基于半胱胺修飾傳感器對(duì)五羥色胺的測(cè)定研究

宋澤萱，劉 肖，康維鈞，牛凌梅*

（河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北石家莊050017）

0 引言

5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine，5-HT)亦稱血清素(serotoin)，是色胺酸的代謝產(chǎn)物。色胺酸在組織中經(jīng)過(guò)色胺酸羥化酶和5-羥色胺酸脫羧酶的作用生成5-羥色胺，又經(jīng)單胺氧化酶作用生成5-羥色醛；進(jìn)一步氧化成5-羥吲哚乙酸[1]。5-羥色胺是人體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其參與睡眠、攝食、體溫、學(xué)習(xí)、記憶等多種生理過(guò)程。中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT含量異常與重性抑郁障礙和自殺行為有著極其重要的聯(lián)系，同時(shí)也可以影響血腦屏障通透性的改變[2]。

目前，測(cè)定5-HT含量的方法有很多，例如：免疫法[3-4]、熒光法[5]、高效液相色譜法[6-8]、電化學(xué)方法[9-11]等。免疫熒光法靈敏度較差，高效液相色譜法費(fèi)時(shí)繁瑣，多需要樣品前處理。而電化學(xué)方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)吸引了研究者很大興趣。迄今為止，已有很多用修飾電極測(cè)定5-HT的報(bào)道，例如：以聚酚紅花紅修飾電極[12]、碳納米管膜修飾玻碳電極[13]、 碳納米管插層石墨電極[14]、鐵酞菁配合物修飾碳糊電極[15]測(cè)定5-HT，但用半胱胺(CYS)修飾金電極的方法還未曾報(bào)道，5-HT反應(yīng)機(jī)理也未曾探究。該實(shí)驗(yàn)擬利用CYS修飾金電極，制備自組裝膜傳感器，并在此基礎(chǔ)上建立5-HT的定量檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與實(shí)驗(yàn)材料

CHI650D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；采用三電極系統(tǒng)：鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，CYS/Au電極為工作電極。掃描電鏡：日本日立公司S-4800型掃描電鏡，掃描電位0～3 kV。

半胱胺(0.01mol/L)購(gòu)于Sigma試劑公司，5-HT(0.001mol/L)購(gòu)于中國(guó)藥檢所，其余試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 半胱胺修飾電極的制備

分別用0.3，0.05μm三氧化鋁懸漿將裸金電極(直徑 2mm)打磨至鏡面，浸入在Piranha溶液中15min，再分別用無(wú)水乙醇和超純水各超聲5 min。清洗后的金電極置于0.1mol/L硫酸溶液中，在-0.2～1.6 V電位范圍內(nèi)掃描至穩(wěn)定[16-17]。將清洗好的電極浸入到0.01mol/LCYS溶液中6 h，取出反復(fù)用超純水沖洗以除去物理吸附的物質(zhì)，得到半胱胺修飾金電極(CYS/Au)。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電鏡對(duì)CYS/Au電極的表征

圖1 裸電極（A）和CYS修飾電極（B）的掃描電鏡圖Fig.1 Scan electron microphoto graph of bare(A)and CYSmodified electrode(B)

利用掃描電鏡對(duì)裸金電極和CYS/Au修飾電極的表面形貌進(jìn)行了探究。如圖1(A)所示，未修飾任何物質(zhì)時(shí)，裸金電極表面呈不規(guī)則、不平整、較粗糙的狀態(tài)，可見(jiàn)明顯溝壑。經(jīng)半胱胺修飾后，電極表面粗糙不規(guī)則的狀態(tài)大大改善，表面光滑平整，溝壑基本消失(如圖1(B)所示)，可推測(cè)半胱胺已經(jīng)修飾于金電極表面。

2.2 5-HT在半胱胺修飾金電極上的電化學(xué)響應(yīng)利用差分脈沖法研究了5-HT在裸金電極及

修飾電極上的電化學(xué)響應(yīng)（圖2）。在裸金電極表面，5-HT的氧化峰電流為3.195×10-7A。而在半胱胺修飾電極表面，5-HT氧化電流大大增加(6.686×10-7A)，峰電流增加了109%，而且氧化峰電位有了一定的降低。這可能是由于半胱胺修飾膜中的羧基與5-HT中的羥基形成了分子內(nèi)氫鍵，從而加速了電子的傳遞，提高了識(shí)別的靈敏度。可見(jiàn)，修飾電極對(duì)5-HT的氧化能夠起到明顯的電催化作用，靈敏度大大增加。

