優(yōu)化微波和甘油聯(lián)合預處理稻草粉酶解工藝

(徐州生物工程職業(yè)技術學院，江蘇徐州，221006)

優(yōu)化微波和甘油聯(lián)合預處理稻草粉酶解工藝

丁梁斌

(徐州生物工程職業(yè)技術學院，江蘇徐州，221006)

目的：探討微波和甘油聯(lián)合預處理對稻草粉酶解效果的影響。方法：采用響應面法，以固液比、微波加熱時間、還原糖濃度為因素，考察對還原糖濃度的影響。結果：液固比為19.08∶1、微波處理時間為6.58min、微波功率為278.16W，此時還原糖濃度將為509.95μg/mL。結論：微波和甘油聯(lián)合預處理對稻草粉酶解效果較微波預處理和甘油預處理更為顯著。

聯(lián)合預處理 還原糖濃度 稻草粉 酶解

甘油與微波聯(lián)合預處理時在提供蒸汽壓力造成原材料中間結構爆破方面與蒸汽爆破法預處理相似，都是可產(chǎn)生蒸汽爆破。但甘油與水互溶后，則其沸點比純水更低，更容易產(chǎn)生蒸汽形成爆破，且處理條件溫和，對環(huán)境污染小。目前研究較少，這種方法為水稻秸稈預處理提出了一個新的方向，本文在微波預處理和甘油預處理的基礎上，對微波和甘油聯(lián)合預處理進行了研究，為稻草粉酶解工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗原料

水稻秸稈：水稻秸稈，取自徐州附近農(nóng)田，經(jīng)烘干后備用。纖維素酶：采用國藥集團化學試劑有限公司提供的1.5萬U/g綠色木霉產(chǎn)的高活性纖維素酶。

1.1.2 實驗試劑

(1) DNS溶液的制備

稱取6.3g DNS和263mL的2mol/L的NaOH溶液，加入500mL去離子水(含有182g酒石酸鉀鈉)溶液中，攪拌均勻，之后加入5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉，攪拌使其溶解，冷卻后加水定容至1000mL，低溫保存于棕色瓶中。

(2) pH值4.8緩沖溶液的制備

分別配制0.1mol/L的檸檬酸和檸檬酸鈉溶液，混合兩種溶液，以pH計校準，使其pH值為4.8。

(3)纖維素酶溶液的制備

精密稱取0.1g纖維素酶，以pH值4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液定容至50mL，于4℃條件下暫存。酶溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，一般不超過2h。

(4)葡萄糖標準溶液的制備

精密稱取干燥恒重的葡萄糖0.5g，經(jīng)少量水溶解后加3mL 12mol/L的濃硫酸，以去離子水定容至1000mL即為500μg/mL葡萄糖標準溶液。

1.1.3 實驗器材

萬用電爐(興化市騰廠電氣設備有限公司)，電子天平購(上海方瑞儀器廠)，分光光度計(廈門森態(tài)儀器儀表有限公司)，電熱恒溫鼓風干燥器(上海篤特DHG-9023A數(shù)顯電熱恒溫鼓風干燥箱)，微波爐(美的M1-L202B微波爐)，恒溫水浴搖床(星羅棋布公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 還原糖濃度的測定

1.2.1.1 葡萄糖標準曲線的繪制

取6支試管，按表1的順序加入各種試劑。加入純凈水振蕩后，在540nm下檢測，以1號管為空白管，記錄吸光度A為540nm。橫坐標為吸光度，縱坐標為葡萄糖濃度，所擬合的曲線R值為0.9948，擬合度良好。

表1 葡萄糖標準曲線的測定方法

1.2.1.2 還原糖濃度的測定步驟

從處理過的水稻秸稈粉樣品中，分別精密稱取(0.05±0.001)g，加入對應編號試管中，用移液管移取配制好的纖維素酶溶液2.5mL，再加入pH值4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液2.5mL，混合均勻。50℃下，將上述混合溶液150rpm振蕩進行催化反應1個小時后，置于沸水浴2min終止酶解反應，并過濾迅速進行還原糖濃度的測定[1]。用DNS法測定還原糖濃度(CRed)，并以此代表酶解效果。

