牛結核高污染場的監(jiān)測與凈化

張洪軍 李秀慧 路廣計 陳瑞蘭 王會敏王佩綺 尹利利 劉國臣 張秀麗 趙曉光 曹 瑞

（1.河北省圍場縣動物疫病預防控制中心，河北圍場 068450；2.河北省圍場縣動物疫病預防控制中心，河北石家莊 050000；3.青島瑞爾生物技術有限公司，山東青島 266100）

牛結核高污染場的監(jiān)測與凈化

張洪軍1李秀慧1路廣計2陳瑞蘭1王會敏1王佩綺1尹利利1劉國臣1張秀麗1趙曉光1曹 瑞3

（1.河北省圍場縣動物疫病預防控制中心，河北圍場 068450；2.河北省圍場縣動物疫病預防控制中心，河北石家莊 050000；3.青島瑞爾生物技術有限公司，山東青島 266100）

比較不同的試驗方法，尋找適合高污染場奶牛結核病的檢測及凈化方法。方法：同時采用單純牛結核菌素（PPD）皮內變態(tài)反應試驗（TST）、比較皮內變態(tài)反應試驗（SICTT）、牛結核病ELISA γ-干擾素檢測試驗（IFN-γ-ELISA）、牛結核病抗體ELISA檢測方法和牛結核病抗體免疫膠體金方法對某結核病污染奶牛場30頭不同年齡牛進行結核病檢測，評價不同方法的優(yōu)缺點，探討最佳的檢測方案及凈化方法。經(jīng)綜合判定牛型結核陽性20頭（其中5頭為牛型、禽型雙陽性）、陰性10頭（其中1頭為禽型陽性），牛型結核陽性率66.67%、禽型結核陽性率63.33%、二者混合感染率為63.33%。試驗表明，僅靠一種活體檢測方法難以做出牛結核病準確診斷。因此，可采用TST初篩，陽性和可疑牛用IFN-γ-ELISA復檢以排除部分假陽性，對于早期感染牛場可直接采用IFN-γ-ELISA方法檢測并按照相應的方案進行凈化。

牛結核病 檢測 凈化

牛結核病是由牛分枝桿菌引起的人獸共患傳染病，國際動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的B類動物疫病，在世界各地均有發(fā)生，我國列為二類動物疫病，也是常見的多發(fā)病[1]。由于牛結核病是一種慢性進行性傳染病，在感染早中期肉眼很難發(fā)現(xiàn)可見癥狀，即使感染晚期表現(xiàn)出癥狀也不特異，難以通過臨床觀察做出準確診斷。只能通過剖檢和細菌培養(yǎng)才能確診，但此法不能用于活畜[2]。目前活畜檢測最理想、有效且廣泛應用的方法主要有牛結核菌素（PPD）皮內變態(tài)反應試驗（TST）、比較皮內變態(tài)試驗（SICTT）和牛γ-干擾素酶聯(lián)免疫吸附試驗（IFN-γ-ELISA）。

TST是我國國家標準規(guī)定的唯一方法，應用最為廣泛。OIE將SICTT列為TST的替代試驗或平行試驗，澳大利亞、新西蘭和歐美等許多國家批準為正式試驗[3，4]。

本試驗采用上述方法對規(guī)模化奶牛場進行結核病檢測，對實驗結果進行綜合分析，為實際生產(chǎn)提供準確的診斷依據(jù)，減少因誤診造成的撲殺損失，同時為凈化規(guī)模化奶牛場群提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

牛型PPD（批號201502）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，100頭/瓶，禽型PPD（批號200603）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，100頭/瓶，牛結核病ELISA γ-干擾素檢測試劑盒（批號：R201603-001），青島瑞爾生物技術有限公司生產(chǎn)；牛分枝桿菌ELISA抗體檢測試劑盒（批號：160804），購自武漢科前動物生物制品有限責任公司；牛結核病抗體膠體金檢測試劑盒（批號：2302DG006），購自廣州悅洋生物技術有限公司，副結核ELISA抗體檢測試劑盒（批號：6332501301），購自prionics公司。

1.1.2 試驗動物

某奶牛場的30頭奶牛，其中，泌乳牛、育成牛和犢牛各10頭。

1.1.3 器材

剪毛剪、0.5 mL注射器、游標卡尺、酶標儀（包含450nm和620-650nm濾光片）、CO2培養(yǎng)箱、24孔細胞培養(yǎng)板、肝素采血管、移液器及吸頭等。

1.2 方法

1.2.1 單純皮內變態(tài)反應試驗（TST）

參照《動物結核病診斷技術》（GB/T18645-2002）進行試驗

1.2.2 比較皮內變態(tài)反應試驗（SICTT）

采用牛PPD和禽PPD，統(tǒng)一在牛頸部左側分點皮內注射，兩個注射點間隔12～15cm。牛型PPD皮厚差減去禽型PPD皮厚差的數(shù)值大于4 mm判為陽性；大于1 mm小于4 mm判為可疑；牛型PPD皮厚差小于等于禽型PPD皮厚差判為陰性。