2.3 半胱胺修飾時(shí)間對(duì)5-HT測(cè)定的影響

利用差分脈沖伏安法研究了半胱胺修飾膜組裝時(shí)間對(duì)5-HT測(cè)定的影響。將處理好的電極分別組裝 4 h，5 h，6 h，12 h，20 h，30 h 進(jìn)行修飾，并測(cè)量5-HT電流峰值。如圖3所示，隨著半胱胺組裝時(shí)間的延長(zhǎng)，5-HT的響應(yīng)峰電流也隨之增大，這可能是由于隨著半胱胺組裝時(shí)間的延長(zhǎng)，其所吸附的量也隨之增加，對(duì)5-HT測(cè)定的催化能力也逐漸增加，因此電流逐漸增大。但當(dāng)時(shí)間超過(guò)6 h后，氧化電流增加趨于平緩，說(shuō)明電極表面吸附的半胱胺已趨于飽和。因此，選用6 h作為最佳組裝時(shí)間。

圖2 裸電極(b)和CYS/Au(a,c)電極在5-HT溶液中（b,c）和空白溶液（a）中差分脈沖曲線。 濃度：1.0×10-4 mol/L；緩沖溶液pH：7.0；掃描速度：0.1 V/sFig.2 Differential pulse voltammetry(DPV)curves at bare gold electrode(b)and CYS/Au electrode(a,c)in the presence(b,c)and absence(a)of1.0×10-4 mol/L 5-HT.pH of phosphate buffer:7.0;Scan rate:0.1 V/s

2.4 支持電解質(zhì)pH對(duì)5-HT測(cè)定的影響

圖3 半胱胺修飾時(shí)間對(duì)5-HT氧化峰電流的影響5-HT 濃度：1.0×10-4 mol/L ；緩沖溶液 pH：7.0；掃描速度：0.1 V/sFig.3 Effect of modification time of CYS on the anodic peak current of5-HT in phosphate buffer.5-HTconcentration:1.0×10-4 mol/L;pH of phosphate buffer:7.0;Scan rate:0.1 V/s

在不同pH值的磷酸緩沖溶液中用差分脈沖伏安法研究了支持電解質(zhì)對(duì)5-HT測(cè)定的影響。如圖4(A)所示，當(dāng)?shù)滓簆H值從4.5增至5.5時(shí)，峰電流也隨之增加，然而當(dāng)?shù)滓簆H值進(jìn)一步增加時(shí)，峰電流卻逐漸下降，因此試驗(yàn)選擇pH5.5的磷酸鹽緩沖溶液作為底液來(lái)檢測(cè)五羥色胺。如圖4(B)所示，在pH4.5～pH7.5范圍內(nèi)，隨著pH增加，5-HT的氧化峰電位逐漸減小且呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Ep=-0.062pH+0.77(r:0.9949)，斜率為62mV/pH，與能斯特方程理論值(59mV/pH)接近，這表明電子轉(zhuǎn)移數(shù)與質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)相等[18-20]。

圖4 （A）緩沖溶液pH對(duì)5-HT氧化峰電流的影響；（B）緩沖溶液pH對(duì)5-HT氧化電位的影響5-HT 濃度：1.0×10-4 mol/L；掃描速度：0.1V/sFig.4 (A)Effect of pH on the anodic peak current in phosphate buffer;(B)Effect of pH on the anodic peak potential in phosphate buffer.5-HT concentration:1.0×10-4 mol/L;Scan rate:0.1 V/s

2.5 掃描速率對(duì)電極響應(yīng)的影響

利用循環(huán)伏安法考察了掃描速率對(duì)5-HT在半胱胺修飾電極表面電化學(xué)響應(yīng)的影響。所有的峰電流均與掃描速率的平方根呈線性關(guān)系，線性回歸方程為ip=0.84v1/2+4.7(r:0.9957;ip:10-7A)表明電極反應(yīng)是受擴(kuò)散控制的過(guò)程。5-HT在修飾電極上，峰電流隨掃描速度的變化如圖5。

2.6 分析應(yīng)用

圖5 掃描速度對(duì)5-HT氧化峰電流的影響。5-HT濃度：1.0×10-4 mol/L；緩沖溶液 pH：5.5Fig.5 Effect of the scan rate on the anodic peak current in phosphate buffer.5-HT concentration:1.0×10-4 mol/L;pH of phosphate buffer:5.5