1.2.1.3 還原糖濃度的測定方法

先將試管放入沸水浴中2min，目的是使酶失活，接著吸取0.5mL待測液加入試管中，加入DNS溶液0.5mL，于沸水中水浴5min后冷卻，再加入4mL蒸餾水，測定其吸光度，通過對照葡萄糖標準曲線，查出還原糖含量(μg)。

1.2.2 微波與甘油聯(lián)合預處理水稻秸稈的響應面分析實驗考察

1.2.2.1 液固比對微波與甘油聯(lián)合預處理效果的影響

向每個玻璃瓶中加入水稻秸稈粉1.0g，接著按照液固比和甘油質量分數(shù)的要求，向各玻璃瓶中加入一定量蒸餾水和甘油，使液固比為10:1、20:1、30:1、40:1和50:1，甘油質量分數(shù)為70%。用玻璃棒攪拌均勻后，封口靜置4d。在保鮮膜封口上打一個小眼，接著用微波爐在微波功率為320W時，加熱6min[2]。洗滌，過濾后，于65℃烘箱內(nèi)烘干至恒重。從5組不同液固比的甘油預處理的水稻秸稈粉中，分別精密稱取(0.05±0.001)g，測其對應的CRed。根據(jù)測得的數(shù)據(jù)繪制液固比對微波與甘油聯(lián)合預處理后還原糖濃度的影響曲線(見圖1)，橫坐標為液固比，縱坐標為還原糖濃度(μg/mL)。

圖1 不同液固比對應的還原糖濃度(微波與甘油聯(lián)合預處理)

從圖1可以看出液固比對微波與甘油聯(lián)合預處理后還原糖濃度的影響：在一定范圍內(nèi)，隨著液固比的增加，水稻秸稈粉酶解效果增加；當超過這個范圍后，隨著液固比的增加，水稻秸稈粉酶解效果降低，在本設計的實驗中液固比為20:1的效果較好。

1.2.2.2 微波功率對微波與甘油聯(lián)合預處理效果的影響

向每個玻璃瓶中加入水稻秸稈粉1.0g，接著按照液固比20:1和甘油質量分數(shù)70%的要求，向各玻璃瓶中加入一定量蒸餾水和甘油。用玻璃棒攪拌均勻后，封口靜置4d。在保鮮膜封口上打一個小眼，分別在微波功率為160W、320W、480W、640W和800W的條件下，加熱6min。洗滌，過濾后，于65℃烘箱內(nèi)烘干至恒重。從5組不同微波功率的微波與甘油聯(lián)合預處理的水稻秸稈粉中，分別精密稱取(0.05±0.001)g，測其對應的CRed。根據(jù)測得的數(shù)據(jù)繪制微波功率對微波與甘油聯(lián)合預處理后還原糖濃度的影響曲線(見圖2)。

圖2 不同微波功率對應的還原糖濃度(微波與甘油聯(lián)合預處理)

從圖2可以看出不同微波功率對微波與甘油聯(lián)合預處理后還原糖濃度的影響：在一定范圍內(nèi)，隨著微波功率的增加，水稻秸稈粉酶解效果增加；當超過這個范圍后，隨著微波功率的增加，水稻秸稈粉酶解效果降低。在本設計的實驗中，微波加熱時間為6min，其最佳微波功率為320W。

