雜交鱘中草藥免疫增強(qiáng)劑的體外快速篩選

唐黎 龔蘆璽 姜海波 林艷紅

摘要：采用雜交鱘的離體外周血和中草藥的水提液進(jìn)行共同孵育的方法，快速篩選雜交鱘中草藥免疫增強(qiáng)劑。實(shí)驗(yàn)選用質(zhì)量為365 g，體長(zhǎng)18 cm的雜交鱘魚(yú)1尾，抽取雜交鱘魚(yú)的血樣，提取其白細(xì)胞，用苦參、茵陳、杜仲、淫羊藿、茯苓、紫草、甘草、生地等八種中草藥濃度為0.5 g/mL的水提液與雜交鱘的外周血白細(xì)胞共同孵育后，分別采用抗超氧陰離子試劑盒、金黃色葡萄球菌法來(lái)測(cè)定雜交鱘的氧呼吸爆發(fā)活性以及中草藥對(duì)雜交鱘白細(xì)胞的吞噬活性（吞噬活性以吞噬百分比（phagocytic percent-age，PP）和吞噬指數(shù)（phagocytic index，PI）表示）的影響。結(jié)果表明：各處理組外周血白細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性均存在顯著差異（P<005），其中苦參、茵陳、杜仲、淫羊藿、茯苓、紫草和甘草組顯著高于對(duì)照組（P<0.05），生地顯著低于對(duì)照組（P<0.05）?？鄥?、茯苓、生地組外周血白細(xì)胞吞噬百分比顯著高于對(duì)照組（P<0.05）?？鄥?、生地組外周血白細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），紫草和甘草組外周血白細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：結(jié)合上述評(píng)價(jià)指標(biāo)，苦參、茯苓更加適合作為雜交鱘候選免疫增強(qiáng)劑。

關(guān)鍵詞：中草藥；雜交鱘；免疫力

雜交鱘已成為我國(guó)新興的淡水養(yǎng)殖優(yōu)良品種，它具有養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益好、飼料轉(zhuǎn)化率高、生長(zhǎng)快等特點(diǎn)，由于集約化程度越來(lái)越高，養(yǎng)殖密度不斷增加也給鱘魚(yú)的養(yǎng)殖帶來(lái)病害方面的問(wèn)題。溶菌酶是魚(yú)類(lèi)抵擋病原菌感染的重要酶類(lèi)[1]，因此，許多學(xué)者對(duì)魚(yú)類(lèi)溶菌酶的特性和血液白細(xì)胞的吞噬活性都進(jìn)行了研究[2-3]。中草藥具有毒副作用小、價(jià)格低廉、資源豐富等優(yōu)點(diǎn)，并且它能夠明顯促進(jìn)機(jī)體的非特異性及特異性免疫反應(yīng)，提高機(jī)體的抵抗力和抗病力，是廣泛應(yīng)用在動(dòng)物體的免疫增強(qiáng)劑[4]。使用中草藥作為免疫增強(qiáng)劑不僅可以解決抗生素、化學(xué)藥物等引發(fā)的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)藥殘超標(biāo)和抗 （耐） 藥性等問(wèn)題，而且還符合漁業(yè)發(fā)展中無(wú)公害水產(chǎn)品生產(chǎn)上綠色化的需求[5]，現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)多種中草藥有效成分可以增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能，主要是通過(guò)調(diào)動(dòng)非特異性來(lái)抵抗病原生物實(shí)現(xiàn)的[6]。采用免疫增強(qiáng)劑增強(qiáng)魚(yú)體的抵抗力和免疫力，降低魚(yú)病的發(fā)生率，在當(dāng)下正逐漸成為保證養(yǎng)殖效益和控制魚(yú)病的關(guān)鍵措施。通過(guò)將免疫增強(qiáng)劑添加在魚(yú)類(lèi)的飼料中現(xiàn)已成為了國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[7-12]。

關(guān)于鱘魚(yú)養(yǎng)殖的研究多局限于對(duì)鱘生長(zhǎng)指標(biāo)及存活率等方面的評(píng)價(jià)， 但是對(duì)鱘魚(yú)生理指標(biāo)變化的探討較少。本實(shí)驗(yàn)以雜交鱘為研究對(duì)象，采用雜交鱘外周血與中草藥的水提液共同孵育的方法，探討了中草藥對(duì)雜交鱘氧呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性的影響，旨在篩選出能提高雜交鱘免疫力和抗病能力的免疫增強(qiáng)劑。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用中草藥和實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

