雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在生物傳感探針設(shè)計(jì)方面的應(yīng)用

楊 嬋， 王瑞嘉， 何婧琳， 肖 慧， 鄧 偉， 向建南， 曹 忠

（1.長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，電力與交通材料保護(hù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，微納生物傳感與食品安全檢測(cè)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙410114）

(2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410082）

0 引言

生物傳感器是一種結(jié)合了生物敏感元件、物理化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器和電子信號(hào)處理器的新興儀器，其工作原理是將生物敏感元件在發(fā)生特異性反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的信號(hào)經(jīng)由物理化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化器，轉(zhuǎn)化為光、電、聲等易被檢測(cè)到的信號(hào)，最終通過換算等手段獲知待測(cè)物的有關(guān)信息[1]。近年來，生物傳感技術(shù)由于具有靈敏度高、選擇性好、成本低以及能夠進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，成為了一類新型的傳感技術(shù)。它在基因分析、遺傳疾病診斷、法醫(yī)鑒定和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力和廣闊的發(fā)展空間，因此成為科學(xué)研究者研究的重點(diǎn)。

提高生物傳感技術(shù)的靈敏度，關(guān)鍵依賴于信號(hào)的放大，而信號(hào)放大的方法普遍使用的是核酸擴(kuò)增技術(shù)，它是一種對(duì)特定序列DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)[2-3]。核酸擴(kuò)增技術(shù)根據(jù)擴(kuò)增是否經(jīng)過溫度變化主要分為兩類：一類是核酸變溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction,PCR）、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Ligase chain reaction,LCR）。雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Hybridization chain reaction,HCR）、滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Rolling circle amplification,RCA）、鏈替代等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Strand displacement amplification,SDA）等。但是，在恒溫條件下，不需要酶參與的擴(kuò)增技術(shù)只有HCR反應(yīng)。

PCR技術(shù)是一種在DNA聚合酶的輔助下，以母鏈DNA作為模板，將特定引物作為延伸起點(diǎn)，經(jīng)過高溫變性、低溫退火和恒溫延伸三個(gè)步驟的多次循環(huán)，復(fù)制出與母鏈DNA互補(bǔ)的子鏈DNA[4-8]的一種核酸擴(kuò)增手段。PCR技術(shù)擁有著高靈敏度、高特異性、對(duì)模板純度要求低以及重現(xiàn)性好等多方面的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、病原體定量檢測(cè)、疾病分類以及藥物療效考核等領(lǐng)域的研究。但是該擴(kuò)增技術(shù)也存在以下缺點(diǎn)，如：需要精密的儀器設(shè)備、易產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)[9]、不適用于基層及現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)等。

LCR是Barany[10]在1991年從水生棲熱菌中提取耐高溫的DNA連接酶，并利用該連接酶成功的擴(kuò)增了DNA時(shí)所發(fā)現(xiàn)的一種新型的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方式，Barany也正式將這種方法命名為連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。該方法的關(guān)鍵點(diǎn)是耐高溫的DNA連接酶對(duì)連接缺口具有高保真的要求，且連接酶在多次循環(huán)中始終能保持活性，提高了LCR的特異性。

相對(duì)于 PCR和 LCR反應(yīng)，RCA、SDA與HCR反應(yīng)在恒溫條件下就可以進(jìn)行核酸擴(kuò)增。RCA是Landegren[11]發(fā)明的一種基于模擬自然界微生物環(huán)狀DNA的滾環(huán)式擴(kuò)增機(jī)制而構(gòu)建的體外核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。它以環(huán)狀DNA做模板，在dNTPs存在的條件下，引物與模板雜交后通過DNA聚合酶使引物沿著環(huán)狀DNA模板進(jìn)行復(fù)制。因?yàn)镈NA聚合酶具有鏈置換效應(yīng)，因此新合成的鏈可以不斷延長(zhǎng)，最終得到一段具有重復(fù)序列單元的DNA長(zhǎng)鏈，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)放大的目標(biāo)。RCA包括線性RCA和指數(shù)RCA兩種形式，線性RCA是引物結(jié)合到環(huán)狀DNA上后，在具有鏈置換效應(yīng)的DNA聚合酶作用下被延伸，最終擴(kuò)增成為具有大量重復(fù)序列的線狀單鏈。而指數(shù)RCA相比較線性RCA而言，僅多采用了一條與環(huán)狀DNA序列完全一致的第二條引物，第二條引物可與第一次線性RCA的產(chǎn)物結(jié)合并酶促延伸，可在很短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。