1.2.2.3 微波加熱時間對微波與甘油聯(lián)合預處理效果的影響

向每個玻璃瓶中加入水稻秸稈粉1.0g，接著按照液固比20:1和甘油質量分數(shù)70%的要求，向各玻璃瓶中加入一定量蒸餾水和甘油。用玻璃棒攪拌均勻后，封口靜置4d。在保鮮膜封口上打一個小眼，在微波功率為320W的條件下，分別加熱2min、4min、6min、8min、10min。洗滌，過濾后，于65℃烘箱內(nèi)烘干至恒重。從5組不同微波加熱時間的微波與甘油聯(lián)合預處理的水稻秸稈粉中，分別精密稱取(0.05±0.001)g，測其對應的CRed。根據(jù)測得的數(shù)據(jù)繪制微波加熱時間對微波與甘油聯(lián)合預處理后還原糖濃度的影響曲線(見圖3)。

圖3 微波加熱時間對應的還原糖濃度(微波與甘油聯(lián)合預處理)

從圖3可以看出不同微波加熱時間對微波與甘油聯(lián)合預處理后還原糖濃度的影響：在一定范圍內(nèi)，隨著微波加熱時間的增加，水稻秸稈粉酶解效果增加；當超過這個范圍后，隨著微波加熱時間的增加，水稻秸稈粉酶解效果呈下降趨勢。在本設計的實驗中，微波功率為320W，其微波最佳加熱時間為6min。

1.2.2.4 甘油質量分數(shù)對微波與甘油聯(lián)合預處理效果的影響

向每個玻璃瓶中加入水稻秸稈粉1.0g，接著按照液固比20:1和甘油質量分數(shù)的要求，向各玻璃瓶中加入一定量蒸餾水和甘油，使甘油質量分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%。用玻璃棒攪拌均勻后，封口靜置4d。在保鮮膜封口上打一個小眼，在微波功率為320W的條件下加熱6min。洗滌，過濾后，于65℃烘箱內(nèi)烘干至恒重。從5組不同甘油質量分數(shù)的微波與甘油聯(lián)合預處理的水稻秸稈粉中，分別精密稱取(0.05±0.001)g，測其對應的CRed。根據(jù)測得的數(shù)據(jù)繪制甘油質量分數(shù)對微波與甘油聯(lián)合預處理后還原糖濃度的影響曲線(見圖4)。

圖4 甘油質量分數(shù)對應的還原糖濃度(微波與甘油聯(lián)合預處理)

從圖4可以看出不同甘油質量分數(shù)對微波與甘油聯(lián)合預處理后還原糖濃度的影響：在一定范圍內(nèi)，隨著甘油質量分數(shù)的增加，還原糖濃度迅速增大；當超過這個范圍后，隨著甘油質量分數(shù)的增加，水稻秸稈粉酶解效果增加不明顯。這說明了甘油質量分數(shù)對甘油預處理后還原糖濃度有一定的影響，其有一個較為合適的甘油質量分數(shù)，在本設計的實驗中甘油質量分數(shù)為70%的效果就已經(jīng)較好。

2 微波與甘油聯(lián)合預處理水稻秸稈的響應面分析實驗

2.1 響應面試驗設計和實驗結果

在確定甘油質量分數(shù)和甘油預處理時間的條件下采用響應曲面法對液固比、微波功率、微波加熱時間三個因素進行優(yōu)化。按照表2列出了各自變量的實驗水平及其編碼，設計3因素3水平的響應面試驗[3](表3)。

表2 響應曲面法實驗設計中變量的水平和編碼

表3 微波與有機溶劑甘油聯(lián)合預處理水稻秸稈中部分因素響應面分析實驗

2.2 二次多元回歸模型分析

以Design—Expert8.0.5軟件處理，對上述數(shù)據(jù)(表3)進行二次多元回歸擬合，最后得到二次多次多元回歸方程如下：

Y(還原糖濃度(μg/ml))=506.99-9.57A+9.10B-9.55C+1.61AB-0.35AC-44.85BC-49.10A2-37.13B2-41.97C2

