β-環(huán)糊精與雙金屬石墨烯復合材料對酪氨酸對映體的電化學選擇性作用

馬 驕，陳奕環(huán)，楊成成，宋金奕，夏 巧，傅英姿

(西南大學化學化工學院，重慶400715)

0 引言

手性是自然界的一種普遍現象。構成生物體的基本物質，如核酸、蛋白質、脂肪、糖類等都是手性分子[1-2]。手性化合物與生命過程聯(lián)系緊密，不同構型的手性異構體在生物體內的藥理作用、生理活動、代謝過程等都有著明顯的差異，但由于手性對映異構體有著相似的物化性質，很難將其區(qū)分開，因此，發(fā)展簡單、快速、靈敏的手性識別方法至關重要[3-4]。酪氨酸(tyrosine,Tyr)作為一種非必需氨基酸，常被用作原料藥和食品添加劑，是酪氨酸酶單酚酶功能的催化底物，也是很多試劑藥物(比如抗生素、腎上腺素、多巴等)的合成前體。酪氨酸是最終形成優(yōu)黑素和褐黑素的主要原料，可減輕白癜風癥狀，且與美白化妝品的研發(fā)息息相關[5-6]。作為一種手性氨基酸，酪氨酸具有D/L兩種構型。L-Tyr在生命系統(tǒng)中有重要的作用，若缺乏L-Tyr可能會導致抑郁等心理疾病，但過量則會增加姐妹染色的交換幾率，從而致使遺傳性疾病的產生[7-8]。D-Tyr作為L-Tyr的對映異構體不天然存在，主要用于生化研究。手性氨基酸的研究有著重要的意義，現如今已經有許多方法對酪氨酸對映體進行檢測和手性識別，其中包括分子印跡[9]、質譜法[10]、熒光法[11]和電化學[12]等方法。而電化學手性傳感器具有準確度高、靈敏度高、選擇性好、操作便捷、價格低廉等優(yōu)點，已逐漸發(fā)展成一種重要的手性識別方法[13]。

還原氧化石墨烯(rGO)是一種是由碳原子以sp2雜化方式連接而成的二維材料，具有大的比表面、高的導電性及生產的成本低等優(yōu)點，在納米技術、傳感器、電催化等領域都有廣泛應用[13]。納米金屬合金具有獨特的電子結構和較大的比表面積，且在催化、生物傳感等領域表現出比單金屬納米材料更好的催化特性[14-15]。金鉑合金納米粒子(Au-PtNPs)呈現出良好的生物相容性和導電性并且具有較大的比表面積，作為電極修飾材料在電化學手性識別研究中有著好的應用前景[16]。環(huán)糊精(CD)具有外緣親水內部疏水結構，能與許多分子形成包合物，常被用作手性選擇劑[17]。 而β-環(huán)糊精(β-CD)作為環(huán)糊精的衍生物之一，具有外親水、內疏水的特殊性質，使其可通過范德華力、疏水作用、氫鍵等分子間作用力選擇性地與目標分子結合，形成穩(wěn)定的主客體包合物，因此它具有很好的分子識別性能[18]。

該實驗合成了金鉑納米合金與還原氧化石墨烯納米復合材料 (Au-PtNPs/rGO),并將其修飾于玻碳電極表面，隨后將手性選擇劑β-環(huán)糊精(β-CD)滴涂在上訴修飾電極表面，得到β-CD/Au-PtNPs/rGO修飾電極并研究了其對酪氨酸對映體的電化學作用。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

四水氯金酸，六水氯鉑酸及硼氫化鈉購買于Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,美國)，D/L-酪氨酸，氧化石墨烯和β-環(huán)糊精分別購自百靈威科技有限公司（中國，北京），納米先鋒試劑公司（中國，南京）和上海晶純生化科技股份有限公司（中國，上海）。工作緩沖溶液為0.1mol/L磷酸緩沖溶液（PBS，pH=7.4）制備的 5.0×10-3mol/L鐵氰化鉀溶液。其余化學試劑均為分析純，可直接使用無需進一步純化。所有實驗用水均為二次蒸餾水。

