山雞椒LcGPPS表達(dá)模式及其與LcGGPPS蛋白互作分析

曹 佩，陳益存，高 暝， 郭浩波， 汪陽東*

(1．中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400； 2．美國田納西大學(xué)生物化學(xué)系，田納西州 諾克斯維爾TN 37996)

山雞椒LcGPPS表達(dá)模式及其與LcGGPPS蛋白互作分析

曹 佩1，陳益存1，高 暝1， 郭浩波2， 汪陽東1*

(1．中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400； 2．美國田納西大學(xué)生物化學(xué)系，田納西州 諾克斯維爾TN 37996)

目的鑒定與山雞椒精油合成關(guān)鍵酶香葉基二磷酸合酶(LcGPPS)的互作蛋白，為揭示山雞椒精油主要成分單萜物質(zhì)的合成機理奠定基礎(chǔ)。方法通過本地Blast搜索山雞椒果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，采用RT-PCR克隆山雞椒GPPS基因(編碼異質(zhì)GPPS小亞基的LcGPPS.SSU1)和山雞椒GGPPS基因(LcGGPPS1和LcGGPPS3)；利用qRT-PCR分析其組織特異性表達(dá)模式，通過蛋白互作預(yù)測和酵母雙雜實驗驗證LcGPPS.SSU1分別與LcGGPPS1和LcGGPPS3的互作關(guān)系。結(jié)果克隆得到LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3 3條基因序列，基因表達(dá)模式分析表明，LcGPPS.SSU1特異性地在花和果實中高水平表達(dá)；蛋白結(jié)構(gòu)互作預(yù)測結(jié)果顯示，LcGPPS.SSU1可以分別與LcGGPPS1和LcGGPPS3互作形成異質(zhì)二聚體；經(jīng)過酵母雙雜交實驗驗證發(fā)現(xiàn)，僅LcGGPPS3能與LcGPPS.SSU1發(fā)生互作。結(jié)論LcGPPS.SSU1通過與LcGGPPS3蛋白發(fā)生互作從而在山雞椒萜類合成途徑中發(fā)揮作用，為深入研究山雞椒萜類合成機制提供參考。

山雞椒；萜類合成；GPPS；GGPPS；異質(zhì)二聚體；蛋白互作；表達(dá)模式

香葉基焦磷酸合酶(GPPS)是調(diào)控萜類化合物生物合成途徑中調(diào)控節(jié)點行使作用的關(guān)鍵酶，催化底物C5前體異戊烯基二磷酸酯(IPP)及其異構(gòu)體二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)合成單萜前體香葉基焦磷酸GPP，競爭性地將底物流導(dǎo)向單萜合成，為單萜的合成提供了基本的碳骨架，也為后續(xù)各種化合物的形成提供了基礎(chǔ)[1]。GPPS在單萜合成過程中起著關(guān)鍵作用，參與防御反應(yīng)、吸引傳粉等生理生化過程，在植物生長發(fā)育中不可或缺[2]。

GPPS在自然界中以異質(zhì)二聚體和同質(zhì)二聚體的形式存在，均以催化合成GPP為唯一產(chǎn)物[3]。同質(zhì)二聚體GPPS由2個相同亞基，由GPPS基因編碼組成，在自然界中廣泛存在[4]，目前已從裸子植物和被子植物中分離、鑒定出GPPS基因[5-6]；而異質(zhì)二聚體GPPS則由一大一小2個亞基組成，分別由大亞基GPPS.LSU和小亞基GPPS.SSU編碼。GPPS.LSU是一類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶類似蛋白(prenyltransferase，PTS-like protein)，通常與負(fù)責(zé)催化合成二萜化合物前體香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)的香葉基香葉基焦磷酸合酶(GGPPS)有70%的序列相似性[7-8]，同時，GGPPS也可以充當(dāng)大亞基搭檔，與小亞基形成異質(zhì)二聚體GPPS，催化生成GPP，從而調(diào)節(jié)代謝底物轉(zhuǎn)向單萜物質(zhì)的合成[9]。目前，GPPS.LSU的研究主要是觀察其單獨表達(dá)是否有活性，能否與GPPS.SSU互作，以及與GPPS.SSU共表達(dá)后的催化活性。文獻(xiàn)報道僅從少數(shù)幾種植物中克隆出GPPS.LSU，包括薄荷(MenthapiperitaL.)MpGPPS.LSU、啤酒花(HumuluslupulusL.)HlGPPS.LSU、金魚草(AntirrhinummajusL.)AmGPPS.LSU和長春花(Catharanthusroseus(L.) G. Don.)CrGPPS.LSU等，其中，MpGPPS.LSU和HlGPPS.LSU單獨表達(dá)時均沒有活性，AmGPPS.LSU單獨表達(dá)時具有GGPPS催化活性，CrGPPS.LSU單獨表達(dá)時具有GPPS和GGPPS的雙催化活性[6-7,9-10]。

