豬場糞腸球菌耐藥性流行病學調(diào)查與分析

卓鴻璘

（泉州市洛江區(qū)虹山鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，福建泉州 362011）

豬場糞腸球菌耐藥性流行病學調(diào)查與分析

卓鴻璘

（泉州市洛江區(qū)虹山鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，福建泉州 362011）

為了解生豬規(guī)?；B(yǎng)殖場糞腸球菌的耐藥情況，探討不同抗菌藥使用對細菌產(chǎn)生耐藥性的影響，本研究采用了美國臨床檢驗標準委員會（CLSI）推薦的肉湯微量稀釋法及判定標準，調(diào)查了365株分離自建場時間短、用藥規(guī)范的豬場Ⅰ、豬場Ⅱ和建場時間長、用藥混亂的豬場Ⅲ糞腸球菌對六種抗菌藥的耐藥率。結(jié)果顯示：分離菌對土霉素、紅霉素、氯霉素和環(huán)丙沙星存在不同程度的耐藥，耐藥率分別為：99.5%、98.1%、70.7%、47.8%，對萬古霉素、氨芐西林較敏感；三個用藥情況不同豬場分離菌對六種抗菌藥物的耐藥率相差不大；哺乳小豬和保育小豬統(tǒng)稱為小豬的分離菌對六種抗菌藥物的耐藥率比哺乳母豬、懷孕母豬、大豬、和公豬統(tǒng)稱大豬分離菌的耐藥率高；分離菌對六種抗菌藥物存在多重耐藥；三個豬場分離菌對六種抗菌藥有相似的多重耐藥情況。試驗結(jié)果初步揭示了生豬養(yǎng)殖場糞腸球菌的耐藥情況，提示用藥方式、用藥頻率等與耐藥率、耐藥水平和多重耐藥等存在一定的聯(lián)系。

糞腸球菌 耐藥性 養(yǎng)豬場 多重耐藥 調(diào)查

腸球菌是一種革蘭氏陽性菌，可以從多種自然環(huán)境中分離，是人和動物腸道的正常菌群。作為條件致病菌，腸球菌是醫(yī)院感染特別是尿路感染的重要病原菌之一，也是污染肉類和乳類等動物性食品的常見細菌種類之一，近年來動物感染腸球菌發(fā)病與死亡病例的報道也越來越多。由于其細胞壁堅厚，腸球菌對許多抗生素表現(xiàn)為固有耐藥，且易被誘導(dǎo)產(chǎn)生新的耐藥性，臨床上一旦腸球菌對萬古霉素產(chǎn)生耐藥，就很難找到合適的治療藥物，只能依賴最新研發(fā)的抗菌藥。

大量的抗菌藥物用于動物疾病的預(yù)防與治療以及作為抗菌促生長劑對細菌的耐藥性產(chǎn)生巨大的選擇壓力，養(yǎng)殖場已經(jīng)成為耐藥菌產(chǎn)生的主要地方之一?，F(xiàn)在科學工作者已經(jīng)證實人與人之間，動物與動物之間，人與動物之間均存在耐藥基因的傳遞問題。養(yǎng)殖場的耐藥菌將對人類健康產(chǎn)生深遠的影響。調(diào)查腸球菌的耐藥性不僅能為養(yǎng)殖場用藥提供參考，還具有重要的公共衛(wèi)生意義。

本試驗以糞腸球菌為指示菌，調(diào)查了福建省三個規(guī)模化豬場的分離糞腸球菌對六種抗菌藥的耐藥率，探討不同抗菌藥物使用情況對細菌耐藥性產(chǎn)生的影響，為了解和掌握動物源性細菌耐藥性產(chǎn)生和指導(dǎo)獸醫(yī)臨床合理使用抗菌藥物以及深入開展細菌耐藥機制的研究提供參考。

1 主要材料

1.1 菌株來源

樣本菌株分離至福建省3個規(guī)模化養(yǎng)豬場肛門采集棉拭子，樣本采集的對象包括哺乳母豬、哺乳小豬、保育小豬、大豬、公豬、懷孕母豬和環(huán)境。其中豬場Ⅰ、豬場Ⅱ建場時間比較短，屬于新場，豬場Ⅲ建場時間比較長屬于老場。標準菌株：糞腸球菌（ATCC29212），購自中國藥品生物制品檢驗所。