1.2.3 IFN-γ-ELISA試驗

無菌采集肝素抗凝全血，8 h內在實驗室分成3份置于培養(yǎng)板孔內，分別用牛PPD、禽PPD和PBS刺激，置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)16～24h。收集上清，按牛結核病ELISA γ-干擾素檢測試劑盒說明書進行操作。每孔加100μL待測樣品和對照品于相應孔中，室溫孵育1h。洗滌4次，每孔加100μL酶標抗體，室溫孵育1h。洗滌4次，每孔加100μLTMB溶液，室溫避光孵育10min。每孔加入50μL終止液，讀取OD630值。按下列公式判定：當牛PPD刺激上清OD值—禽PPD刺激上清OD值≥0.1，且牛PPD刺激上清OD值—PBS刺激上清OD值≥0.1時，判為牛結核陽性；當牛PPD刺激上清OD值—禽PPD刺激上清OD值＜0.1或牛PPD刺激上清OD值—PBS刺激上清OD值＜0.1時，判為牛結核陰性。

1.2.4 牛結核抗體ELISA試驗

按照牛分枝桿菌ELISA抗體檢測試劑盒操作步驟進行并進行相應結果的判定。

1.2.5 牛結核抗體膠體金檢測試驗

用吸管滴一滴樣品至檢測孔，10min觀察結果。檢測線和對照線均顯色判為陽性，對照線顯色而檢測線不顯色為陰性，對照線不顯色試驗不成立。

1.2.6 試驗結果對比分析

對比分析TST試驗、SICTT試驗、IFN-γ-ELISA試驗、牛結核抗體ELISA試驗和牛結核抗體膠體金試驗。

2 結果

30頭牛經(jīng)TST、SICTT、IFN-γ-ELISA、抗體ELISA和抗體膠體金方法檢測，其中TST試驗20頭陽性4頭可疑，SICTT試驗19頭陽性4頭可疑，IFN-γ-ELISA試驗25頭陽性，抗體ELISA試驗均為陰性，抗體膠體金試驗1頭弱陽性。結果詳見表2。

表2 不同檢測方法檢測結果

表3 不同試驗方法檢測結果

實驗判定結果表明，試驗牛群既有牛分枝桿菌感染，又有禽結核分枝桿菌感染，前者感染率為66.67%（20/30），后者感染率為63.33%（19/30），二者混合感染率為63.33%（19/30）。INF-γ感染率為83.33%（25/30），除膠體金抗體檢測20#為陽性，其他均為陰性，見表3。由此判斷此奶牛場是牛結核高污染的場。

3 討論

目前我國及全球范圍內運用最廣泛的檢測方法是TST，但是其檢測結果受其他病原感染、藥物、試劑質量及劑量、人為誤差、個體差異等很多因素干擾[2]，會造成一定比例的假陽性、假陰性，從而降低其敏感性、特異性、準確性。本試驗通過TST檢測確認本場群63.33%感染了牛、禽結核分枝桿菌。TST檢測方法成本較低，耗時相對較長，準確率較低，而且早期感染牛難以檢出，60d內復檢陽性率降低。特異性均低于SICCT、IFN-γ-ELISA。同時由于人為誤差造成假陰性，致使其敏感性降低。

盡管抗體膠體金檢測是最近出現(xiàn)的快速、簡便的檢測方法，但是通過本實驗的結果可以看出通過抗體檢測的方法檢測的結果存在誤差，產(chǎn)生25個假陰性，原因之一是患病個體免疫功能低下，抗體水平低，無法檢測出來。再者可能是不同機體的免疫水平存在差異，患病個體處于臨床感染初期，結核抗體的產(chǎn)生處于“窗口期”。而假陽性產(chǎn)生的原因可能是自然結核分枝桿菌感染后體內存在一定水平的抗體，因此抗體檢測雖簡潔快速但不適用。

4 建議

針對此類污染場，我們建議先按1.2.1的方法對規(guī)?；膛龃鏅谀膛０?00%進行檢測初篩，初篩結束后將該奶牛場分為污染群、穩(wěn)定控制群、凈化群。

對于污染群按1.2.1及1.2.3的試驗方法進行普檢。確定的陽性個體進行撲殺銷毀，按照 G/B16548執(zhí)行，而陰性個體進入穩(wěn)定控制群繼續(xù)監(jiān)測。

對于穩(wěn)定控制群按1.2.1及1.2.3試驗方法每隔2個月進行普檢。確定的陽性個體進行撲殺銷毀，按照GB16548 執(zhí)行，陰性個體每兩個月進行一次普檢，連續(xù)監(jiān)測2年，若無陽性出現(xiàn)，進入凈化群。

成為凈化群的規(guī)模奶牛場，以后每半年監(jiān)測一次，場群100%監(jiān)測。

[1] 何昭陽.牛結核病研究進展[J].預防獸醫(yī)學進展，2001，3（4）：34-39.

[2] 路廣記，曹瑞，張軍，等.對奶牛結核病平行檢測的不同方法[J].中國動物檢疫，2014，31（12）：43-46.

[3] Rollins D M，Colwell R R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment[J].Appl Environ Microbiol，1986，（52）：531-538.

[4] Josefsen M H，Lofstrom C，Hansen T B，et al.Rapid quantification of viable Campylobacter bacteria on chicken carcasses，using real-time PCR and propidium monoazide treatment，as a tool for quantitative risk assessment[J].Appl Environ Microbiol，2010，（76）：5097-5104.