,水腫嚴重,血管充血;與模型組比較,普拉格雷組腦組織結(jié)構(gòu)較完整,且壞死及水腫程度降低,見圖1。

    表1 各組治療前后的神經(jīng)功能評分分)

    與假手術(shù)組比較:1)P<0.05;與模型組比較:2)P<0.05;下表同

    2.3各組腦Caspase-3及PDCD-5表達 假手術(shù)組未見Caspase-3 和PDCD-5陽性細胞,模型組見大量Caspase-3〔32例(80.00%)〕和PDCD-5陽性細胞〔35例(87.50%)〕(χ2=53.333,62.222,均P=0.000);與模型組比較,普拉格雷組Caspase-3 和PDCD-5陽性率〔17例(42.50%)、15例(37.50%)〕明顯降低(χ2=8.717,P=0.003 0;χ2=21.333,P=0.000 0),見圖2。

    2.4各組治療前后外周血SOD及MDA水平比較 治療前,與假手術(shù)組比較,模型組及普拉格雷組SOD顯著降低(P<0.05),MDA顯著升高(P<0.05);治療后,較治療前普拉格雷組SOD顯著增高(P<0.05),MDA顯著降低(P<0.05);與模型組比較,普拉格雷組SOD顯著增高(P<0.05),MDA顯著降低(P<0.05),見表2。

    圖1 各組腦組織的HE染色(×400)

    圖2 各組腦組織Caspase-3及PDCD-5表達(×400)

    2.5各組治療前后外周血NSE及S-100β水平比較 治療前,與假手術(shù)組比較,模型組及普拉格雷組NSE及S-100β顯著增高(P<0.05);治療后,普拉格雷組NSE及S-100β顯著降低(P<0.05),與模型組比較,普拉格雷組NSE及S-100β顯著降低(P<0.05),見表3。

    表2 各組治療前后外周血SOD及MDA水平比較分)

    表3 各組治療前后外周血NSE及S-100β水平比較分)

    3 討 論

    腦梗死發(fā)生機制不明,但腦組織缺血缺氧導(dǎo)致的細胞凋亡及氧自由基增高,促使多種腦組織損傷特異性蛋白,如NSE及S-100β分泌增多,誘導(dǎo)腦組織神經(jīng)功能的損傷。NSE多由神經(jīng)元細胞分泌,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)特異性蛋白,生理狀態(tài)下的血清水平較低,難以被檢測到,但當顱內(nèi)缺血缺氧時,胞質(zhì)內(nèi)的NSE即進入血液循環(huán),外周血增高的NSE可作為顱內(nèi)損傷的標志物〔4~7〕;S-100β可在多種腦內(nèi)細胞內(nèi)表達,但表達受限,參與腦細胞的多種代謝過程,被認為是腦損傷的特異性標記蛋白〔8~10〕。

    腦梗死發(fā)病的重要因素之一是細胞凋亡,細胞凋亡受多種基因調(diào)控,線粒體凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑和死亡受體通路均可干預(yù)凋亡,這三種通路均需要激活下游Caspase-3和PDCD-5等凋亡蛋白才能發(fā)揮誘發(fā)細胞程序性死亡的作用。Caspase-3為通路中的關(guān)鍵因子,是啟動凋亡的重要分子〔11〕。PDCD-5具有早期及始動性的功能,參與線粒體凋亡通路〔12〕。本文結(jié)果提示腦梗死大鼠腦部存在明顯的細胞凋亡。

    生理條件下,機體具有清除體內(nèi)多余自由基的功能,然而在缺血缺氧的情況下,氧自由基聚集,損傷腦組織。SOD作為最主要的抗氧化酶,可有效清除體內(nèi)氧自由基;而MDA與線粒體膜的穩(wěn)定性相關(guān),兩者的含量可反映機體氧自由基情況〔13,14〕。本文結(jié)果提示腦梗死大鼠的氧自由基代謝紊亂。

    普拉格雷作為一種新型的抗血小板藥物,是一種前體藥物,可在體內(nèi)活化為活性物質(zhì),與血小板受體結(jié)合從而發(fā)揮更有效的抗血小板聚集的效果。研究多認為普拉格雷具有較好的預(yù)防和改善心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的功能〔15,16〕。

    本文說明普拉格雷可以明顯降低腦梗死大鼠顱內(nèi)凋亡程度。普拉格雷可以顯著減輕腦梗死大鼠氧自由基的分泌。普拉格雷可以降低腦特異性損傷蛋白的分泌,參與腦梗死的修復(fù)。既往研究〔13〕顯示,抗血小板療法可誘發(fā)大腦皮層發(fā)生依賴性神經(jīng)功能重組的變化,使腦梗死恢復(fù)期患者大腦皮層發(fā)生功能重組變化,使患肢運動功能得到恢復(fù)。普拉格雷療法可以通過減輕顱內(nèi)凋亡程度、氧自由基分泌狀況及腦損傷蛋白的合成改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能障礙,然而有關(guān)其深入機制的研究仍需后續(xù)實驗。

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    R743.3

    A

    1005-9202(2017)24-6038-04;

    10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.015

    浙江省自然科學基金資助項目(No.LY12H09006)

    李景琦(1964-),男,主任醫(yī)師,主要從事腦損傷意識障礙康復(fù)研究。

    劉克洪(1983-),男,主治醫(yī)師,主要從事神經(jīng)損傷康復(fù)研究。

    〔2016-11-29修回〕

    (編輯 苑云杰)

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