鹽源縣部分養(yǎng)鴨場主要病原菌分離鑒定及其耐藥性分析

周厚繼，鄭 敏，汪德生*

(1.四川省鹽源縣職業(yè)技術(shù)中學(xué)校，四川鹽源 615700；2.貴州大學(xué)動物疫病研究所，貴陽 550025)

鹽源縣部分養(yǎng)鴨場主要病原菌分離鑒定及其耐藥性分析

周厚繼1，鄭 敏2，汪德生2*

(1.四川省鹽源縣職業(yè)技術(shù)中學(xué)校，四川鹽源 615700；2.貴州大學(xué)動物疫病研究所，貴陽 550025)

為掌握養(yǎng)鴨場病原菌種類及其耐藥情況，采用傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)方法進(jìn)行病原菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)，PCR方法進(jìn)行耐藥基因檢測，結(jié)果顯示：養(yǎng)鴨場病原菌主要是大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和鴨里默氏桿菌三種；主要病原菌對20種抗菌藥呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，在大腸埃希氏菌分離株中檢出TEM和CTX-M耐藥基因，在金黃色葡萄球菌分離株中檢出mecA和blaZ耐藥基因。這些結(jié)果為鹽源縣養(yǎng)鴨場細(xì)菌性疾病的預(yù)防與控制提供了科學(xué)依據(jù)。

養(yǎng)鴨場；病原菌；分離鑒定；耐藥性

隨著鴨養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；c集約化發(fā)展，鴨傳染性疾病已成為阻礙養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的重要因素[1]。引起養(yǎng)鴨場發(fā)生鴨傳染性疾病的病原微生物主要有細(xì)菌、病毒和寄生蟲等，但以細(xì)菌感染最為常見[2]。養(yǎng)鴨場為防止細(xì)菌性疾病的發(fā)生與流行，常采用抗菌藥拌料飼喂或直接肌內(nèi)注射等，特別是有些抗菌藥作為添加劑，可用來預(yù)防細(xì)菌性疾病和促進(jìn)動物生長發(fā)育。目前，抗菌藥廣泛應(yīng)用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性問題，已成為全世界關(guān)注的熱點(diǎn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界生產(chǎn)的抗菌藥有50%以上用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，且很多養(yǎng)殖場認(rèn)為只要加大劑量和延長使用，即可控制細(xì)菌性疾病的發(fā)生與流行。而小劑量與長時(shí)間給藥，實(shí)際上是細(xì)菌耐藥性的誘導(dǎo)過程；細(xì)菌耐藥性可通過耐藥質(zhì)粒等傳遞給其他菌株，并通過污染環(huán)境、水源、食品或人與動物直接接觸而傳給人，嚴(yán)重影響人類健康。本研究擬通過對養(yǎng)鴨場菌的分離鑒定、耐藥性分析和耐藥基因檢測，以期為養(yǎng)鴨場細(xì)菌性疾病的預(yù)防與控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 細(xì)菌培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑、細(xì)菌生化培養(yǎng)管、細(xì)菌藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；瓊脂糖、DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DL2000 Marker、GoldView核酸染料，購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 病料來源與實(shí)驗(yàn)動物 病死鴨內(nèi)臟器官(如心、肝、脾、腎等)等組織病料，采自鹽源縣部分規(guī)模養(yǎng)鴨場；實(shí)驗(yàn)動物BALB/c鼠，購自西昌學(xué)院動物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心。

1.3 病原菌分離鑒定 無菌采集病死鴨組織病料，劃線接種于細(xì)菌培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)菌生長情況；挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)后，取細(xì)菌純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、生理生化鑒定和動物感染試驗(yàn)，分析致病菌種類。

1.4 病原菌耐藥性分析 取已鑒定的細(xì)菌分離物，接種液體培養(yǎng)基，取細(xì)菌液體培養(yǎng)物150 μL，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，待自然涼干后，貼上藥敏紙片，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，測定抑菌圈直徑并記錄，分析分離細(xì)菌的耐藥情況。