實(shí)驗(yàn)所用8種中草藥購(gòu)于貴州省貴陽(yáng)花溪區(qū)中草藥藥店，中草藥的中文名及拉丁文名如表1所示。實(shí)驗(yàn)用雜交鱘魚(yú)購(gòu)于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)貴州大學(xué)南校區(qū)附近農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，質(zhì)量365 g，體長(zhǎng)18 cm，無(wú)病無(wú)傷，暫養(yǎng)于水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室。

1.2主要試劑及配制方法

1.2.1Giemsa染色液5 g吉姆薩粉加入22 mL丙三醇，研磨至無(wú)顆粒狀態(tài)，56 ℃下保溫2 h之后，加入33 mL甲酸，得到吉姆薩母液，棕色試劑瓶中備用。用時(shí)將吉姆薩與PBS液按照1∶9比例混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

表1中草藥中文名及拉丁文名

中草藥學(xué)名苦參Sophora flavescens Ait茵陳Artemisiae Scopariae Herba杜仲Eucommia ulmoides Olive淫羊藿E.brevicornum Maxim茯苓Poria cocos（ Schw.） Wolf紫草Arnebia euchroma（Royle） Johnst甘草Radix ghycyrrhizae生地Rehmannia glutinosa Libosch1.2.20.2%臺(tái)盼藍(lán)0.2 g臺(tái)盼藍(lán)溶于100 mL超純水中，磁力攪拌過(guò)夜，用特曼紙過(guò)濾之后4 ℃保存，使用前加4倍生理鹽水稀釋。

1.2.390%細(xì)胞分離儲(chǔ)存液90 mL細(xì)胞分離液加入10 mL 1.5 M NaCl。

1.2.4肝素用PBS稀釋成3 000 U/mL，045 μm無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾，在4 ℃下保存。

1.2.5PBS分別按順序稀釋Na2HPO4 1.07 g，KH2PO4 0.39 g，NaCl 8.5 g，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，用1 000 mL容量瓶進(jìn)行定容，高壓滅菌，在4 ℃下保存。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1中草藥水提液樣品制備的處理將8種中草藥用天平稱取各10 g，置于烘箱中50 ℃烘烤 24 h，用中草藥粉碎機(jī)粉碎，接著過(guò)目篩，裝入自封袋中（保證藥物不能漏出自封袋），置于室溫干燥保存。將制得的中藥分別加入500 mL燒杯中，加入300 mL蒸餾水，浸泡30 min，開(kāi)大火煎煮30 min之后，另外加入200 mL蒸餾水，小火煎煮60 min，倒出藥液，加入100 mL蒸餾水對(duì)藥渣繼續(xù)煎煮30 min，倒出藥液混合第一次倒出的藥液。濃縮至20 mL，保證原藥為0.5 g/mL。將濃縮之后的藥液進(jìn)行離心處理，轉(zhuǎn)速為8 500 r/min，離心30 min，取上層清液，過(guò)0.45 μm無(wú)菌過(guò)濾膜，制成0.5 g/mL的中草藥提取液樣品。

1.3.2雜交鱘血液樣品的的制備取雜交鱘魚(yú)1條，用丁香酚（1 L水體中加入0.05 mL的丁香酚）進(jìn)行麻醉處理， 用含有0.3 mL肝素（濃度：1 500 U肝素溶于1 mL PBS中）的10 mL—次性注射器取血。將所有血液混合，加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)基（L-15）。另取10 mL離心管，加入1.5 mL密度梯度分離液，沿管壁緩慢加入3 mL稀釋后的血液，室溫800 g離心20 min；取中間白細(xì)胞層于新離心管，加1 mL L-15IV輕輕混合均勻；取20 μL細(xì)胞，加入等體積的0.2%臺(tái)盼藍(lán)（W/V，使用前與4.25%NaCl按4∶1混合），顯微鏡下數(shù)數(shù)得到細(xì)胞懸液初始濃度；用 L-15IV將其稀釋成2×107 cell/mL作氧負(fù)離子檢測(cè)、5×106 cell/mL作吞噬活性檢測(cè)。

1.3.3金黃色葡萄球菌懸液的制備金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的凍干粉購(gòu)于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，其培養(yǎng)基的各組分如表2所示。

表2金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基成分名稱 含量 牛肉膏3～5 g 蛋白胨10 g NaCl5 g 瓊脂20%～25%培養(yǎng)基按照上述成分制備，高壓滅菌之后，倒平板，冷卻至室溫。