1.2 藥品與試劑

胰蛋白大豆營養(yǎng)瓊脂和腸球菌培養(yǎng)基購自英國OXOID公司；MH-肉湯購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；土霉素、氯霉素、萬古霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星和紅霉素標準品，均購自中國藥品生物制品檢驗所；PCR反應(yīng)體系購自北京天根生化有限公司；PCR引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。

1.3 主要儀器與設(shè)備

智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠，型號HWS-250）；紫外可見分光光度計（日本島津公司，型號UVmini-1240）；PCR儀（德國Eppendorf公司，型號 Eppendorf Mastercycler ABI 2720）；電泳儀（北京六一儀器廠，型號DYY-6C）；凝膠成像系統(tǒng)（英國UVI Tec公司，型號UVI Tec DBT 2.08）。

2 具體方法

2.1 樣本采集

用滅菌棉簽在豬的肛門采樣后，放進裝有1ml滅菌肉湯的試管，當天帶回實驗室培養(yǎng)。

2.2 細菌分離、純化

采集的樣本在培養(yǎng)箱增菌8h后，在腸球菌培養(yǎng)基上劃線分離，37℃培養(yǎng)48h后，選取典型單菌落在胰蛋白大豆營養(yǎng)瓊脂平板上增菌、純化。

2.3 細菌鑒定

采用P C R方法，可通過使用引物（E f 0 0 2 7 F：5_-G C C A C T A T T T C T C G G A C A G C-3_；E f 0 0 2 7 R：5_-GTCGTCCCTTTGGCAAATAA-3_），擴增出一段518bp特異性片段，對細菌進行鑒定。首先，依次在eppendorf管中加入5μl 10×Taq Buffer（Mg2+plus）、4μldNTP Mixture（各2.5mM）、2.5μl上游引物、2.5μl下游引物、0.5μlTaqDNA聚合酶、30.5μl滅菌超純水和5μl5×108CFU/ml菌懸液，配成50μlPCR反應(yīng)體系，然后輕微混勻后放入PCR儀，經(jīng)過95℃變性5min，然后94℃30s、60℃30s、72℃1min 35次循環(huán)，再經(jīng)過72℃延伸5min，完成特異性基因片段擴增，最后，將PCR產(chǎn)物與點樣緩沖液混勻后在添加有溴化乙啶的1.5%瓊脂糖上電泳20min后，在凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2.4 細菌保存

將菌株接種在肉湯隔夜培養(yǎng)后，加入滅菌甘油，制成的20%甘油菌，置于-20℃冰箱保存。

2.5 細菌藥敏試驗

本試驗根據(jù)美國臨床檢驗標準委員會（CLSI）推薦的肉湯微量稀釋法的規(guī)范進行操作。首先，在96孔聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板的1～11孔中依次加入0.1ml濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg /ml的抗菌藥物，然后在每個相應(yīng)的孔中加入0.005ml濃度為107CFU/ml的菌液，并在每個板設(shè)立陰性和陽性對照孔，最后將平板放在37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20h后觀察結(jié)果。

2.6 細菌藥敏試驗結(jié)果判定

根據(jù)美國臨床檢驗標準委員會（CLSI）提供的判定標準（表1）來判斷細菌對抗菌藥物的耐藥程度。

表1 腸球菌稀釋法藥敏試驗解釋標準

2.7 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用Excel軟件對藥敏試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣本收集及菌株分離結(jié)果

調(diào)查了3個規(guī)?；B(yǎng)豬場，豬場Ⅰ隨機采了60份樣本，并從中分離了46株糞腸球菌，豬場Ⅱ、豬場Ⅲ分別對不同階段的豬及環(huán)境進行采樣，詳情見表2。

表2 豬場Ⅱ、Ⅲ采樣和分離菌情況

3.2 生豬規(guī)?；B(yǎng)殖場抗菌藥物使用情況

目前生豬規(guī)模化養(yǎng)殖場大量使用各類抗菌藥物，用于疾病的預(yù)防和治療以及促進動物生長等，這些藥物以飼料添加劑，藥物預(yù)混劑和針劑等形式進入養(yǎng)殖場，對養(yǎng)殖場細菌產(chǎn)生廣泛的影響。本研究選擇3個試驗豬場，其中豬場Ⅰ和豬場Ⅱ建場3～4年，豬群健康狀況一直較好，臨床上一般只進行常規(guī)預(yù)防用藥，同時沒有違規(guī)使用一些禁用藥物；豬場Ⅲ建場12年，豬群健康狀況較差，臨床用藥混亂，經(jīng)常長期使用各類抗菌藥進行治療和預(yù)防。目前3個生豬養(yǎng)殖場使用的抗菌藥范圍很廣，但都還沒有使用萬古霉素。