1.5 病原菌耐藥性基因檢測 設(shè)計(jì)和合成埃希氏菌β-內(nèi)酰胺酶TEM、CTX-M和SHV耐藥基因引物以及葡萄球菌β-內(nèi)酰胺類mecA和blaZ耐藥基因引物，提取細(xì)菌培養(yǎng)物DNA樣本，采用PCR擴(kuò)增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察和分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病死鴨細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色鏡檢 無菌采集病死或?yàn)l死鴨的內(nèi)臟器官組織，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，采用厭氧或兼性厭氧法進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24～48 h觀察，結(jié)果如圖1所示。

從圖1結(jié)果可看出，在巧克力營養(yǎng)瓊脂平板上可見圓形、邊緣整齊、乳白色、光滑的菌落；在鮮血瓊脂平板上形成凸起、邊緣整齊、透明、有光澤、無溶血的菌落。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，部分結(jié)果如圖2所示。

圖1 部分病死鴨組織樣本細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果Fig 1 The isolated culture results of bacteria from the partial diseased duck tissue samples

圖2 部分分離細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果Fig 2 The Gram staining results of partial isolated bacteria

2.2 分離細(xì)菌鑒定結(jié)果 挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)后，接種細(xì)菌生化管，培養(yǎng)48 h觀察分離細(xì)菌發(fā)酵情況，并結(jié)合其菌落形態(tài)特點(diǎn)和菌體染色特征，判定分離細(xì)菌種類，結(jié)果如表1所示。

表1 養(yǎng)鴨場分離細(xì)菌鑒定結(jié)果Tab 1 The identification results of isolated bacteria in duck farm

由表1結(jié)果可知，從規(guī)模養(yǎng)鴨場病死鴨病料組織中分離出7個(gè)屬137株菌，其中主要是埃希氏菌屬細(xì)菌(58株)、葡萄球菌屬細(xì)菌(47株)和里默氏桿菌屬細(xì)菌(14株)，分離率分別為42.34%、34.31%和10.22%。隨機(jī)選取埃希氏菌30株、葡萄球菌30株和里默氏桿菌10株的液體培養(yǎng)物，接種BALB/c鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的細(xì)菌均能致死BALB/c鼠，致死率分別為40%、40%和20%。

2.3 養(yǎng)鴨場病原菌耐藥性檢測結(jié)果 取分離的主要病原菌(即埃希氏菌30株、葡萄球菌30株和里默氏桿菌10株)液體培養(yǎng)物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

從表2結(jié)果可知，養(yǎng)鴨場主要病原菌均有不同程度的耐藥現(xiàn)象，其中埃希氏菌分離株對青霉素G、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、先鋒霉素、四環(huán)素、乙酰螺旋霉素、環(huán)丙氟哌酸、磺胺甲基異惡唑和林可霉素的耐藥率達(dá)100%；葡萄球菌分離株對青霉素G、頭孢噻肟、先鋒霉素、四環(huán)素、紅霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素和氟苯尼考的耐藥率達(dá)93.3%；里默氏桿菌分離株對青霉素G、阿莫西林、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、阿奇霉素、磺胺甲基異惡唑和氟苯尼考的耐藥率達(dá)100%。

表2 規(guī)模養(yǎng)鴨場主要病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The results of drug susceptibility test of the main pathogens in scale duck farms

根據(jù)養(yǎng)鴨場主要病原菌(埃希氏菌、葡萄球菌和里默氏桿菌)對20種抗生素的耐藥情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3所示。

由表3結(jié)果可知，養(yǎng)鴨場主要病原菌均存在多重耐藥現(xiàn)象，其中埃希氏菌分離株多重耐藥現(xiàn)象最為嚴(yán)重，呈現(xiàn)13重以上耐藥；里默氏桿菌分離株多重耐藥現(xiàn)象次之，以9～12重常見；葡萄球菌分離株多重耐藥現(xiàn)象相對較少，以5～12重耐藥為主。

2.4 養(yǎng)鴨場主要病原菌耐藥基因檢測

2.4.1 埃希氏菌β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因檢測 選取30株埃希氏菌分離株培養(yǎng)物，提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA作為模板，采用β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示。

從圖3結(jié)果可看出，在30株埃希氏菌分離株中，可檢測到β-內(nèi)酰胺酶TEM型耐藥基因(1080 bp)和CTX-M型耐藥基因(585 bp)，檢出率分別為46.7%(14/30)和100% (30/30)，而未檢測到β-內(nèi)酰胺酶SHV型耐藥基因。