山雞椒(Litseacubeba(Lour.) Pers.)又名山蒼子、木姜子，多年生落葉小喬木，屬樟科(Lauraceae)木姜子屬(LitseaLam.)，廣泛分布于我國長江以南，資源豐富。山蒼子的根、葉和果實中均含有精油，其中以果實中含量最高，高達(dá)85%左右[11-12]。精油中的成分主要是單萜和倍半萜化合物，其主要成分檸檬醛更是合成紫羅蘭酮系列名貴香料的主料[13]；然而，目前我國的山雞椒主要以野生資源為主，精油產(chǎn)量和品質(zhì)受環(huán)境影響較大[12]，為培育優(yōu)良品種，提高山雞椒精油產(chǎn)量，改善精油品質(zhì)，迫切需要探究山雞椒體內(nèi)單萜合成的調(diào)控機制。目前，關(guān)于山雞椒體內(nèi)萜類合成途徑的研究甚少，僅有LcDXR、LcTPS1、LcTPS2和LcTPS3被克隆驗證[14-15]，而GPPS作為單萜合成途徑的關(guān)鍵節(jié)點，在山雞椒中尚無文獻(xiàn)報道。因此，本研究以山雞椒的幼果以及各組織為試驗材料，分析了LcGPPSs與LcGGPPSs的表達(dá)模式，并克隆了LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3基因，對蛋白之間的互作進(jìn)行探索驗證，以期為山雞椒果實中單萜的形成和調(diào)控機制研究提供理論參考，為提高精油產(chǎn)量和品質(zhì)的遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

所采用的山雞椒植株新鮮組織(花、花芽、葉芽、嫩葉、莖、果實和根等)，采自浙江杭州市富陽區(qū)中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所黃公望森林公園內(nèi)，采后迅速置于液氮中，帶回實驗室保存在-80℃冰箱，留于后續(xù)實驗。

1.2 數(shù)據(jù)來源

由于GPPS.LSU已鑒定的物種較少，且與GGPPS具有較高的相似性，為了獲得更全面的序列，作者在山雞椒的果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(NCBI登錄號：SRA080286)中分別利用擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)GGPPS11(NM_113869)和薄荷MpGPPS.LSU(AAF08792)核苷酸序列，以1×10-5為臨界值，搜索相似序列，將得到的候選序列經(jīng)過尋找編碼框(ORF Finder, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，翻譯成氨基酸序列后經(jīng)BLASTP分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，保守域分析驗證(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，共得到10條目的序列。

1.3 山雞椒總RNA的提取及cDNA合成

采集山雞椒的花、花芽、葉芽、嫩葉、莖、果實和根等組織，總RNA提取采用EASYpin Plus植物RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)。利用美國Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptⅢⅠst Strand cDNA合成第一鏈cDNA，用于后續(xù)qRT-PCR分析和基因克隆實驗。

1.4 LcGPPSs和LcGGPPSs的表達(dá)分析

采用qRT-PCR分析LcGPPSs和LcGGPPSs基因在正常生長的山雞椒不同組織間和果實發(fā)育過程中的表達(dá)模式。在4條序列的保守區(qū)域至非保守區(qū)域設(shè)計引物，測序驗證，以微管蛋白α基因(TUA)為內(nèi)參基因，檢測山雞椒不同部位這10個基因的表達(dá)水平，具體操作步驟按SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa, Tokyo, Japan)說明書進(jìn)行。以滅菌雙蒸水為模板作為空白對照，在Applied Biosystems Prism 7300儀器(ABI，美國)上進(jìn)行，目的基因相對表達(dá)水平利用2-△△Ct方法計算，所有反應(yīng)均為2次生物學(xué)重復(fù)，4次技術(shù)性重復(fù)。qRT-PCR程序如下：95℃ 30 s 1個循環(huán)，95℃ 5 s、60℃ 31 s, 35個循環(huán)。用于這10條基因的qRT-PCR引物見表1。

