林茜草根黃酮對(duì)S-180小鼠腫瘤TG-3、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響①

劉德財(cái)，王 雪，蘭 瑩，于菁妮，張躍華

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2佳木斯大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

林茜草根黃酮對(duì)S-180小鼠腫瘤TG-3、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響①

劉德財(cái)1，王 雪2，蘭 瑩2，于菁妮1，張躍華2

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2佳木斯大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：以林茜草根醇提取總黃酮為研究對(duì)象，干預(yù)其對(duì)小鼠S-180肉瘤的抑制作用，探究抗腫瘤機(jī)制。方法：以常規(guī)ELISA檢測(cè)、IH測(cè)定和RT-PCR手段，測(cè)定其在瘤體中三種蛋白TGF-β1、MHC-I、MHC-Ⅱ的上調(diào)表達(dá)；以此探索TG-3在小鼠S-180肉瘤實(shí)體瘤表面免疫蛋白分子的分泌，從而說明其分泌蛋白增強(qiáng)瘤體的免疫應(yīng)答作用強(qiáng)度，以此機(jī)制制約瘤細(xì)胞在模型鼠體內(nèi)移動(dòng)和定置。結(jié)果：腫瘤細(xì)胞MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ和MHC-ⅠmRNA模型組顯著減少;抗腫瘤逃逸機(jī)制和植物醇提取物總黃酮組顯著增加。結(jié)論：林茜草根總黃酮可能能提高和增強(qiáng)宿主的免疫功能從而抑制小鼠S-180荷瘤，達(dá)到抑制腫瘤目的。

林茜草根黃酮；S-180瘤株；免疫應(yīng)答；轉(zhuǎn)移

應(yīng)用從林茜草根中純化提取的林茜草黃酮，以小鼠腫瘤S-180為實(shí)驗(yàn)主體，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用。采用黃酮類物質(zhì)對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)[1，2]，證實(shí)林茜草總黃酮提取液對(duì)S-180癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和定殖具有明顯抑制作用，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明其具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗細(xì)胞表面抗體蛋白導(dǎo)致抗免疫機(jī)制，為探索中西醫(yī)結(jié)合控制腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和定殖具有重要意義，為腫瘤的綜合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。以林茜草根醇提取總黃酮為研究對(duì)象，干預(yù)其對(duì)小鼠S-180肉瘤的抑制作用，探究抗腫瘤機(jī)制；以常規(guī)ELISA檢測(cè)、IH測(cè)定和RT-PCR手段，測(cè)定其在瘤體中三種蛋白TGF-β1、MHC-I、MHC-Ⅱ的上調(diào)表達(dá)；以此探索TG-3在小鼠S-180肉瘤實(shí)體瘤表面免疫蛋白分子的分泌，從而說明其分泌蛋白增強(qiáng)瘤體的免疫應(yīng)答作用強(qiáng)度，以此機(jī)制制約瘤細(xì)胞在模型鼠體內(nèi)移動(dòng)和定置。以及其對(duì)小鼠機(jī)體免疫功能的影響，探討林茜草根醇提取物在抗腫瘤方面的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 林茜草總黃酮提取物

實(shí)驗(yàn)材料林茜草9月份采自黑龍江省小興安嶺腹地，帶嶺區(qū)涼水國家原始森林公園，超臨界提取純化總黃酮粉末，待用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用小鼠為常規(guī)小鼠腹水腫瘤細(xì)胞株種鼠，瘤株型號(hào)為S-180 荷瘤小鼠，活體荷瘤鼠購置于哈醫(yī)大二院附屬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；實(shí)驗(yàn)用小鼠為健康成年昆明種小鼠，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，根據(jù)試驗(yàn)要求，對(duì)體重、性別、數(shù)量進(jìn)行篩選，試驗(yàn)前經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1w。

1.1.3 試劑和儀器

環(huán)磷酰胺，山西普德藥業(yè)；MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ免疫組化試劑盒、SABC免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒，天津百浩公司；RNA酶(RNase)，國產(chǎn)，北京瑞達(dá)公司；碘化丙啶，北京泛博化學(xué)公司；核酸染液，南京賽泓瑞生物公司；TGF-β1 RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，上海金穗生公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、TRIZOL-RNA提取試劑盒，上海江萊生物科技公司提供。倒置相差顯微鏡：CX-10型，日本Olympus公司；紫外分光光度計(jì)：UV1900型，北京普析通用公司；-美國熱電公司-JENA梯度PCR儀，PowerCycler Gradient SL；北京君意東方JY04S-3G型凝膠成像分析系統(tǒng)：Champ GelTM 5000，軟件LANE-1D，北京賽智公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)荷S-180實(shí)驗(yàn)小鼠模型預(yù)制