2.4.2 葡萄球菌β-內(nèi)酰胺酶基因檢測 選取30株葡萄球菌分離株培養(yǎng)物，提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA作為模板，采用β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(mecA耐藥基因和blaZ耐藥基因)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖4所示。

從圖4結(jié)果可看出，在30株葡萄球菌分離株中，可檢測到β-內(nèi)酰胺類mecA耐藥基因(1847 bp)和blaZ耐藥基因(800 bp)，檢出率分別為13.3%(4/30)和60.0%(18/30)。

表3 養(yǎng)鴨場病原菌多重耐藥性分析結(jié)果Tab 3 The analysis results of multiple drug resistance of pathogen in duck farms

M：DL2000 Marker；1：陰性對照；2-7：部分埃希氏菌菌株M:DL2000 Marker;1:negative control;2-7:part of the Escherichia coli strain

M：DL2000 Marker；7：陰性對照；1-6：部分埃希氏菌菌株M:DL2000 Marker;7:negative control;1-6:part of the Escherichia coli strain

M：Marker DL2000；1-5：部分菌株；-：陰性對照M:Marker DL2000; 1-5:Part of the strain; -:negative control圖4 葡萄球菌部分菌株β-內(nèi)酰胺酶基因PCR結(jié)果Fig 4 The β-lactamase gene PCR results of part of Staphylococcus

3 討論與小結(jié)

隨著養(yǎng)鴨業(yè)規(guī)?；c集約化發(fā)展，鴨傳染性疾病的發(fā)生也日益頻繁，特別是細(xì)菌性疾病，常給養(yǎng)鴨場造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。引起養(yǎng)鴨場發(fā)生細(xì)菌性疾病的病原較多，有埃希氏菌、葡萄球菌、里默氏桿菌等，但不同地區(qū)分離的病原菌有所不同，例如鄧伯雄等[4]在四川省涼山州規(guī)模養(yǎng)鴨場中分離鑒定的致病菌主要是大腸埃希氏菌；楊軍等[5]對廣西和湖北部分規(guī)模養(yǎng)鴨場病死鴨分離得到的病原菌主要是葡萄球菌；陳俊等[6]在重慶等地區(qū)規(guī)模養(yǎng)鴨場發(fā)病鴨中分離出的主要是沙門氏菌；鄒宇靖等[7]對江蘇省等地區(qū)規(guī)模養(yǎng)鴨場調(diào)查發(fā)現(xiàn)里默氏桿菌是主要病原菌。本研究從鹽源縣養(yǎng)鴨場病死鴨組織病料中分離出的細(xì)菌較多，包括7個(gè)屬細(xì)菌，其中主要是埃希氏菌、葡萄球菌和里默氏桿菌，說明鹽源縣養(yǎng)鴨場的病原菌較為復(fù)雜，混合感染的可能性比較大。

為預(yù)防和控制細(xì)菌性疾病的發(fā)生與流行，一個(gè)主要措施是應(yīng)用抗生素拌料飼喂或肌內(nèi)注射。但隨著抗菌藥的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象不斷增多。張濟(jì)培等[8]對廣東省水禽大腸埃希氏菌耐藥性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其耐藥率高達(dá)81.58%，說明大腸埃希氏菌對多數(shù)抗菌藥已普遍產(chǎn)生了耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽源縣養(yǎng)鴨場分離的主要病原菌耐藥性較高，其中埃希氏菌分離株對10種抗菌藥的耐藥率達(dá)100%；里默氏桿菌分離株對8種抗菌藥的耐藥率達(dá)100%；葡萄球菌分離株對8種抗生素的耐藥率為93.3%，且這三種主要病原菌均呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因很多，但最常見的是細(xì)菌本身攜帶耐藥基因。本研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)模養(yǎng)鴨場分離出的三種病原菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素(β-lactam antibiotics)的耐藥最為常見。因此選取埃希氏菌和葡萄球菌分離株進(jìn)行β-內(nèi)酰胺耐藥基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，埃希氏菌分離株主要存在CTX-M型和TEM型β-內(nèi)酰胺耐藥基因，而葡萄球菌分離株則主要存在mecA型和blaZ型耐藥基因。這些研究結(jié)果為鹽源縣養(yǎng)鴨場細(xì)菌性疾病的預(yù)防與控制提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] 陳溥言. 獸醫(yī)傳染病學(xué)(第五版)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.