表1 用于表達(dá)模式分析的10條基因的qRT-PCR引物及登錄號

1.5 LcGPPS和LcGGPPSs基因的克隆

根據(jù)LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3的序列信息，分別在其開放閱讀框上、下游設(shè)計特異性引物，采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase mix(TakaRa)擴增cDNA序列。將獲得的PCR產(chǎn)物連接于pClone007載體上，并送到測序公司(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，杭州)進(jìn)行測序。用于擴增這3條基因的引物見表2。

1.6 LcGPPS和LcGGPPSs的序列分析、進(jìn)化分析以及結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用ExPaSy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線計算蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和理論等電點等基本信息，運用I-TASSER v4.3對LcGPPS和LcGGPPSs的高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測與分析[16]，多序列比對使用Clustalx、DNAMAN、Bioedit等軟件；采用鄰接算法(NJ)，使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，bootstrap檢測設(shè)置重復(fù)為1 000次。

1.7 誘餌質(zhì)粒與捕獲質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3序列分別設(shè)計上、下游帶質(zhì)粒酶切位點引物(表2)PrimeSTAR Max DNA Polymerase酶用于PCR擴增，PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸60 s，33個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段。同時分別用EcoRI/PstI雙酶切pGBKT7載體，EcoRI/BamHI、NcoI/BamHI雙酶切pGADT7載體，37℃孵育2 h，酶切結(jié)束后1%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，利用無縫克隆，連接酶切后的載體和目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，分別經(jīng)卡那霉素抗性和氨芐霉素抗性篩選，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，PCR酶切驗證后，由公司測序驗證。

表2 LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3的登錄號和引物

1.8 誘餌質(zhì)粒的毒性和自活性驗證以及捕獲質(zhì)粒的假陽性檢測

1.9 酵母共轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定

以共轉(zhuǎn)化pGBKT7-53質(zhì)粒和pGADT7-T到Y(jié)2HGold菌株作陽性對照實驗，共轉(zhuǎn)化pGBKT7-Lam質(zhì)粒和pGADT7-T到Y(jié)2HGold菌株中做陰性對照實驗，將pGADT7-L1質(zhì)粒、pGADT7-L3質(zhì)粒分別和pGBKT7-SUl質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold菌株中，分別在DDO/X、DDO/ X /A、QDO/X/A固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2. 1 LcGPPSs和LcGGPPSs家族基因成員的克隆與表達(dá)模式分析

在山雞椒的果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，共搜索得到10條目標(biāo)序列，其中,3條LcGPPS.SSU序列，分別命名為LcGPPS.SSU1、LcGPPS.SSU2和LcGPPS.SSU3；7條LcGPPS.LSU序列，由于其與LcGPPS.SSU蛋白的互作關(guān)系未知，暫且命名為LcGGPPS1-7。萜類物質(zhì)是植物重要的次生代謝物，尤其是單萜物質(zhì)更是植物與環(huán)境交流的媒介，為了探尋LcGPPS.SSU及其可能的搭檔在山雞椒體內(nèi)的作用，利用熒光定量PCR，對LcGPPS.SSUs與LcGGPPSs在山雞椒果實發(fā)育過程和不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了探究，結(jié)果見圖1、2。來自LcGPPS.SSUs家族的3個基因展現(xiàn)了2種表達(dá)模式，其中,LcGPPS.SSU2和LcGPPS.SSU3具有相似的表達(dá)模式，在山雞椒果實的發(fā)育過程中，不僅在前中期呈現(xiàn)了一個表達(dá)高峰，而且在果實發(fā)育后期表達(dá)量又有提升，而且兩基因在不同組織中也表現(xiàn)出相似的特征，都在幼果中具有較高的表達(dá)，其次是花和花蕾，然后是葉芽和根，在莖中的表達(dá)量最少，不同的是LcGPPS.SSU2整體表達(dá)量較高，LcGPPS.SSU3在花中的特異性更加明顯。LcGPPS.SSU1擁有不同的表達(dá)模式，特異性地在花、花蕾和果實中表達(dá)，而且在果實發(fā)育前中期呈現(xiàn)了一個顯著的表達(dá)高峰，其最高表達(dá)量達(dá)到LcGPPS.SSU2的5倍，達(dá)到LcGPPS.SSU3最高表達(dá)量的40倍；所以，在LcGPPS.SSUs基因家族中，作者挑選表達(dá)量最高且特異性表達(dá)的LcGPPS.SSU1作為研究對象。