利用差分脈沖法(DPV)研究了5-HT在半胱胺修飾電極上檢測(cè)的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)5-HT的氧化峰電流在5.0×10-7～7.0×10-5mol/L范圍內(nèi)均隨著其濃度的增加而線性增加，線性方程為ip=0.046 c+0.058(r:0.9966,c:10-6mol/L,ip:10-7A)，檢出限為 2.8×10-8mol/L。

2.7 CYS/Au電極的穩(wěn)定性

在1.0×10-5mol/L的5-HT溶液中考察了半胱胺修飾金電極的穩(wěn)定性。10次連續(xù)測(cè)定之后，5-HT的峰電流變化在5%以內(nèi)。將此修飾電極置于蒸餾水中40 d后，仍保留99.5%的電催化活性。以上結(jié)果均表明此修飾電極有著很好的穩(wěn)定性。

2.8 電化學(xué)參數(shù)計(jì)算及反應(yīng)機(jī)制研究

圖6 5-HT不同濃度的差分脈沖法曲線圖。緩沖溶液pH：5.5；掃描速度：0.1V/sFig.6 DPV curves of the various concentration of5-HT.pH of phosphate buffer:5.5;Scan rate:0.1 V/s

為了進(jìn)一步探討5-HT在CYS/Au電極上的反應(yīng)過(guò)程，對(duì)5-HT反應(yīng)的電化學(xué)參數(shù)進(jìn)行了計(jì)算。根據(jù)公式[21-22]，計(jì)算了5-HT的擴(kuò)散系數(shù)(D)，

A表示修飾電極的表面積 (d=2mm)，n表示電子轉(zhuǎn)移數(shù)，此處n=2[23]，D表示擴(kuò)散系數(shù)，c表示5-HT溶液濃度(1.0×10-4mol/L)。由此，計(jì)算得出5-HT的擴(kuò)散系數(shù)D為1.2×10-9cm2/s。

根據(jù)Ep-pH呈線性關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，5-HT的氧化過(guò)程可推測(cè)為失去兩個(gè)電子且同時(shí)伴隨著兩個(gè)質(zhì)子的轉(zhuǎn)移，反應(yīng)機(jī)理方程式可表示為

2.9 干擾物質(zhì)的測(cè)定

研究了各種干擾物對(duì)5-HT測(cè)定的影響。在相對(duì)誤差 5%限度之內(nèi)，500 倍的 Na+、Ca2+、K+、Mg2+、SO42+、Cl-，100 倍的谷氨酸、甘氨酸，等倍的腎上腺素，對(duì)于測(cè)定不產(chǎn)生干擾，說(shuō)明此電極有很好的選擇性。

2.10 樣品測(cè)定

取3.00mL人體血清加入等體積的甲醇離心沉淀，取出4.00mL上清加入等體積的PBS(pH=5.5)混勻，利用DPV方法進(jìn)行樣品測(cè)定。由于5-HT在人體血清中含量極低，故采用加標(biāo)回收方法驗(yàn)證此修飾電極的穩(wěn)定性。測(cè)得結(jié)果如表1所示。

表1 血樣中5-HT的測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results for the determination of5-HT in serum samples

3 結(jié)論

制備了半胱胺修飾的金電極，并用差分脈沖伏安法研究了5-HT在此修飾電極上的電化學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明半胱胺修飾金電極與裸金電極相比，對(duì)5-HT的氧化起到明顯的電催化作用，測(cè)定的靈敏度大大提高，且穩(wěn)定性良好。在此基礎(chǔ)上考察了測(cè)定5-HT的優(yōu)化條件以及線性范圍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-HT的氧化峰電流與其濃度在5.0×10-7～7.0×10-5mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限達(dá)到2.8×10-8mol/L，準(zhǔn)確度高，可廣泛應(yīng)用于樣品測(cè)定。

[1]周翔,辛中國(guó),孫國(guó)光.血清5-羥色胺的測(cè)定及其意義[J].白求思醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1984,10(1):1-5.

[2]張遠(yuǎn)冬,張有金,郭延壘,等.HPLC-UV法測(cè)定大鼠腦組織中5-羥色胺含量[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2012,6(21):14-16.

[3]黃建國(guó),陸世華,王曉春.酶免試驗(yàn)法測(cè)定全血5-羥色胺[J].臨夏醫(yī)學(xué)雜志,2002，24(9):545-546.

[4]李建剛,張巧俊,高敬龍,等.腦卒中后抑郁患者5-羥色胺含量的研究[J].中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)，2007,15(2):129-132.