Chen F Y .Veterinary Epidemiology(Fifth edition)[M]. Beijing: Chinese Agricultural Press, 2011.

[2] 張大丙. 當(dāng)前鴨病流行現(xiàn)狀及防控對策[J]. 中國家禽，2012，34(7): 38-40.

Zhang D B. Present Situation and Control Countermeasures of Current Duck Disease[J]. China Poultry,2012，34(7):38-40.

[3] 林 安，喻 元，胡嵐嵐，等. 鴨源大腸桿菌和沙門菌混合感染的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2012，48(4): 45-47.

Lin A, Yu Y, Hu L L,etal. Isolation, Identification and Drug Sensitivity Test of Mixed Infection ofEscherichiacoliandSalmonellain Duck[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine,2012，48(4):45-47.

[4] 鄧伯雄，劉 情，鄧安元，等. 鴨致病性大腸桿菌分離鑒定及其相關(guān)致病性分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2016，43(1): 235-241.

Deng B X, Liu Q, Deng A Y,etal. Isolation，Identification and Related Pathogenicity Analysis of Duck PathogenicE.Coli[J]. China Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2016,43(1):235-241.

[5] 楊 軍.鴨源葡萄球菌分離鑒定、毒力基因檢測及與致病性相關(guān)性分析[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

Yang J. Isolation, Identification, Virulence Gene Detection of Ducks Staphylococci and Pathogenicity on Ducks[D]. Wuhan:Hua Zhong agricultural university ,2014.

[6] 陳 俊，蔣文燦，程 平，等. 四川和重慶地區(qū)鴨源沙門氏菌分離鑒定及血清型分析[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，37(4): 262-265.

Chen J, Jiang W C, Cheng P,etal. Isolation,Identification and Serotype Analysis of Salmonella from Ducklingsand Dead Duck-embryos in Sichuan and Chongqing[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine,2015, 37(4):262-265.

[7] 鄒宇靖，丁志國，李軍朝，等. 鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016，6: 114-115.

Zhou Y J, Ding Z G, Li J C,etal. Isolation and Identification of Riemerella Anatipestifer[J]. Heilongjiang Animal Science And veterinary Medicine, 2016, 6:114-115.

[8] 張濟(jì)培，韋慶蘭，譚華龍，等. 廣東水禽源大腸埃希氏菌耐藥性及氨基糖苷類耐藥基因研究[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37(5): 42-46.

Zhang J P, Wei Q L, Tan H L,etal. Investigation on Aminoglycosides Antibiotics Resistance and Resistance Genes ofEscherichiacoliIsolated from Waterfowl in Guangdong Province[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2016,37(5):42-46.

IsolationandIdentificationofMainPathogenicBacteriaandItsDrugResistanceAnalysisinDuckFarms

ZHOU Hou-ji1, ZHENG Min2, WANG De-sheng2*

(1.VocationalTechnicalMiddleSchoolofYanyuanCounty,Sichuan,Yanyuan615700,China;2.InstituteofAnimalDiseases,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China)

WANGDe-sheng,E-mail:zjqzsb110513@163.com

In order to master the pathogen species and its drug resistance in duck field, the traditional bacteriological method was used to identify the pathogen and drug susceptibility test, and the PCR method was used to detect the drug resistance gene. The results showed that the pathogen isEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandRiemerellaspp.;The main pathogens showed multiple drug resistance to 20 kinds of antibiotics, and the TEM and CTX-M resistance genes were detected inEscherichiacoliisolates, MecA and blaZ resistance genes were detected inStaphylococcusaureusisolates. These results provide a scientific basis for the prevention and control of bacterial diseases in Yanyuan county.

duck farm; pathogen; isolation and identification; drug resistance

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.03

2017-05-22

A

1002-1280 (2017) 12-0013-06

S852.61

周厚繼，中教高級教師，從事畜牧獸醫(yī)方面教學(xué)與科研工作。

汪德生。E-mail：zjqzsb110513@163.com。

(編輯：侯向輝)