RCA技術(shù)具有高靈敏度、強(qiáng)特異性、設(shè)備要求簡(jiǎn)單、高通量等一些列優(yōu)點(diǎn)，因而得到廣泛的應(yīng)用。目前主要用于痕量的分子檢測(cè)領(lǐng)域，主要有全基因組擴(kuò)增[12]、蛋白質(zhì)芯片分析[13]、單核苷酸多態(tài)性[14]、細(xì)胞原位檢測(cè)[15]等領(lǐng)域。但RCA也存在著瑣式探針長(zhǎng)度較長(zhǎng)（一般100 nt左右）、合成費(fèi)用高等缺點(diǎn)。

SDA技術(shù)最早由Walker等[16]提出。它是一種基于酶促反應(yīng)的體外核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其原理在于限制性內(nèi)切酶剪切DNA識(shí)別位點(diǎn)的能力及DNA聚合酶在切口處向3'端延伸并置換出下游序列，于恒溫條件謝愛實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。被置換的DNA單鏈與引物結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下延伸成雙鏈。該延伸過程不斷的重復(fù)，最終使得目標(biāo)DNA序列呈指數(shù)增長(zhǎng)。因SDA技術(shù)具有快速、高效、特異等優(yōu)點(diǎn)，因而受到廣泛關(guān)注并被不斷改良。

HCR反應(yīng)是由Pierce和Dirks在2004年提出的一種體外核酸等溫信號(hào)放大技術(shù)[17]，是一個(gè)沒有酶參與的過程。它的原理如圖1所示，HCR元件包括兩個(gè)部分：引發(fā)探針、兩條可雜交互補(bǔ)并帶有粘性末端的發(fā)夾型DNA（H1和H2）。當(dāng)不存在引發(fā)探針時(shí)，兩條發(fā)夾探針穩(wěn)定存在于溶液中。若存在引發(fā)探針時(shí)，引發(fā)探針觸發(fā)HCR反應(yīng)開始，發(fā)夾探針H1與H2相繼打開，形成具有多個(gè)重復(fù)單元的共聚物[18-19]，直到發(fā)夾探針H1與H2消耗完為止，以此來實(shí)現(xiàn)信號(hào)擴(kuò)增的目的。HCR的優(yōu)點(diǎn)在于不需要酶的輔助，避免了非特異性擴(kuò)增對(duì)分析結(jié)果的影響，反應(yīng)條件溫和、易控制，等溫條件下經(jīng)一步反應(yīng)就可以實(shí)現(xiàn)短鏈DNA的擴(kuò)增，并不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。HCR這一信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)與各類檢測(cè)技術(shù)(如：熒光法、比色法、電化學(xué)法等)都具有較高的兼容性，基于以上優(yōu)點(diǎn)，研究人員利用HCR反應(yīng)提高核酸、蛋白、小分子及重金屬等生物分子檢測(cè)的靈敏度。與其他核酸擴(kuò)增方法相比，HCR最大的優(yōu)勢(shì)是無酶參與，為研究者們的研究提供了很大的便利。

圖1 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理圖[17]Fig.1 Schematic illustration based on hybridization chain reaction[17]