所有電化學測試都在CHI440A電化學工作站（上海辰華，中國）上進行，標準三電極體系中，鉑絲電極做為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，玻碳電極和修飾過的玻碳電極均為工作電極。掃描電子顯微鏡照片由掃描電子顯微鏡S-4800（SEM，日立，日本）測得。

1.2 制備Au-PtNPs/rGO復合材料

還原石墨烯和金鉑納米復合材料的制備參照文獻方法并有稍許變動[19]。具體操作如下：3 mg氧化石墨烯加入3mL水中，超聲0.5 h使其分散均勻，隨后將1mL六水氯鉑酸(1%)和1mL四水氯金酸(1%)加入到棕色的氧化石墨烯溶液中，在持續(xù)攪拌條件下，向上述混合溶液逐滴加入10mL新制備硼氫化鈉(0.48mol/L)溶液。室溫條件下，攪拌24 h。在反應過程中可觀察到溶液顏色由淺棕色漸變?yōu)楹谏砻餮趸┍怀晒€原。最后，反復多次離心分離所得溶液，并用二次蒸餾水洗滌晾干。所得產品標記為Au-PtNPs/rGO。

1.3 傳感界面的制備

裸玻碳電極（GCE,Φ=4mm）分別用1.0、0.3和0.05 nm的Al2O3拋光粉打磨拋光，并依次在乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗5min，除去Al2O3粉末。自然晾干后取10μLAu-PtNPs/rGO分散液滴涂到干凈的玻碳電極表面，室溫下晾干。隨后，取相同量的0.5mg/mLβ-CD滴涂于上述修飾電極上，于室溫下晾干，備用。進行測試時，修飾電極用二次蒸餾水沖洗以除去表面未作用的材料，于室溫下晾干使用。電極構建示意圖如圖1所示。

2 結果分析與討論

2.1 納米材料表征

圖1 傳感界面構建過程圖Fig.1 Procedures for the preparation ofβ-CD/Au-PtNPs/rGO nanohybrids and the sensing platform

GO及Au-PtNPs/rGO復合納米材料的表面形貌可由掃描電子顯微鏡技術(SEM)進行表征。圖2A為氧化石墨烯(GO)的SEM圖，從圖中可以看到GO表面有輕微起伏不平的皺紋，與已有文獻報道相符。將氯鉑酸、氯金酸和GO混合還原后(圖2B)，可發(fā)現在石墨烯片層上附著有大量的金鉑納米顆粒，且金鉑納米顆粒分散均勻。為進一步表征Au-PtNPs/rGO復合納米材料上附著的Au-Pt納米顆粒，實驗中應用了X-射線能譜 （EDX）對復合材料的金屬元素進行了分析(圖2C)，結果證實金、鉑兩種金屬元素的存在，從而表明了Au-PtNPs/rGO復合納米材料的成功合成。

圖2 (A)GO,(B)Au-PtNPs/rGO的SEM形貌;(C)Au-PtNPs/rGO的EDX圖像Fig.2 SEM images of(A)GO,(B)Au-PtNPs/rGO and(C)EDX image of Au-PtNPs/rGO

2.2 不同修飾界面的電化學響應

圖3 不同材料與工作溶液的電化學響應：(a)裸玻碳電極，(b)Au-PtNPs/rGO，(c)β-CD/Au-PtNPs/rGOFig.3 CVs of different electrodes:(a)bare glassy carbon electrode,(b)Au-PtNPs/rGO and(c)β-CD/Au-PtNPs/rGO

采用循環(huán)伏安技術(CV)研究了不同界面在5 mmol/L的鐵氰化鉀緩沖溶液(pH=7.4)中的電化學行為(掃速 0.1 V/s，范圍-0.2V 到 0.6V)，圖 3記錄了每步修飾過程的循環(huán)伏安曲線。從圖中可以看出裸玻碳電極呈現出一對對稱的氧化還原峰 (曲線a)，而Au-PtNPs/rGO修飾電極(曲線b)的峰電流比裸玻碳電極(曲線a)高，這是由于Au、Pt納米粒子和rGO具有良好的電子傳輸能力。由于β-CD阻礙電子傳遞，因此，β-CD/Au-PtNPs/rGO修飾電極(曲線c)的峰電流比Au-PtNPs/rGO修飾電極(曲線b)的低。這一結果也說明了修飾電極的成功構建。