[5]張秀明,顧仁俊,張中興,等.熒光分光光度法測(cè)定血清5-羥色胺的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用[J].陜西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),2009,9(1):14-16.

[6]魯燕俠,崔佳藺,興謠,等.RP-HPLC-熒光檢測(cè)法測(cè)定小鼠腦組織5種神經(jīng)遞質(zhì)的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2003,19(4):262.

[7]Mu S,LiY,Tang AG,etal.Simultaneous determination of tyrosine,tryptophan and 5-hydroxytryptamine in serum of MDD patients by high performance liquid chromatography with fluorescence detection[J].Clin.Chim.Acta,2012,413(11-12):973-977.

[8]Zhen QN,Xu B,Ma L,etal.Simultaneous determination of tryptophan,kynurenine and 5-hydroxytryptamine by HPLC:Application in uremic patients undergoing hemodialysis[J].Clin.Biochem.,2011,44(2-3):226-230.

[9]馮德香,黃蕾,張少君.鉑納米/碳納米管電化學(xué)方法研究及血樣中Sal和5－HT的測(cè)定[J].藥物分析雜志,2013,33(12):2051-2055.

[10]Hu L,Wang Q,Qin Z,et al.Detection of 5-hydroxytryptamine (5-HT)in vitro using a hippocampal neuronal network-based biosensor with extracellular potential analysis of neurons[J].Biosens.Bioelectron., 2015,66:572-578.

[11]Yang J,Yang X L.Electrochemical determination of 5-hydroxytryptamine using mesoporous SiO2modified carbon paste electrode[J].Russ.J.Electrochem.,2009,45(12):1346-1350.

[12]Selvaraju T,Ramaraj R.Simultaneous determination of ascorbic acid, dopamine and serotonin at poly(phenosafranine)modified electrode[J].Electrochem.Commun.,2003,5(8):667-672.

[13]Bruno C J,Rasa P,Mariana E G,et al.Direct electron transfer of glucose oxidase at glassy carbon electrode modified with functionalized carbon nanotubes within a dihexadecyl phosphate film[J].Sens.Actuators B-Chem.,2011,158(1):411-417.

[14]Wang Z H,Liang Q L,Wang Y M,et al.Carbon nanotube-intercalated graphite electrodes for simultaneous determination of dopamine and serotonin in the presence of ascorbic acid[J].J Electroanal.Chem.,2003,540:129-134.

[15]Oni J,Nyokong T.Simultaneous voltammetric determination of dopamine and serotonin on carbon paste electrodes modified with iron(Ⅱ)phthalocyanine complexes[J].Anal.Chim.Acta,2001,434(1):9-21.

[16]Wang SF,Du D,Zou Q C.Electrochemical behavior of epinephrine at L-cysteine self-assembled monolayers modified gold electrode[J].Talanta,2002,57(4):687-692.

[17]Wang SF,Du D.Differential pulse voltammetry determination of ascorbic acid with ferrocene-L-cysteine self assembled supramolecular film modified electrode[J].Sens.Actuator B-Chem.,2004,97(2-3):373-378.

[18]Narayana,Madhusudana R,Gopal,et al.Electrocatalytic boost up of epinephrine and its simultaneous resolution in the presence of serotonin and folic acid atpoly(serine)/multi-walled carbon nanotubes composite modified electrode:A voltammetric study[J].Mat.Sci.Eng.CBio.,2015,56:57-65.

[19]Zheng L Z,Wu SG,Lin XQ,et al.Selective Determination of Uric Acid by Using aβ-Cyclodextrin Modified Electrode[J].Electroanal.,2001, 13(16):1351-1354.

[20]Khadijeh E,Hedayatollah G.Structural changes of glucose oxidase upon interaction with gold-coatedmagnetic nano-particles[J].Int.J.Biol.Macromol.,2012,51(5):998-1002.

[21]Niu LM,Luo H Q,LiN B.Electrochemical Behavior of Uric Acid at a Meso‐2,3‐Dimercaptosuccinic Acid Self‐Assembled Gold Electrode[J]. Instrum.Sci.Technol.,2007,35(1):59-73.

[22]Niu LM,Luo H Q,LiN B.Electrochemical Behavior of Epinephrine at a Penicillamine Self-Assembled Gold Electrode,and its Analytical Application[J].Microchim.Acta,2005,150(1):87-93.

[23]Chen G N,Zhao Z F,Wang X L,et al.Electrochemical behavior of tryptophan and its derivatives at a glassy carbon electrode modified with he min[J].Anal.Chim.Acta,2002,452(2):245-254.