1 HCR在分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)方面的應(yīng)用

分子信標(biāo)(Molecularbeacon，MB)是一種根據(jù)核酸堿基配對(duì)原則和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)現(xiàn)象來設(shè)計(jì)的發(fā)卡型寡核苷酸探針[20]。MB由莖區(qū)部分、環(huán)區(qū)部分、熒光供體基團(tuán)和猝滅受體基團(tuán)四部分構(gòu)成，環(huán)區(qū)部分一般有15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并與目標(biāo)序列互補(bǔ);莖區(qū)部分一般有5-7個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光供體基團(tuán)和猝滅受體基團(tuán)分別被標(biāo)記在探針的兩端。分子信標(biāo)的作用原理如圖2所示，MB的環(huán)狀部分由和目標(biāo)序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成，當(dāng)MB體系中未加入待檢測(cè)目標(biāo)序列時(shí)，MB的熒光供體基團(tuán)和猝滅受體基團(tuán)之間的距離很小，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，供體分子熒光被受體基團(tuán)猝滅。當(dāng)MB體系中加入待檢測(cè)的目標(biāo)序列時(shí)，由于堿基間的互補(bǔ)配對(duì)，使MB發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致供體基團(tuán)和受體基團(tuán)之間的距離變大，F(xiàn)RET被破壞，熒光顯現(xiàn)。MB法不僅操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)，而且還可以避免核酸交叉污染，同時(shí)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)。

圖2 分子信標(biāo)原理Fig.2 The principle of molecular beacon

2012年，譚蔚泓等[21]利用HCR放大技術(shù)與芘MB的核酸發(fā)夾探針結(jié)合，構(gòu)建一種靈敏檢測(cè)目標(biāo)DNA的熒光傳感器。原理如圖3所示，兩個(gè)發(fā)夾探針H1*與H2*用芘分子進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)目標(biāo)DNA不存在的時(shí)候，H1*與H2*呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定存在于體系中，而芘分子以單體形式存在，熒光較低。當(dāng)目標(biāo)DNA存在的時(shí)候，目標(biāo)DNA作為引發(fā)鏈，引發(fā)H1*、H2*與之雜交，發(fā)生HCR反應(yīng)，而芘分子以二聚體形式存在，致使熒光強(qiáng)度增加，根據(jù)前后熒光強(qiáng)度的變化來檢測(cè)目標(biāo)DNA。該實(shí)驗(yàn)可用于復(fù)雜生物中DNA的檢測(cè)。

圖3 基于HCR放大技術(shù)檢測(cè)DNA[21]Fig.3 Working principle behind the detection of DNA on the basis of HCR amplification[21]

2 HCR在G-quadrup lex探針設(shè)計(jì)方面的應(yīng)用

Gellert小組[22]在1962年首次報(bào)道了基于堿基G的G-四分體結(jié)構(gòu)（G-quartet）。富含堿基G的G-DNA序列通過對(duì)應(yīng)G堿基之間形成Hoogsteen氫鍵，使得4條或4段富含G堿基的DNA片段肩并肩的形成G-四分體，再通過縱向鳥嘌呤雜環(huán)之間的π-π作用形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)（G-quadruplex），這種結(jié)構(gòu)如圖4所示。在G-quadruplex的中軸方向有易極性中央孔道，可以螯合適當(dāng)體積的陽(yáng)離子[23]（如：K+、Li+、Na+），增強(qiáng)G-quadruplex的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖4 G-四分體的多種結(jié)構(gòu)[22]Fig.4 Conformations of several G-quartets[22]

2012年，Dong J等[24]利用結(jié)合 HCR與G-quadruplex構(gòu)建了一種免標(biāo)記檢測(cè)目標(biāo)DNA的熒光傳感器。實(shí)驗(yàn)原理如圖5A所示，目標(biāo)DNA不存在時(shí)，沒有引發(fā)鏈引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，熒光強(qiáng)度較低。目標(biāo)DNA存在時(shí)，目標(biāo)DNA作為引發(fā)鏈打開兩個(gè)發(fā)夾探針與其雜交，進(jìn)行雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成長(zhǎng)雙鏈，釋放出G-quadruplex結(jié)構(gòu)，加入鋅卟啉（ZnPPIX）后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。體系前后熒光強(qiáng)度的變化可以檢測(cè)目標(biāo)DNA。2015年，Alexander Trifonov等[25]利用 HCR反應(yīng)與 G-quadruplex結(jié)合，電化學(xué)檢測(cè)目標(biāo)DNA。實(shí)驗(yàn)原理如圖5B，該傳感系統(tǒng)把目標(biāo)DNA被固定在金電極上，作為引發(fā)劑與兩個(gè)發(fā)夾探針發(fā)生雜交反應(yīng)形成長(zhǎng)雙鏈，完成雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，釋放出更多的 G-quadruplex。 加入血紅素（hemin）后，導(dǎo)致hemin/G-quadruplex電催化H2O2還原成H2O，使電化學(xué)信號(hào)擴(kuò)增,達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)DNA的目的。