來自LcGGPPSs家族的7條基因表達(dá)模式各不相同，在山雞椒果實發(fā)育過程中，LcGGPPS2、LcGGPPS4和LcGGPPS5在前中期出現(xiàn)了表達(dá)高峰，LcGGPPS3和LcGGPPS7的表達(dá)高峰則出現(xiàn)在果實發(fā)育后期，而LcGGPPS1在前中期和后期都出現(xiàn)了表達(dá)高峰，LcGGPPS6在過程中無明顯規(guī)律。在不同組織中的表達(dá)顯示，LcGGPPS3-7雖然表達(dá)量各不相同，但在花和花蕾中的表達(dá)量都顯著高于其它組織，LcGGPPS1除了在莖中表達(dá)量較低外，在其它組織中的表達(dá)量相差不大，LcGGPPS2則顯示了在果實、根、花和花蕾中的特異性，說明在LcGGPPSs家族中，LcGGPPS1參與較多組織中萜類物質(zhì)的生成，LcGGPPS2主要在果實、根與花中發(fā)揮作用，而LcGGPPS3-7主要在花發(fā)育過程中參與萜類物質(zhì)的合成，在其它部位作用較少。作者挑選分別代表2種表達(dá)模式的LcGGPPS1和LcGGPPS3，探究可能與LcGPPS.SSU1的大亞基搭檔。

LcGPPS.SSU1的表達(dá)量位于左邊主坐標(biāo)軸上，其余9條基因的表達(dá)量位于次坐標(biāo)軸上。 LcGPPS.SSU1 was exhibited in primer axis, and the rest genes were exhibited in second axis.圖1 LcGPPS.SSUs和LcGGPPSs在山雞椒果實發(fā)育過程中的表達(dá)模式Fig.1 The expression patterns of LcGPPS.SSUs and LcGGPPSs in fruits maturation

圖中共包含9條基因，LcGPPS.SSU1由于表達(dá)量過高，未在圖中顯示；FB：花芽；LG：葉芽；F：花；S：莖；R：根；FL：幼果。LcGPPS.SSU1 was absent because of extremely high expression level. The tissues tested includes flower bud (FB), leafbud (LB), flower (F), steam (S), root (R) and fruitlet (FL).圖2 LcGPPS.SSUs和LcGGPPSs在山雞椒不同組織中的表達(dá)模式Fig.2 The expression patterns of LcGPPS.SSUs and LcGGPPSs in different tissues in L. cubeba

2.2 LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3的克隆

利用PCR對LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3進(jìn)行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過1% 的瓊脂糖電泳之后，分別檢測到3條不同大小的條帶(圖3)，序列測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組電子序列一致。在NCBI中BLASTP結(jié)果顯示，LcGPPS.SSU1與來自芍藥(Paeonialactiflora，AKJ26303)的GPPS.SSU具有50%的相似性，LcGGPPS1和LcGGPPS3分別與來自歐洲榛(Corylusavellana，ABW06960.1)和葡萄(Vitisvinifera，XP_002273789.1)的GGPPS展現(xiàn)73%與60%的相似性。分別將以上3條基因提交至NCBI數(shù)據(jù)庫。登錄號與所用引物見表2。

圖3 LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3家族基因ORF擴增產(chǎn)物Fig. 3 The PCR amplification product of ORF of LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1 and LcGGPPS3

2.3 LcGPPS.SSU1分別與LcGGPPS1和LcGGPPS3的互作探究

在單萜的合成過程中，異質(zhì)二聚體GPPS起著顯著的作用，在金魚草和啤酒花里，GPPS.SSU的表達(dá)量與單萜的釋放緊密相關(guān)[6,10]，異質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)里的大亞基通常由特定的LSU或者一些GGPPS蛋白來扮演，但并不是所有的GGPPS都能充當(dāng)大亞基[7]。目前，LSU與GGPPS的界定只能通過催化活性的有無及能否與GPPS.SSU互作來鑒別，通過氨基酸序列以及三維結(jié)構(gòu)上關(guān)鍵位點來判別，目前只在少數(shù)物種中實現(xiàn)，尚未在大多數(shù)物種中得到驗證。作者利用三維結(jié)構(gòu)預(yù)測和酵母雙雜互作驗證對山雞椒LcGGPPS1和LcGGPPS3能否與LcGPPS.SSU1互作進(jìn)行了探索。