3.3 糞腸球菌分離菌株對6種抗菌藥物體外敏感性

3個豬場共采集了389份樣本，以每個樣本不超過一株分離菌為原則，隨機分離了365株糞腸球菌。分離菌對六種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表7。分離菌對萬古霉素、氨芐西林最敏感，敏感率分別為96.4%和93.2%。分離菌對土霉素、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星存在不同程度的耐藥，耐藥率分別為99.5%、98.1%、70.7%、47.8%。本試驗分離菌對萬古霉素的耐藥率3.3%與顧欣等報道上海地區(qū)規(guī)模豬場分離菌的耐藥率相當接近，據(jù)國外報道豬場分離的糞腸球菌對萬古霉素的耐藥率與某些抗菌促生長劑在動物飼料的添加有關(guān)系。四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物在豬場上經(jīng)常用于疾病的預(yù)防與治療，部分藥物還具有促生長作用，經(jīng)常作為飼料常規(guī)添加藥物。豬場分離菌對本研究所選擇的抗菌藥物土霉素和紅霉素已經(jīng)接近完全耐藥了，臨床上應(yīng)該盡量少用或不用。氯霉素在飼料添加已經(jīng)禁止使用幾年了，但是豬場分離菌對氯霉素仍然有較高的耐藥率，這也許與氯霉素使用時間長和氯霉素類的氟苯尼考在豬場飼料中添加有關(guān)。喹諾酮類藥物抗菌效果好，與其他抗菌藥無交叉耐藥性，隨著喹諾酮類藥物在豬場的廣泛應(yīng)用，豬場分離菌對本研究選擇的抗菌藥物環(huán)丙沙星已經(jīng)有47.8%的耐藥率，臨床上應(yīng)該慎用。

3.4 不同采樣分類糞腸球菌對六種抗菌藥物耐藥率比較

3.4.1 三個不同豬場分離糞腸球菌對六種抗菌藥耐藥率比較

三個不同豬場分離糞腸球菌對六種抗菌藥耐藥率比較（見圖1）。三個不同豬場分離糞腸球菌對六種抗菌藥的耐藥率相差不大，對萬古霉素和氨芐西林敏感，對土霉素和紅霉素耐藥率較高，其次是氯霉素和環(huán)丙沙星。三個豬場分離菌對土霉素的耐藥率十分接近；對環(huán)丙沙星、紅霉素的耐藥率以豬場Ⅲ最高，豬場Ⅱ次之，豬場Ⅰ最低；對萬古霉素、氯霉素的耐藥率以豬場Ⅱ最高，豬場Ⅰ和豬場Ⅲ相當接近。不同的豬場雖然有用藥時間和程度的差異，但豬場的用藥模式相似，因此分離菌對六種抗菌藥的耐藥率比較接近。不同豬場分離菌對環(huán)丙沙星、紅霉素、萬古霉素、氯霉素耐藥率的差異，可能跟豬場使用抗菌藥物品種的差異和短期用藥的差異有關(guān)。

圖1 不同豬場分離糞腸球菌耐藥率比較

3.4.2 小豬、大豬分離糞腸球菌耐藥率比較

本研究將哺乳小豬和保育小豬統(tǒng)稱為小豬，哺乳母豬、大豬、公豬、懷孕母豬統(tǒng)稱為大豬，并對124株小豬分離菌和124株大豬分離菌對抗菌藥的耐藥率進行比較（見圖3）。小豬和大豬分離糞腸球菌對六種抗菌藥物的耐藥率存在差異。小豬分離菌對六種抗菌藥的耐藥率都比大豬分離菌高。小豬和大豬分離糞腸球菌對土霉素和紅霉素的耐藥率比較接近，四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物在豬場上有很長的用藥歷史，糞腸球菌在長時間的選擇壓力下導(dǎo)致小豬和大豬分離菌都存在高的耐藥率。對萬古霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星和氯霉素的耐藥率差異較大。小豬比較容易感染致病，藥物在小豬階段的使用頻度更高，使用時間更長，因此小豬腸道菌群有更高的耐藥率。