圖5 HCR擴(kuò)增（A）熒光（B）電化學(xué)檢測(cè)DNA序列的原理圖[24-25]Fig.5 Schematic illustration of the HCR based fluorometric(A)or electrochemical(B)sensors for DNA sequences detection[24-25]

3 HCR在DNAzyme探針設(shè)計(jì)方面的應(yīng)用

1994年，Breaker和Joyce[26]利用催化洗脫和體外篩選相結(jié)合的方法，從隨機(jī)單鏈DNA分子文庫(kù)中，發(fā)現(xiàn)了不僅能夠特異性結(jié)合且切割RNA底物，而且具備催化活性的DNA分子，稱之為脫氧核酶（DNAzymes）。與蛋白質(zhì)酶相比，DNAzymes更易合成、抗水解、熱穩(wěn)定好。根據(jù)其催化作用的不同，DNAzymes可以分為五大類：起連接作用的DNAzymes[27]、切斷 DNA 的 DNAzymes[28]、切斷RNA的DNAzymes[29]、催化卟啉環(huán)金屬螯合反應(yīng)的DNAzymes[30]、具有激酶活性的 DNAzymes[31]。其中，應(yīng)用最多的是切斷RNA的DNAzymes，它不僅可以催化RNA特定部位的切割，而且還可以從mRNA水平來對(duì)基因進(jìn)行滅活，進(jìn)行調(diào)控蛋白的表達(dá)。將HCR與DNAzyme結(jié)合，使傳感平臺(tái)更上一個(gè)臺(tái)階。2013年，Zhuang等[32]以DNAzyme作為識(shí)別分子，與HCR反應(yīng)結(jié)合，用電化學(xué)的方法靈敏檢測(cè)Pb2+。原理如圖6(A)所示，將Pb DNAzyme固定在磁珠上，當(dāng)Pb2+存在時(shí)，Pb2+誘導(dǎo)DNAzyme切割其底物，釋放的底物使兩條標(biāo)記了二茂鐵的發(fā)夾探針H1、H2聚合雜交在磁珠表面，引發(fā)磁珠表面的HCR反應(yīng)，致使電化學(xué)信號(hào)放大。當(dāng)Pb2+不存在時(shí)，DNAzyme穩(wěn)定存在于體系中，不能釋放出引物誘導(dǎo)HCR反應(yīng)，則沒有電化學(xué)信號(hào)產(chǎn)生。根據(jù)目標(biāo)物是否存在時(shí)電化學(xué)信號(hào)的變化來檢測(cè)Pb2+。2015年，Lina Freage等[33]將Pb DNAzyme作為識(shí)別分子，Mg DNAzyme作為報(bào)告基團(tuán)，與HCR反應(yīng)結(jié)合靈敏檢測(cè)Pb2+。原理如圖6(B)所示，將Pb DNAzyme固定在電極上，當(dāng)Pb2+存在時(shí)，致使底物被DNAzyme切割，釋放出的產(chǎn)物打開發(fā)夾探針，形成聚Mg DNAzyme的長(zhǎng)鏈，在Mg2+的作用下切割分子信標(biāo)底物，致使熒光放大。當(dāng)Pb2+不存在時(shí)，底物鏈不能被DNAzyme切割，則不能釋放HCR反應(yīng)的引物，不能形成聚Mg DNAzyme的長(zhǎng)鏈，無熒光產(chǎn)生。在有無目標(biāo)物存在時(shí)熒光強(qiáng)度前后的變化達(dá)到檢測(cè)Pb2+的目的。

圖6 基于HCR和DNAzyme的電化學(xué)（A）或熒光（B）分析方法檢測(cè)Pb2+[32-33]Fig.6 Fluorescence response of electrochemical(A)or fluorescent(B)analysis detection ofPb2+based on HCR reaction and DNA zymes[32-33]