2.3.1 LcGPPS.SSU1和LcGGPPSs蛋白結(jié)構(gòu)及互作預(yù)測 以薄荷異質(zhì)GPPS晶體結(jié)構(gòu)(PDB entry: 3KRO)為參照，作者利用I-TASSER v4.3對LcGPPS.SSU1分別與LcGGPPS1和LcGGPPS3的晶體互作結(jié)構(gòu)進(jìn)行了互作預(yù)測。LcGGPPS1/3與LcGPPS.SSU1的三維模型主要由α-螺旋組成，以無規(guī)則卷曲和轉(zhuǎn)角等連接，LcGGPPS1/3與LcGPPS.SSU1能分別覆蓋到薄荷異質(zhì)二聚體大小亞基的三維結(jié)構(gòu)上，也就是說晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測LcGGPPS1與LcGGPPS3都能與LcGPPS.SSU1互作，構(gòu)成異質(zhì)二聚體GPPS，由于LcGGPPS1與LcGGPPS3的結(jié)構(gòu)相似，圖4中以LcGGPPS1與LcGPPS.SSU1的互作結(jié)構(gòu)為例。

2.3.2 酵母雙雜驗證LcGPPS.SSU1的互作蛋白

2.3.2.1 誘餌質(zhì)粒的毒性和自活性驗證以及捕獲質(zhì)粒的假陽性檢測 Y2HGold-pGBKT7-SU1在SD/-Trp、SD/-Trp/X、SD/-Trp/X/A固體培養(yǎng)基上的觀察結(jié)果(圖5)顯示：該菌株沒有自激活，沒有毒性，說明pGBKT7-SU1可以作為誘餌蛋白用于互作驗證。pGBKT7原型質(zhì)粒與pGADT7-L1共轉(zhuǎn)化Y2HGold，在DDO/X、DDO/X /A、QDO/X/A上的培養(yǎng)結(jié)果顯示：pGADT7-L1質(zhì)粒沒有發(fā)生自激活，沒有產(chǎn)生假陽性。pGBKT7原型質(zhì)粒與pGADT7-L3的共轉(zhuǎn)化培養(yǎng)結(jié)果顯示：pGADT7-L3也沒有發(fā)生自激活和假陽性。

圖4 LcGPPS.SSU1(紅色)與LcGGPPS1(橙色)的二聚體結(jié)構(gòu)Fig. 4 Dimeric structures of LcGPPS.SSU1(red) and LcGGPPS1(orange)

2.3.2.2 pGBKT7-SU1分別與pGADT7-L1和pGADT7-L3的酵母雙雜結(jié)果 以共轉(zhuǎn)化pGBKT7-53質(zhì)粒和pGADT7-T到Y(jié)2HGold菌株作陽性對照，共轉(zhuǎn)化pGBKT7-Lam質(zhì)粒和pGADT7-T到Y(jié)2HGold菌株中做陰性對照，將pGBKT7-SU1和pGADT7-L1共轉(zhuǎn)化Y2HGold。培養(yǎng)結(jié)果(圖6)顯示：在DDO/X平板上出現(xiàn)明顯藍(lán)色菌落，說明編碼a半乳糖苷酶的MEL1報告基因已被激活，其分泌的a半乳糖苷酶能與培養(yǎng)基中的X-a-gal相互作用而使菌落呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色，但是在DDO/ X /A和QDO/X/A平板上并沒有長出菌落，說明二者表達(dá)的蛋白之間沒有互作，轉(zhuǎn)化菌株沒有獲得AbA抗性。pGBKT7-SU1與pGADT7-L3共轉(zhuǎn)化Y2HGold，培養(yǎng)結(jié)果(圖6)顯示：在3種平板上都長有菌落，但與陽性克隆在相同平板上的表現(xiàn)相比，長出的菌落較少且著色較淺，說明pGBKT7-SU1與pGADT7-L3質(zhì)粒表達(dá)的蛋白雖然存在互作，但作用強度較弱。

A：Y2HGold-pGBKT7-SU1菌株自激活及毒性檢測；B：pGADT7-L1質(zhì)粒假陽性驗證；C：pGADT7-L3質(zhì)粒假陽性驗證。A: Testing Bait Y2HGold-pGBKT7-SU1 for autoactivation and toxicity; B: Eliminating false positive of pGADT7-L1; C: Eliminating false positive of pGADT7-L3.圖5 誘餌質(zhì)粒自激活驗證及捕獲質(zhì)粒假陽性驗證Fig.5 Verification of Y2HGold-pGBKT7-SU1 for autoactivation and toxicity and false positive for pGADT7-L1 and pGADT7-L3