由分析結果(表4)的數(shù)據(jù)可知，模型的值為11.28，P<0.01，表現(xiàn)為極顯著，初步說明此模型可以進行預處理的預測和擬合[4]；失擬項為0.05378，表現(xiàn)為不顯著，說明失真情況不大；復相關系數(shù)R=0.9855，說明該方程擬合度良好[5]。試驗中的液固比、微波處理時間和微波功率大小的交互作用對還原糖濃度影響是顯著的。

表4 微波與甘油聯(lián)合預處理水稻秸稈的部分因素響應面分析實驗的分析

注：復相關系數(shù)R=0.9855；離散系數(shù)C.V.=4.23%；P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

利用Design—Expert8.0.5軟件對表4中的相關數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，最后可得到二次回歸方程的響應面[6](圖5、6、7)。從圖5、6、7中可以看出：液固比(X∶1)、微波加熱時間(min)、微波功率(W)3因素的交互作用對還原糖濃度(μg/ml)的影響非常顯著，當某一因素固定時，還原糖的濃度隨著另外兩個因素的增大而增加迅速，達到峰值后略有所降低。對3因素交互作用影響產(chǎn)還原糖濃度進行分析和評價，最佳的工藝參數(shù)確定為：液固比19.08∶1、微波處理時間為6.58min、微波功率為278.16W，此時還原糖濃度將為509.95μg/mL。

F值可以判斷各因素對水稻秸稈水解效果的影響程度，F(xiàn)值越大，表明其影響程度越大[7]。顯然，各因素對水稻秸稈水解效果的影響次序為：微波功率和微波加熱時間>液固比>微波功率>微波加熱時間。

響應面分析法關于液固比、微波功率、微波加熱時間的分析，有各因素對秸稈水解效果的影響分別是：微波功率和微波加熱時間>甘油質量分數(shù)>液固比>微波功率>微波加熱時間>甘油預處理時間?？紤]到效果和節(jié)約兩方面，認為液固比19.08∶1、微波加熱時間6.58min、微波功率278.16W，甘油質量分數(shù)70%，甘油預處理時間4d時，預處理效果較好，此時還原糖濃度為509.95μg/mL。

圖5 微波加熱時間和液固比對還原糖濃度的影響

圖6 微波功率和液固比對還原糖濃度的影響

圖7 微波功率和微波加熱時間對還原糖濃度的影響

3 結論

甘油中加少量的水處理水稻秸稈粉一定時間，再在微波中處理，其原理與蒸汽爆破類似，只是將水蒸汽變成了甘油溶液，這種方法其實就是結合法，它確實可以提高水稻秸稈酶解后產(chǎn)還原糖的濃度。它的具體原理可能是：當微波處理使水稻秸稈粉內(nèi)溫度超過200℃時，纖維素和木質素等各組分間連接的部分化學鍵如氫鍵、碳-碳共價鍵發(fā)生斷裂，纖維素和木質素間空隙增大，結果使纖維素與酶的接觸機會增大，所以較大地提高了水稻秸稈經(jīng)纖維素酶酶解后產(chǎn)生的還原糖濃度。與蒸汽爆破處理不同之處在于，本預處理方法基本上是在常壓下進行的，而且處理溫度較低。

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StudyonPretreatmentofStrawPowderprecessbyOptimizationofMicrowaveCombinedwithGlycerol

DingLiangbin

(XuzhouVocationgalCollegeofBioengineering,Xuzhou221006,JiangSu,China)

Objective: To investigate the effect of microwave pretreatment and glycerol solution effect on straw powder enzyme. Methods: The influence of the ratio of solid to liquid, the time of microwave heating and the concentration of reducing sugar on the concentration of reducing sugar was studied by Response Surface Methodology. Results: The liquid solid ratio is 19.08:1, the microwave treatment time is 6.58min, and the microwave power is 278.16W. At this time, the concentration of reducing sugar was 509.95 g/mL. Conclusion: The effects of microwave and glycerol pretreatment on the hydrolysis of rice straw powder were more significant than those of microwave pretreatment and glycerol pretreatment.

combined pretreatment; reducing sugar concentration; straw powder; enzymolysis