4 HCR在核酸適配體（Aptamer）探針設(shè)計(jì)方面的應(yīng)用

核酸適配體（Aptamer）是一種經(jīng)由體外指數(shù)級(jí)富集系統(tǒng)進(jìn)化 （Systematic Evolution of Ligands by EX ponential Enrichment,SELEX）技術(shù)篩選所得的隨機(jī)寡核苷酸片段，可以是DNA或者RNA,且該寡核苷酸片段對(duì)特定目標(biāo)物質(zhì)具有特異性結(jié)合的能力[34]，結(jié)合的物質(zhì)小至離子、分子，大至細(xì)菌、細(xì)胞。Aptamer不僅類似于其他分子識(shí)別物質(zhì)對(duì)目標(biāo)物特異性結(jié)合，同時(shí)還具有許多其他的獨(dú)特的特點(diǎn)，如：（1）分子量較小，與目標(biāo)物結(jié)合的空間位阻小，利于構(gòu)建高表面密度的傳感平臺(tái)。（2）目標(biāo)物質(zhì)廣泛，由于SELEX技術(shù)的存在，篩選出的能識(shí)別的目標(biāo)物包括了金屬離子、氨基酸、細(xì)菌、蛋白質(zhì)、抗生素等領(lǐng)域。（3）核酸適配體容易合成、修飾，SELEX技術(shù)篩選的核酸適配體一般只需要2-3個(gè)月就可以被篩選出來，最快的2～3周就可以完成篩選。（4）化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等?；谶@些特點(diǎn)，使Aptamer在生物方面、化學(xué)方面、醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面都有巨大的應(yīng)用前景。

Aptamer與靶向分子結(jié)合時(shí)，通過核酸鏈內(nèi)某些堿基之間的互補(bǔ)配對(duì)、氫鍵以及靜電等作用，導(dǎo)致單鏈核酸的結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象發(fā)生變化，形成一些穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，比如：發(fā)卡結(jié)構(gòu)、假結(jié)結(jié)構(gòu)、莖-環(huán)結(jié)構(gòu)等。目前，基于Aptamer的生物傳感器方法有很多，其中光學(xué)Aptamer傳感器、電化學(xué)Aptamer傳感器、比色法Aptamer傳感器備受研究人員的關(guān)注。

光學(xué)Aptamer傳感器是一類檢測(cè)Aptamer與靶物質(zhì)作用時(shí)引起光學(xué)信號(hào)變化的傳感器。根據(jù)其原理不同分為熒光、化學(xué)發(fā)光、磷光等，應(yīng)用范圍很廣泛。根據(jù)熒光檢測(cè)的原理，目前主要有兩種方法檢測(cè)目標(biāo)物[35]，一種是用Aptamer先和一個(gè)在鏈中間標(biāo)記了熒光基團(tuán)的核酸鏈雜交，利用堿基自身的淬滅作用，熒光淬滅，當(dāng)Aptamer與目標(biāo)物結(jié)合后，被標(biāo)記了熒光基團(tuán)的核酸鏈被置換，從而發(fā)出熒光。另一種方法是將與Aptamer雜交的核酸鏈在兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，且兩端均有一定長(zhǎng)度的堿基互補(bǔ)，當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，核酸鏈被置換下來，互補(bǔ)端結(jié)合成雙鏈，熒光淬滅。由于光學(xué)染料很容易獲得，信號(hào)大部分是在均相中檢測(cè)，靈敏度高，檢測(cè)下限低，光化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，但是它的不足之處依然存在，如熒光技術(shù)就存在背景信號(hào)高、熒光壽命短、容易發(fā)生光漂白和易受干擾等。