圖6 LcGPPS.SSU1分別和LcGGPPS1與LcGGPPS3的蛋白互作驗證以及陰性和陽性對照Fig.6 Verifying of the proteins interactions between LcGPPS.SSU1and LcGGPPS1/3 and negative and positive control

2.4 LcGPPS.SSU1與LcGGPPSs的系統(tǒng)進(jìn)化分析

編碼GPPS和GGPPS關(guān)鍵酶的基因已經(jīng)從數(shù)十種植物中分離出來，利用鄰接法(NJ)，對山雞椒LcGPPS.SSU1和LcGGPPSs及一些植物GPPS/GGPPS蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。圖7表明：43條蛋白序列清楚地分成3類(圖中所包含的序列及登錄號見表3)，其中：SSUII與GGPPS聚成一大類，說明SSUII與GGPPS的相似性更高；SSUI單獨聚成一小類，LcGPPS.SSU1聚類到SSUI里，同在這一類的多來自芳香植物，其中包含來自丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的SmGPPS.SSUI, LcGPPS.SSU1的表達(dá)模式也與SSUI的特征相同，主要表達(dá)在單萜的儲藏與釋放器官[6,9]。在SSUII分類中，包含擬南芥的AtSSU(即AtGGPPS12)和來自丹參的 SmGPPS.SSUII1和SmGPPS.SSUII2，說明一個物種中可能同時含有兩類GPPS.SSU，其分類可能與功能的分化有關(guān)，而不是之前報道的根據(jù)物種分類。在GGPPS這一類中，可以看到主要包括兩大類，分別由來自被子植物和裸子植物的GGPPS蛋白組成，其中,裸子植物分類中含有2條來自被子植物的蛋白序列，分別是丹參和麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL.)；在被子植物分類中，又分出若干小的類別，而已克隆并鑒定活性的4條LSU序列聚成一個小類，說明LSU起源于GGPPS，并且已經(jīng)進(jìn)化出了特定的功能，與其它的GGPPS親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，LcGGPPS3不僅沒有聚到LSU分類中，還與SmGGPPS3一起聚類到裸子植物與被子植物的GGPPS之外，說明其與大多數(shù)的GGPPS蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其起源可能要早于裸子植物與被子植物的分化。

圖7 山雞椒與其它物種GPPS/GGPPS系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.7 Phylogenetic relationship between L. cubeba and other plants GPPS/GGPPS families

序號No．縮寫Abbreviationinthetree物種Species登錄號Accessionnumber序號No．縮寫Abbreviationinthetree物種Species登錄號Accessionnumber1EuGGPPSElaeagnusumbellataACO5990521LiSSULavandulaintermediaAGH33891．12TkGGPPSTaraxacumkok?saghyzALJ30146．122AtSSUArabidopsisthalianaAAG40013．13PbGGPPSPlectranthusbarbatusALE19959．123GmSSUGlycinemaxNP＿001238613．14PmGGPPSPinusmassonianaAGU43761．124MsSSUMedicagosativaAEL29573．15JcGGPPSJatrophacurcasNP＿001295715．125VvSSUVitisviniferaXP＿0022780236CaGGPPSCorylusavellanaABW06960．126OsSSUOryzasativaEAY87007．17TcGGPPSTaxuscanadensisAAD16018．127HbSSUHeveabrasiliensisBAF983008MtGGPPSMedicagotruncatulaXP＿003629488．128AgGPPS2AbiesgrandisAAN01134．19MsGGPPSMedicagosativaADG0184129AgGPPS1AbiesgrandisAAN01133．110GbGGPPSGinkgobilobaAAQ72786．130AgGPPS3AbiesgrandisAAN01135．111NaGGPPSNicotianaattenuataABQ53935．131SmGPPS．SSUISalviamiltiorrhizaJN83110812CrGPPS．LSUCatharanthusroseusAGL91645．132SmGPPS．SSUII．1SalviamiltiorrhizaJN83110913MpGPPS．LSUMenthapiperitaAAF08793．133SmGPPS．SSUII．2SalviamiltiorrhizaJN83111014AmGPPS．LSUAntirrhinummajusAAS82860．134SmGGPPS1SalviamiltiorrhizaFJ64361715SmGPPS．LSUSalviamiltiorrhizaAEZ55681．135SmGGPPS2SalviamiltiorrhizaJN83111216MpSSUMenthaxpiperitaAAF08792．136SmGGPPS3SalviamiltiorrhizaJN83111317HlSSUHumuluslupulusACQ90681．137AtGGPPS2ArabidopsisthalianaNM＿127943．218LcSSULeucosceptrumcanumALT07956．138AtGGPPS11ArabidopsisthalianaNM＿113869．119CbSSUClarkiabreweriAAS82870．139CsGGPPSCrotonsublyratusBAA86284．120AmSSUAntirrhinummajusAAS82859．140AgGGPPSAbiesgrandisAAL17614．2