（1） 操作準(zhǔn)備：凍干管的頂部為熔封處，管身貼有標(biāo)簽，底部為凍干菌粉。打管前應(yīng)于4 ℃保存，使用時(shí)去除標(biāo)簽，用75%酒精擦拭管壁，移入安全柜操作。

（2） 打管：用75%酒精擦拭，將凍干管頂部置于火焰灼燒。后迅速滴加無(wú)菌水使得管壁破損，用鑷子輕輕敲去碎玻璃即可。

（3） 將0.3 mL左右無(wú)菌水或培養(yǎng)基注入凍干管中，吹打，充分溶解成菌懸液。吸取菌懸液，打入1～2個(gè)試管或平板，或50 mL液體培養(yǎng)基中，在菌種說(shuō)明書(shū)中規(guī)定條件下培養(yǎng)。

（4） 培養(yǎng)成功后根據(jù)需要直接使用或接種10%接種量液體培養(yǎng)。

（5） LB培養(yǎng)基配制：950 mL去離子H2O加蛋白胨10 kg、酵母提取物5 g、NaCL 10 g定容至1 000 mL，再加瓊脂15 g/L，最后高溫高壓滅菌。

（6） 將金黃色葡萄球菌接種于淡水魚(yú)類(lèi)瓊脂培養(yǎng)基（FWA）斜面上，28 ℃下培養(yǎng)24～48 h。

（7） 用無(wú)菌生理鹽水（0.65%，W/W）洗下菌落，并稀釋成一定濃度。

（8） 加入終濃度為1%的福爾馬林，28 ℃滅活24 h，用無(wú)菌生理鹽水清洗3次，調(diào)整細(xì)菌濃度到1×108個(gè)/mL，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.4氧呼吸爆發(fā)活性檢測(cè)氧呼吸爆發(fā)活性使用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，操作過(guò)程見(jiàn)表3。

計(jì)算公式為：

抗超氧陰離子活力單位（U/L）=對(duì)照OD值-測(cè)定OD值對(duì)照OD值-標(biāo)準(zhǔn)OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.15 mg/mL）×1 000 mL×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)

數(shù)據(jù)的處理和分析，采用Excel和OriginPro5.0軟件對(duì)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析。

1.3.4白細(xì)胞吞噬活性的檢測(cè)

根據(jù)孫曉飛等[17]等的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)操作，操作步驟如下：

從鱘魚(yú)鰓動(dòng)脈采血1 mL，置于含0.5 mL肝素溶液（2%，W/V）的試管中混勻，加入約0.5 mL的金黃色葡萄球菌懸液，充分混勻后于25 ℃下水浴60 min。水浴期間每隔10 min搖勻1次。取上述混合液涂片，每個(gè)血樣涂2片。晾干后滴加甲醇固定5～7 min，蒸餾水沖洗，Giemsa染色1～1.5 h，自來(lái)水沖洗后再用蒸餾水沖洗，晾干。試驗(yàn)重復(fù)2次。吞噬活性以吞噬百分比（PP）和吞噬指數(shù)（PI）表示，分別計(jì)算吞噬百分比和吞噬指數(shù)，計(jì)算公式如下：

吞噬百分比（PP）=100個(gè)吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100×100%

吞噬指數(shù)（PI）=吞噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)/參與吞噬的吞噬細(xì)胞數(shù)

2結(jié)果

2.1中草藥對(duì)雜交鱘魚(yú)氧呼吸爆發(fā)活性的影響

通過(guò)采用雜交鱘的離體外周血和中草藥的水提液進(jìn)行共同孵育后，運(yùn)用抗超氧陰離子試劑盒測(cè)定其抗超氧陰離子，根據(jù)分光度的值可判斷中草藥對(duì)雜交鱘外周血白細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性的影響。根據(jù)“檢測(cè)抗超氧陰離子自由基或產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒”的檢測(cè)原理吸光度大的產(chǎn)生抗超氧陰離子，抗超氧陰離子單位的值就越小。由圖1可知，本次實(shí)驗(yàn)所采用的苦參、茵陳、杜仲、淫羊藿、茯苓、紫草、甘草。生地等八種中草藥中，只有生地的抗超氧陰離子單位的OD值比未添加中草藥的對(duì)照組低；其余七種中草藥均比未添加中草藥的對(duì)照組高。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1所示。