圖2 小豬、大豬分離糞腸球菌耐藥率比較

3.5 豬場分離糞腸球菌對6種抗菌藥物耐藥譜

分別以T、L、W、A、H、R代表土霉素、氯霉素、萬古霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星和紅霉素來表示分離菌對6種抗菌藥的多重耐藥，如：TAHR表示對土霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星和紅霉素多重耐藥。豬場分離糞腸球菌對6種抗菌藥物有17型耐藥譜（見表4），TLHR、TLR、TR、THR、TLAHR、TLWR型的耐藥譜占的比率分別為32.1%、29%、14.8%、11.2%、2.5%1.4%；其他的耐藥譜型T、TLWHR、LR、TL、TWR、TLH、TAHR、TLAH、TLAR、TLAWR、TLWHAR各自占的比率都低于1%。TLHR、TLR耐藥譜型占17型耐藥譜的比率高達61.1%，與土霉素、氯霉素、紅霉素和環(huán)丙沙星及其同類抗菌藥物在豬場使用的時間和頻率有著必然的聯(lián)系。

表3 豬場的分離糞腸球菌體外藥敏試驗結(jié)果

表4 豬場分離糞腸球菌耐藥譜情況

3.6 三個不同豬場分離糞腸球菌多重耐藥比較

三個豬場分離菌對六種抗菌藥物有相似的多重耐藥情況。3個豬場分離菌的多重耐藥都以2、3、4重耐藥居多。豬場Ⅰ和豬場Ⅲ有出現(xiàn)5重耐藥分離菌，以3重耐藥43.5%、42.8%的比率最高。豬場Ⅱ最高有出現(xiàn)6重耐藥菌，以4重耐藥（43.8%）的比率最高，緊跟著是4重耐藥（39.9%）。豬場分離菌的多重耐藥情況初步顯示了，豬場的用藥習慣往往根據(jù)經(jīng)驗，局限于使用相對固定的幾種藥物，未能根據(jù)細菌的藥敏性及時做出調(diào)整。

圖3 三個豬場分離糞腸球菌多重耐藥比較

4 討論

4.1 國內(nèi)養(yǎng)殖場萬古霉素耐藥性的糞腸球菌應(yīng)引起關(guān)注

國內(nèi)已有多份報道表明豬源分離糞腸球菌對萬古霉素存在一定程度的耐藥率。錢曉璐等對上海地區(qū)豬源分離糞腸球菌的耐藥性分析表明40株糞腸球菌，有4株對萬古霉素耐藥，其中2株表現(xiàn)對萬古霉素高度耐藥。顧欣等對2013年3月-2014年5月從上海地區(qū)10個規(guī)模化養(yǎng)豬場分離的133株糞腸球菌進行藥敏試驗，表明分離菌對萬古霉素的耐藥率為3.01%。王送林等對湖南省豬源糞腸球菌的耐藥性分析表明42株分離糞腸球菌對萬古霉素的耐藥率高達31%。耐萬古霉素的糞腸球菌對人類生命的威脅在逐年的增加中，養(yǎng)殖場耐萬古霉素的糞腸球菌的產(chǎn)生和傳播在國外得到高度的重視。根據(jù)本試驗的結(jié)果，國內(nèi)養(yǎng)殖場萬古霉素耐藥的糞腸球菌也不容忽視。

4.2 建議加強宣傳與指導(dǎo)養(yǎng)殖場合理使用抗菌藥物

本試驗細菌耐藥譜和多重耐藥分析都表明養(yǎng)殖場的常用藥習慣性地局限于固定的幾種，沒有根據(jù)藥敏試驗及時選擇針對性比較強的藥物。目前養(yǎng)殖場抗菌藥物使用比較混亂，養(yǎng)殖場獸醫(yī)水平參差不齊，建議動物疫病防控中心要加強養(yǎng)殖場合理使用抗菌藥物的宣傳與指導(dǎo)，加強本地區(qū)細菌耐藥性調(diào)查與分析，指導(dǎo)基層獸醫(yī)站人員和養(yǎng)殖場獸醫(yī)合理使用抗菌藥物，將提高一線從業(yè)獸醫(yī)合理使用抗菌藥物的水平納入重點工作中。

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