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)報道，Chang等[7]為驗證異質(zhì)MpGPPS的催化活性，在底物結(jié)合與催化區(qū)域挑選3個氨基酸殘基，構(gòu)建了[LSU(D83A/D84A/D89A)·SSU]2突變體，發(fā)現(xiàn)突變體完全沒有活性，證實異質(zhì)GPPS的催化活性是由MpLSU大亞基行使；而通過晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，MpSSU通過R loop限制住MpLSU的移動，并通過催化活性腔構(gòu)象的改變影響底物的結(jié)合以及產(chǎn)物的變化，從而改變催化的特異性，說明異質(zhì)二聚體GPPS中，LSU負(fù)責(zé)催化，SSU負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)。在金魚草和薄荷中，其單萜釋放量與GPPS.SSU組織時空表達(dá)水平呈相關(guān)，與GPPS.LSU表達(dá)無相關(guān)性，說明SSU在單萜的合成過程中可能起關(guān)鍵的作用[7,10]，Orlova等[17]將本身不具有催化活性的金魚草AmSSU在煙草中超表達(dá)，結(jié)果也獲得了單萜釋放量增加，提示外源AmSSU可以與系統(tǒng)進(jìn)化上較遠(yuǎn)的煙草GGPPS互作，并改變了其催化特異性，調(diào)節(jié)底物轉(zhuǎn)向單萜合成方向。此外，早期研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯處理能夠通過刺激轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而調(diào)控萜類積累相關(guān)的酶基因的表達(dá)[18]。Avanish等[9]用茉莉酸甲酯處理長春花的葉子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著誘導(dǎo)了CrGGPPS.SSU的表達(dá)，說明GPPS.SSU能夠通過轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)外界刺激，找到能與之互作的GGPPS并改變其催化活性從而改變代謝底物轉(zhuǎn)向單萜合成，生成與防御、化感以及繁殖相關(guān)的單萜物質(zhì)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，GPPS.LSU起源于GGPPS，已經(jīng)與GGPPS蛋白展現(xiàn)出一定的遺傳距離，聚成一個單獨的類別，說明在與GPPS.SSU的互作過程中，GPPS.LSU出現(xiàn)了選擇性進(jìn)化。結(jié)合山雞椒中3條序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析，LcGGPPS3不僅不屬于LSU類別，且與大部分GGPPS和LSU蛋白距離較遠(yuǎn)，但LcGGPPS3能與LcGPPS.SSU1互作，說明GPPS.SSU不僅能與LSU互作，也能與部分GGPPS互作，但這部分GGPPS作者通過系統(tǒng)進(jìn)化分析并不能辨別。

Chang等[7]從晶體結(jié)構(gòu)角度對大小亞基之間的互作進(jìn)行解析，根據(jù)薄荷GPPS，(LSU·SSU)2異四聚體的晶體結(jié)構(gòu)，比較來自白芥(SinapisalbaL.)同型二聚體GGPPS與MpGPPS.LSU的序列發(fā)現(xiàn)，在大小亞基互作界面A上存在4個氨基酸殘基與二聚體形成的性質(zhì)有關(guān)，在SaGGPPS結(jié)構(gòu)里，這4個氨基酸通過與另一個相同亞基氨基酸之間的作用力來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，但在MpGPPS.LSU結(jié)構(gòu)里，這4個氨基酸被替換，當(dāng)MpGPPS.LSU形成同型二聚體時，相互之間的作用力消失或者產(chǎn)生相排斥的力，造成同型二聚體結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，認(rèn)為這可能是MpGPPS.LSU更傾向于形成異質(zhì)二聚體而不是同型二聚體的原因，但通過對比到山雞椒LcGGPPS3，作者發(fā)現(xiàn)這一規(guī)律并不完全符合，而來自金魚草的AmGPPS.LSU不僅能與AmGPPS.SSU互作，而且單獨表達(dá)時還具有GGPPS催化活性，說明GGPPS與LSU蛋白之間的界定并不是嚴(yán)格的非此即彼，結(jié)合Mp異四聚體的晶體結(jié)構(gòu)，作者發(fā)現(xiàn)上面討論的4個關(guān)鍵氨基酸只是位于互作界面的一條螺旋結(jié)構(gòu)上，互作界面還包括另外3條螺旋結(jié)構(gòu)，說明界面上還存在更多的氨基酸殘基之間的作用力來維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