無菌條件下抽取S-180腹水瘤細(xì)胞，注入肝素鈉浸潤無菌采集管中；鏡檢瘤細(xì)胞黏度，以無菌生理鹽水稀釋5～10倍，注射于實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔內(nèi)，注意進(jìn)針后皮下平行，以防刺入腹腔；單只實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)鼠注射1.0mL經(jīng)過無菌生理鹽水稀釋的S-180腹水瘤細(xì)胞液，濃度在1×1010～1×1011cfumL；每個(gè)周期接種8～10只傳代小鼠；實(shí)驗(yàn)中造模時(shí)，依據(jù)以上要求，將以無菌生理鹽水稀釋的濃度在1×1010～1×1011cfu的S-180腹水瘤細(xì)胞液皮下接種實(shí)驗(yàn)小鼠的左右后肢腹股溝處[3]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠分組以及處理干預(yù)方案

依據(jù)前述的試驗(yàn)方案，挑選符合要求的KM實(shí)驗(yàn)小鼠群體，將其分為3個(gè)組別，每個(gè)組別30只，以上實(shí)驗(yàn)小鼠建模成功后，進(jìn)行藥物和對(duì)照干預(yù)，分別為空白對(duì)比組、化療藥物環(huán)磷酰胺對(duì)照組和植物-林茜草根醇提取總黃酮組；空白對(duì)照組的處理策略是每日腹腔注射無菌生理鹽水0.2mL，以及0.3mL生理鹽水灌胃，藥物處理組采用林茜草根醇提取液的總黃酮，每日0.3mL灌胃，灌胃量控制為0.40g/kg·d，每天上午進(jìn)行以上操作，灌胃、注射在上午進(jìn)行，以上操作連續(xù)給藥處理10d。

將注射過的荷瘤小鼠模型隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常組(NG)、模型組(MG)、總黃酮組(TFG)、化療藥物環(huán)磷酰胺組(CTX)和共同作用組 (TFG+CTX)。普通對(duì)照組(NG)：無菌生理鹽水干預(yù)組，劑量為每日0.4mL/只；造模對(duì)照組(MG)：無菌生理鹽水干預(yù)，每天灌胃0.4mL/只；植物醇提取物總黃酮組(TFG)：干預(yù)情況如下，每日每只TFG灌胃240mg/ kg；化療藥物 (CTX)：無菌生理鹽水干預(yù)每天0.4mL/只，CTX尾部靜脈注射，第3天開始注射，注射劑量為每日100mg /kg·只；共同干預(yù)組別(TFG+CTX)處理如下： TFG灌胃每天每只240mg/ kg·只，至第3天，CTX干預(yù)，腹腔注射每天、每只100mg/kg。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取

依據(jù)試劑盒提供的方法PCR擴(kuò)增，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)體瘤組織細(xì)胞中的總RNA提取依據(jù)市售的RNA提取試劑盒說明書要求操作。將樣品分為3份，1份電泳，1份用于測(cè)定純度RNA，1份備用，置于-80℃冰箱凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實(shí)體腫瘤組織cDNA的反轉(zhuǎn)錄要求

反轉(zhuǎn)錄操作合成cDNA按照附帶的RT-PCR Kit說明要求步驟。五局條件下，反應(yīng)體系總體積10μL，按照說明書要求分別加入各種要求試劑混勻，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成DNA反應(yīng)；反應(yīng)過夜后，反轉(zhuǎn)錄合成的產(chǎn)物置于超低溫冰箱存放。

2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠瘤細(xì)胞株中PCR擴(kuò)增和凝膠電泳分析MHC-ⅠmRNA表達(dá)

依據(jù)試劑盒說明書要求步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR合成反應(yīng)。步驟要求如下：

總反應(yīng)體系體積為50μL，配制PCR反應(yīng)液：將混合體系中各個(gè)試劑加入混勻，保持備用；離心后，進(jìn)行PCR合成操作，結(jié)束后再用加樣器吸取5.0μL的PCR產(chǎn)物和2.5μL內(nèi)標(biāo)以及1μL (6×)樣品buffer混勻，點(diǎn)至2%瓊脂糖凝膠電泳板孔內(nèi)，其中瓊脂糖凝膠預(yù)先融入，溴化乙錠染料的加入劑量比例為瓊脂糖凝膠體積的5%混合于電泳膠板，在冷卻條件下，低溫電泳，以防止產(chǎn)物分解，電泳參數(shù)如下：電泳電壓控制在100～120V，電泳時(shí)間為60min。

2.4 凝膠電泳產(chǎn)物判讀

瓊脂糖電泳膠板經(jīng)過凝膠板熒光染料著色，方法采用Gold-Veiw DNA染色用的電泳條帶分析法；圖像用軟件Bio-Rad Quantity one 5.0自帶的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)判讀，軟件半定量分析各個(gè)基因條帶的光密度，結(jié)果用內(nèi)置的參照β-actin比值顯示。