2.2中草藥對(duì)雜交鱘魚(yú)吞噬活性的影響

通過(guò)采用白細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌具有吞噬能力的原理，進(jìn)行涂片、Giemsa染色等手段測(cè)定中草藥與雜交鱘外周血共同孵育后，外周血白細(xì)胞的吞噬活性。吞噬活性以吞噬百分比和吞噬指數(shù)共同決定，由圖2可知，所采用的8種中草藥與雜交鱘外周血共同孵育后所測(cè)的吞噬百分比只有茵陳、杜仲高于未添加中草藥的對(duì)照組，其他均低于對(duì)照組；而吞噬指數(shù)中，只有添加苦參、杜仲、茯苓、生地四種中草藥的組別高于未添加中草藥的對(duì)照組，其余四種中草藥添加的組別均低于未添加中草藥的對(duì)照組。吞噬百分比和吞噬指數(shù)的數(shù)據(jù)處理結(jié)果分別如圖2、圖3所示。

3分析與討論

關(guān)于用中草藥代替激素，合成藥物作為動(dòng)物的免疫增強(qiáng)劑，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和抗病的作用，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者進(jìn)行了研究，并得到了可實(shí)施性的研究結(jié)果。張耀武[3]在復(fù)方中草藥制劑濃度分別為0.5%、1.0%、2.0%礎(chǔ)飼料的中，持續(xù)投喂了60 d過(guò)后，根據(jù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)的黃顙魚(yú)的血清溶酶活性、生長(zhǎng)性能、血細(xì)胞的吞噬活性等指標(biāo)，比較中草藥制劑對(duì)黃顙魚(yú)非特異性免疫功能的影響。結(jié)果表明，濃度為0.5%的復(fù)方中草藥制劑對(duì)黃顙魚(yú)的生長(zhǎng)影響顯著；濃度為1.0%、2.0%的復(fù)方中草藥制劑對(duì)黃顙魚(yú)的溶酶菌活力和吞噬活性影響極顯著，對(duì)于血清溶酶活性、生長(zhǎng)性能、血細(xì)胞的吞噬活性實(shí)驗(yàn)組能顯著提高。張照紅[11]用三個(gè)不同劑量的黃芪等七味復(fù)方中草藥奧尼羅非魚(yú)進(jìn)行投喂，結(jié)果表明，投喂到45 d，60 d時(shí)，1.0%、1.5%的復(fù)方中草藥添加組可以顯著地提高奧尼羅非魚(yú)的絕對(duì)增重量；1.0%、1.5%的添加組隊(duì)奧尼羅非魚(yú)的脾臟指數(shù)程度最大；投喂到30 d時(shí)，1.0%、1.5%的添加組對(duì)血液中白細(xì)胞的吞噬百分率（PP）得到了顯著或者極顯著的提高；到45 d時(shí)，血液中白細(xì)胞吞噬指數(shù)（PI）得到了顯著提高；李華[8]等將牛膝、板藍(lán)根、甘草、陳皮、肉桂、麥芽、神曲 7 味中草藥按一定的比例混勻，以2%、4%、6%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加到基礎(chǔ)飼料中連續(xù)投喂大菱鲆，結(jié)果表明，4%的濃度組對(duì)大菱鲆的血清溶酶菌活力和抗菌活力有顯著升高（ P<0.05），4%的濃度組對(duì)魚(yú)血清補(bǔ)體C3含量有顯著升高（ P<0.05）。攻毒試驗(yàn)表明，4%濃度組的存活率最大，對(duì)提高大菱鲆的非特異性免疫力和抗病力效果最為顯著的是4%濃度組。盛竹梅[1]等用麻黃、苦參、黃芩、五倍子、紫蘇、石榴皮6余味中草藥制成復(fù)方制劑，按照0.5%、20%、4.0%的比例對(duì)鯽魚(yú)進(jìn)行注射式給藥，結(jié)果表明，濃度越大血清殺菌活性越高，4.0%濃度組的NBT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異顯著，鯽魚(yú)的非特異性免疫功能能被該復(fù)方中草藥制劑有效地提高。孫曉飛，郭偉良，謝珍玉等[17]用39中草藥對(duì)石斑魚(yú)采用離體外周血白細(xì)胞與中草藥提液共同孵育法，對(duì)棕點(diǎn)石斑魚(yú)進(jìn)行免疫增增強(qiáng)劑的快速篩選。結(jié)果表明，39種中草藥中有10種對(duì)棕點(diǎn)石斑魚(yú)白細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)性顯著提高15%，有3種草藥可以同時(shí)提高棕點(diǎn)石斑魚(yú)的氧呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性，分別為墨旱蓮、雞血藤、黃柏。