作者的實驗結(jié)果表明，LcGPPS.SSU1與LcGGPPS3 二者在山雞椒果實成熟過程中也呈現(xiàn)相似的表達(dá)模式，并且LcGPPS.SSU1通過與LcGGPPS3蛋白互作從而在山雞椒精油單萜合成中發(fā)揮作用。另外，LcGGPPS3雖然能與LcGPPS.SSU1互作，但實驗顯示互作不是很強，提示可能還存在其它的GGPPS或特定的LSU能與LcGPPS.SSU1互作，也就是說LcGPPS.SSU1可能互作的搭檔不止一個。在LcGGPPS家族中，每一條基因的表達(dá)模式都不相同，但具體分工還需要試驗的進(jìn)一步驗證。LcGPPS.SSU1與LcGGPPS3的互作為研究山雞椒精油中單萜合成的機制提供了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究中，分離克隆得到了LcGPPS.SSU1、LcGGPPS1和LcGGPPS3基因，其中LcGPPS.SSU1特異性地在山雞椒花和果實中呈現(xiàn)高表達(dá)水平，在山雞椒果實發(fā)育過程中，LcGGPPS3呈現(xiàn)出與LcGPPS.SSU1相似的表達(dá)趨勢，酵母雙雜交實驗證實，LcGGPPS3可以與LcGPPS.SSU1互作，從而在山雞椒精油單萜合成中發(fā)揮作用。

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GeneExpressionPatternofLcGPPSandItsInteractionwithLcGGPPSsinLitseacubeba

CAOPei1,CHENYi-cun1,GAOMing1,GUOHao-bo2,WANGYang-dong1

(1. Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Hangzhou 311400, Zhejiang, China;2. Department of Biochemistry, University of Tennessee, Knoxville TN 37996, Tennessee, USA)

ObjectiveTo identify the interacted proteins of geranyl diphosphate synthase (GPPS) and provide theoretical bases for illuminating the mechanism of monoterpene biosynthesis inLitseacubeba.MethodThe transcriptome database of fruits ofL.cubebawas searched by basic blast tool. RT-PCR was used to cloneGPPSgenes (LcGPPS.SSU1 encoding the small subunit of heteromeric GPPS) andGGPPSgenes (LcGGPPS1 andLcGGPPS3). qRT-PCR was conducted to analyze the expression patterns. In addition, prediction of three-dimensional structure models and yeast two-hybrid system were used to verify the protein interaction.ResultLcGPPS.SSU1,LcGGPPS1 andLcGGPPS3 were cloned. The expression pattern analysis showedLcGPPS.SSU1 specifically expressed in flower, flower bud and fruit in a significant high level. The prediction of protein interaction showed that both LcGGPPS1 and LcGGPPS3 could interact with LcGPPS.SSU1, while the result of yeast two-hybrid system showed that only LcGGPPS3 can interact with LcGPPS.SSU1.ConclusionLcGPPS.SSU1 can interact with LcGGPPS3 to form heterodimer to function in the terpenoids biosynthesis inL.cubeba, which provides knowledge for addressing the mechanism of terpenoids biosynthesis pathway inL.cubeba.

Litseacubeba; terpenoids biosynthesis; GPPS; GGPPS; heterodimer; protein interaction; expression pattern

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.06.024

2017-02-13

國家自然科學(xué)基金項目(31370576)

曹 佩(1992—)，女，河南信陽人，碩士研究生，研究方向為林木遺傳育種.

* 通訊作者：汪陽東，研究員，博士，研究方向為林木遺傳育種與分子生物學(xué).E-mail:Wyd11111@126.com

S718.46

A

1001-1498(2017)06-1050-09

金立新)