2.5 蛋白免疫組化TG-3、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ判讀

實(shí)驗(yàn)樣本的免疫組織化學(xué)素材圖像分析采用分析軟件Pro-Plus-Image處理；取采集到的MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ切片圖像判讀，樣品切片、染色后，每張選取分散視野中的5個(gè)區(qū)域測(cè)定S-180小鼠腫瘤組織的積分光密度值(IOD值)，每張樣片圖像判讀數(shù)字，取算數(shù)平均值代表MHC-Ⅰ同MHC-Ⅱ相對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)的強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)示意，統(tǒng)計(jì)分析，求平均數(shù)，ANOVA單因素方差分析，LSD法作兩兩比較SPSS-13.0軟件操作,見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)S-180實(shí)驗(yàn)鼠瘤體MHC-I和MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.6 TFG對(duì)荷S-180小鼠瘤組織中MHC-ⅠmRNA表達(dá)檢測(cè)

荷瘤小鼠組織總RNA提取依據(jù)試劑盒Trizol-10要求操作，按前述的方法用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其表達(dá)的強(qiáng)度以及提取的質(zhì)量鑒定。同健康組小鼠組織細(xì)胞中MHC-ⅠmRNA基因表達(dá)同腫瘤細(xì)胞表達(dá)相比，下降顯著；與模型組對(duì)照比較比較，各個(gè)藥物干預(yù)組表達(dá)指標(biāo)呈明顯上升勢(shì)頭,見表2。

表2 各個(gè)處理組對(duì)荷瘤鼠S-180組織中MHC-ⅠmRNA分泌比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

機(jī)體在產(chǎn)生腫瘤后，會(huì)發(fā)生腫瘤的免疫逃逸，即腫瘤細(xì)胞可以在免疫系統(tǒng)的監(jiān)控攻擊中憑借多種方法逃避攻擊從而繼續(xù)分裂生長(zhǎng)的現(xiàn)象。生命體特異性免疫系統(tǒng)在啟動(dòng)清除腫瘤細(xì)胞免疫過程中，腫瘤抗原表達(dá)、抗原識(shí)別、加工、提呈、T細(xì)胞增殖、活化和分化以及免疫效應(yīng)的產(chǎn)生這一系列環(huán)節(jié)[5]，需要啟動(dòng)腫瘤抗原的鑒定，捕獲，加工；主要呈現(xiàn)為兩個(gè)方面：抗原呈遞細(xì)胞的共刺激分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的協(xié)同效應(yīng)，通路的激活；特異性識(shí)別并殺死腫瘤細(xì)胞I類分子的限制性表達(dá)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類分子和共刺激減少或薄弱和缺少的元素表達(dá)缺失，導(dǎo)致免疫細(xì)胞反應(yīng)無能、腫瘤細(xì)胞普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象中的細(xì)胞表面表達(dá)[7]，也導(dǎo)致癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，意味著一個(gè)重要特異性抗免疫反應(yīng)發(fā)生的逃逸機(jī)制[8]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，林茜草黃酮能增加免疫分子MHC-I，MHC-Ⅱ的腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)，增強(qiáng)特異性細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)的作用，對(duì)于癌癥病人的臨床實(shí)踐期間，抑制殘余腫瘤細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移和重要措施防止復(fù)發(fā)。由上可知，腫瘤細(xì)胞MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ和MHC-ⅠmRNA模型組顯著減少;抗腫瘤逃逸機(jī)制和TFG組顯著增加。說明林茜草總黃酮可上調(diào)免疫分子的腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)，提高特定細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答的功能，抑制腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

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EffectofRubiasylvaticagrassrootsflavonoidsontheexpressionofTG-3,MHC-IandMHC-IIproteinsinS-180mice

LIUDe-cai1,WANGXue2,LANYing2,YUJing-ni1,ZHANGYue-hua2

(1.The College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China;2.The College of Science, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

ObjectiveTo discuss the inhibitory effect of Rubia sylvatica grassroots flavonoids to mouse sarcoma S-180 and explore its anti-tumor mechanism.MethodDetection of TGF-β1, MHC-I, MHC-Ⅱ protein by ELISA, IH and RT-PCR methods in tumor tissues was to reveal the secretion of TG-3 in mice S-180 sarcoma tumor surface, so that the secreted proteins enhanced the immune response intensity of tumor which restricted the movement and location of the tumor cell in mice.ResultsThe expression of MHC-I, MHC-Ⅱ and MHC-ⅠmRNA were significantly reduced in model group; a obviously increase in anti-tumor escape mechanism was observed in plant alcohol extract of total flavonoids group.CconclusionRubia sylvatica Nakai of total flavonoids can improve and enhance the host immune function, thereby exerts an inhibitory effect to mouse sarcoma S-180.

Rubia sylvatica flavonoids; S-180 tumor lines; immune response; transfer

黑龍江省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目，編號(hào)：2012-268。

劉德財(cái)(1974～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師。

張躍華(1962～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副教授。E-mail:zhangyaohua_2008@163.com。

R285.5

A

1008-0104(2017)06-0022-03

2017-06-19)