2.3 傳感器界面對酪氨酸對映體的選擇性作用

應用差分脈沖伏安 (DPV)技術測試了5 mmol/L酪氨酸(溶于0.25mol/L硫酸)對映體與不同修飾電極作用時的電化學行為。如圖4所示，酪氨酸對映體在0.8～1.0 V電位范圍內出現了一個氧化峰。在裸GCE(圖4A)上，D-酪氨酸(曲線a)和L-酪氨酸(曲線b)的電流響應曲線幾乎重合，說明裸GCE不能有效區(qū)分酪氨酸對映體。在Au-PtNPs/rGO/GCE(圖 4B)上，D-酪氨酸和 L-酪氨酸的氧化峰出現不明顯的細微差異，但在Au-PtNPs/rGO/GCE上酪氨酸對映體的峰電流相對裸GCE有明顯升高，這是由于Au-PtNPs/rGO復合材料促進了電極表面的電子傳輸。在β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCE修飾電極上(圖4C)，氧化峰出現了明顯的電流差異，且電流差（ΔIp=IpL-Tyr-IpD-Tyr）為9.5μA。這表明β-CD在對酪氨酸對映體的選擇作用中起著重要作用，且Au-PtNPs/rGO起到了促進電子傳遞的作用，從而對酪氨酸對映體的選擇作用有信號放大的效果。并且從圖中可以看出， 相比于 D-Tyr，β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCE對L-Tyr的選擇作用更強。

圖4 手性傳感界面對5mmol/L(a)D-Tyr和(b)L-Tyr的DPV響應：(A)裸GCE，(B)Au-PtNPs/rGO/GCE，(C)β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCEFig.4 DPVsof5mmol/L(a)D-Tyrand(b)L-Tyron(A)bareGCE,((B)Au-PtNPs/rGO/GCE and(C)β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCE

可能的機理設想如下：酪氨酸對映體與β-CD作用時，其分子可能被包絡在β-CD的疏水腔內部[20]，由于Tyr對映體兩種構型的空間結構存在差異，致使它們與β-CD之間的作用力(如：范德華力、氫鍵等)不一樣，而L-Tyr可能跟β-CD的腔體大小更匹配，導致β-CD對L-Tyr具有更強的選擇作用。

2.4 線性

為了進一步研究電流響應與酪氨酸對映體濃度的關系，在最佳實驗條件下，進行了β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCE修飾電極與一系列濃度的酪氨酸對映體作用后的差分脈沖伏安測試。如圖5所示，在0.1 mmol/L至5.0mmol/L濃度范圍內，D-Tyr（曲線 a）和 L-Tyr（曲線 b）的電流響應值與其濃度呈現線性關系，且二者的線性方程分別為IpD-Tyr(μA)=(7.74±0.50)+(9.62±0.18)cD-Tyr(r2=0.9991)和 IpL-Tyr(μA)=(10.51± 1.11)+(10.91±0.39)cL-Tyr(r2=0.9946)。同時，在該濃度范圍內，LTyr的電流響應始終大于D-Tyr，由此說明該傳感器可以在0.1mmol/L至5.0mmol/L濃度范圍內用于酪氨酸對映異構體的識別和檢測。

圖5 β-CD/Au-PtNPs/rGO/GCE對不同濃度酪氨酸對映體的DPV響應：(a)D-Tyr，(b)L-TyrFig.5 Calibration curves of the stereos elective sensor for Tyrenantiomers discrimination:(a)D-Tyr and(b)L-Tyr

3 結論

實驗將β-CD自組裝在Au-PtNPs/rGO復合材料修飾的玻碳電極表面，構建了一個簡單可靠的電化學傳感界面，并將其用于與D-Tyr與LTyr的手性識別研究。實驗中由于D-Tyr和L-Tyr的空間結構差異，導致其與β-CD的作用程度不同，因此在DPV中得到不同的峰電流，從而可以進行手性識別研究。該傳感器不僅能實現對酪氨酸對映體的選擇性識別，而且為其他手性氨基酸或手性小分子與β-CD的作用提供了一定的理論基礎，具有潛在的應用價值。

[1]Tang K,Gan H,Y Li,et al.Stereoselective interaction between DNA and chiral surfaces[J].J.Am.Chem.Soc.,2008,130:11284-11285.