電化學(xué)Aptamer傳感器根據(jù)測(cè)量信號(hào)產(chǎn)生原理的不同，可以分為電壓型、電流型和阻抗型Aptamer傳感器。在這些傳感器當(dāng)中，由于電流型Aptamer傳感器檢測(cè)的電信號(hào)靈敏，且容易獲得，所以是研究領(lǐng)域中較活潑的。根據(jù)不同的設(shè)計(jì)方向，電流型適配體傳感器目前主要常用的有適配體信標(biāo)法 (Aptamer beacon)和夾心法。其中，Aptamerbeacon的主要原理是通過吸附、化學(xué)修飾、或生物親和等方法在寡核普酸鏈或配體上修飾一些電化學(xué)活性物質(zhì)或催化活性的無機(jī)或生物分子,如二茂鐵、中性紅、辣根過氧化酶等，通過這些物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，然后再通過檢測(cè)修飾物本身或其催化底物的電信號(hào)來實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的檢測(cè)。Aptamer技術(shù)與其他一些放大技術(shù)相結(jié)合使用，可以顯著地提高檢測(cè)的靈敏度。夾心法是一種高靈敏度的電流型Aptamer傳感器，這個(gè)方法是采用抗體和Aptamer夾心，然后將堿性磷酸酯酶修飾到適配體上，再通過滾環(huán)擴(kuò)增放大電信號(hào)，低檢測(cè)極限地檢測(cè)了血小板生長(zhǎng)因子。當(dāng)沒有目標(biāo)物時(shí)，亞甲基蘭標(biāo)記的Aptamer處于打開狀態(tài)，電活性物質(zhì)遠(yuǎn)離電極表面，沒有電信號(hào)產(chǎn)生。而當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，Aptamer與目標(biāo)物結(jié)合，電活性物質(zhì)接觸電極表面，產(chǎn)生電信號(hào)。因此，基于阻抗變化的電化學(xué)適配體傳感器，同樣具有高靈敏度、無需標(biāo)記、簡(jiǎn)單、方便等優(yōu)點(diǎn)。

結(jié)合Aptamer傳感器和HCR的優(yōu)點(diǎn)，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了兩者結(jié)合的方法來檢測(cè)目標(biāo)物。2015年，Wang等[36]利用HCR與Aptamer結(jié)合構(gòu)建了一種熒光傳感器用于檢測(cè)血小板衍生生長(zhǎng)因子BB（PDGF-BB），原理如圖7所示，該傳感體系包括三個(gè)DNA探針：HP、H1和H2探針。而HP探針主要由三個(gè)部分組成，分別是PDGF-BB aptamer、延伸 DNA（E-DNA）、與 H1 探針的 5′互補(bǔ)配對(duì)的序列，在這之間有10個(gè)連續(xù)的腺嘌呤堿基，利于減少它與其他DNA分子之間的空間阻效應(yīng)[37]。當(dāng)PDGF-BB不存在時(shí)，HCR反應(yīng)不能被觸發(fā)，因此HP、H1、H2探針穩(wěn)定存在于溶液中，能夠被吸附在氧化石墨烯（GO）的表面，同時(shí)，SG也容易通過π-π鍵吸附在GO表面，致使發(fā)出微弱的熒光。當(dāng)PDGF-BB存在時(shí)，HP探針中的aptamer序列可以識(shí)別PDFG-BB形成PDGFBB-aptamer復(fù)合體，釋放出E-DNA與H1探針的末端進(jìn)行雜交，打開發(fā)夾探針，釋放出的H1探針的部分序列與探針H2的部分序列雜交，從而打開H2發(fā)夾探針。通過這種方式，形成一條長(zhǎng)雙鏈，雙鏈嵌入劑SG可以嵌入其中，加入GO后，由于雙鏈DNA的骨架可以有效屏蔽帶負(fù)電荷的磷酸鹽中的核堿基[38]， 導(dǎo)致GO不能吸附HCR產(chǎn)物，所以PDFG-BB的濃度能增強(qiáng)該傳感體系的熒光信號(hào)。

圖7 基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)熒光法檢測(cè)PDGF-BB的原理圖[36]Fig.7 Schematic illustration of the fluorescence assay for PDGF-BBbased on the target-triggered hybridization chain reaction amplification[36]

5 總結(jié)

綜上所述，HCR反應(yīng)在生物傳感探針設(shè)計(jì)方面的研究已經(jīng)有了很大的進(jìn)展?；贖CR的生物傳感器是一種無需酶參與的、在常溫下就可以進(jìn)行反應(yīng)的一種高靈敏、快速的生物傳感器，它可以與多種檢測(cè)技術(shù)結(jié)合來高靈敏檢測(cè)金屬離子、小分子、細(xì)胞等目標(biāo)物。目前，大部分傳感探針用于HCR反應(yīng)的研究備受研究者們的青睞。因此，開發(fā)基于HCR反應(yīng)能快速、靈敏檢測(cè)目標(biāo)物的生物傳感探針將成為重要的研究方向。

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