[2]Maier NM,Franco P,Lindner W.Separation of enantiomers:needs,challenges,perspectives[J].Chromatogr.A.,2001,906:3-33.

[3]Zhang M,Ye B C.Colorimetric chiral recognition of enantiomers using the nucleotide-capped silver nanoparticles[J].Anal.Chem.,2011,83: 1504-1509.

[4]Liu C,LiB,Xu C.Colorimetric chiral discrimination and determination of enantiometric excess of D/L-tryptophan using silver nanoparticles[J].Microchim.Acta.,2014,181:1407-1413.

[5]Resnick S I,Hernandez L,Chen J,etal.Effect of the anorectic drug,phenyl propanolamine,on blood glucose in rats[J].Pharmacology,1978,17:157-162.

[6]Meyer JS,Welch K M A,Deshmukh V D,et al.Neurotransmitter Precursor Amino Acids in the Treatment of Multi‐Infarct Dementia and Alzheimer's Disease[J].J.Am.Geriatr.Soc.,1977,25:289-298.

[7]Gelenberg A J,Gibson C J,Wojcik JD.Neurotransmitter precursors for the treatment of depression[J].Psychopharmacol.Bull.,1982,18:7.

[8]LiC.Voltammetric determination of tyrosine based on an l-serine polymer film electrode[J].Colloids.Surf.B.,2006,50:147-151.

[9]Lin JM,Nakagama T,Wu X Z,et al.Capillary electrochromatographic separation ofamino acid enantiomers withmolecularly imprinted polymersas chiral recognition agents[J].Fresen.J.Anal.Chem.,1997,357:130-132.

[10]DiMarco T,Giulivi C.Current analytical methods for the detection of dityrosine,a biomarker of oxidative stress,in biological samples[J].Mass.Spectrum.Rev.,2007,26:108-120.

[11]Tsourkas A,Newton G,Perez JM,et al.Detection of peroxidase/H2O2-mediated oxidation with enhanced yellow fluorescentprotein[J].Anal.Chem.,2005,77:2862-2867.

[12]Ma Q,Ai S,Yin H,et al.Towards the conception of an amperometric sensor of l-tyrosine based on Hemin/PAMAM/MWCNT modified glassy carbon electrode[J].Electrochim.Acta.,2010,55:6687-6694.

[13]Zhou J,Chen Q,Wang Y,et al,Stereoselectivity of tyrosine enantiomers in electrochemical redox reactions on goldmatrices[J].Electrochim.Acta.,2012,59:45-48.

[14]Allen M J,Tung V C,Kaner R B.Honeycomb carbon:a review of graphene[J].Chem.Rev.,2009,110:132-145.[15]Mahshid SS,Mahshid S,Dolati A,et al.Template-based electrodeposition of Pt/Ninanowires and its catalytic activity towards glucose oxidation[J].Electrochim.Acta.,2011,58:551-555.

[16]Lee Y J,Park JY.A coral-likemacroporous gold-platinum hybrid 3D electrode for enzyme-free glucose detection[J].Sensor Actuat.B.Chem.,2011,155:134-139.

[17]Szente L,Szemán J.Cyclodextrins in analytical chemistry:Host–guest typemolecular recognition[J].Anal.Chem.,2013,85:8024-8030.

[18]Mura P.Analytical techniques for characterization of cyclodextrin complexes in aqueous solution:a review[J].J.Pharm.Biomed.Anal.,2014,101:238-250.

[19]Chen X M,Cai Z X,Huang Z Y,et al.Non-enzymatic oxalic acid sensor using platinum nanoparticles modified on graphene nanosheets[J]. Nanoscale,2013,5:5779-5783.

[20]Serno T,Carpenter JF,Randolph TW,etal.Inhibition of agitation-induced aggregation of an IgG-antibody by hydroxypropyl-β-cyclodextrin[J].J.Pharm.Sci-us.,2010,99:1193-1206.