外界刺激下腫瘤細胞中早反應基因5相關生物學功能的研究進展

趙現(xiàn)哲丁立新劉曉丹周平坤姜曉燕 * 丁庫克*

( 1．中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所放射生態(tài)研究室，北京 　100088；2．軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 　100850 )

早反應基因5(immediate early response gene 5，IER5)是慢動力早期反應基因家族成員之一，由Williams等[1]發(fā)現(xiàn)并命名，且在眾多動物體內均發(fā)現(xiàn)該基因的表達，人的IER5基因位于1號染色體1q25.3處，cDNA全長2 369 bp。IER5基因作為慢動力早期反應基因家族中的一員，是一種富含脯氨酸且具有多個核酸位點的蛋白質，人IER5基因可編碼308個氨基酸，其蛋白分子相對質量約33.7 kD，為核內蛋白，在進化過程中具有高度保守性[1-2]。 2006年，周平坤等[3-5]為尋找輻射敏感基因，采用基因芯片技術篩選對輻射可誘導mRNA表達上調的基因，其中就有IER5。近年來的研究表明，IER5基因具有廣泛的生物學功能，其表達抑制可加速細胞周期進程，也可提高細胞的輻射抗性，它還可作為評估輻射劑量的標志物，在腫瘤的增殖和凋亡中扮演著重要角色[6-9]。 2011年，李莉等[10]利用RNA干擾技術成功構建了特異性抑制IER5基因的IER5-siRNA-HeLa細胞系，為研究IER5基因輻射誘導表達機制及揭示IER5生物學功能奠定了基礎。本文就近年來有關外界刺激下腫瘤細胞中IER5相關生物學功能的研究進展研究作一概述。

1　外界刺激時IER5的應激性反應

HeLa細胞在熱壓力作用下，IER5與熱休克因子(heat shock factor 1，HSF1)可發(fā)生相互作用。Ishikawa等[11]研究發(fā)現(xiàn)HeLa細胞在熱壓力作用下，IER5的表達量上調，導致細胞周期G2期阻滯，從而對熱壓力造成的DNA損傷進行修復，并對不能修復的細胞進行識別，誘導其凋亡。其中誘導IER5表達的是HSF1，HSF1在正常狀態(tài)下是以磷酸化狀態(tài)存在，而IER5啟動子區(qū)域包含有HSF1結合位點，即HSF1是通過誘導IER5的表達來對外界刺激作出反應。IER5與HSF1的去磷酸化有關，IER5通過與蛋白磷酸2A(protein phosphatese 2A，PP2A)及其副族調節(jié)蛋白共同作用來使HSF1去磷酸化[12]。去磷酸化的HSF1進入細胞核后可以激活HSF1的靶基因即熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)家族基因，其中包括HSP70基因，而這些靶基因的表達對細胞自我修復，細胞周期和排已等功能起著關鍵作用。在HSP70基因中含有熱休克元件(heat shock element，HSE)序列，而HSE序列正好是HSF1基因的識別序列，它可有效誘導HSF1的轉錄[13]。即在熱壓力條件下HSF1可以刺激IER5的轉錄，而IER5與PP2A及其副族調節(jié)蛋白共同作用可以使磷酸化的HSF1去磷酸化，去磷酸化的HSF1進入細胞核后又可以激活對細胞具有修復功能的HSP家族基因，而HSP家族基因中HSP70基因的HSE序列又可以誘導HSF1基因的轉錄，整個過程顯示IER5是HSF1的正反饋調節(jié)者，通過IER5的調節(jié)作用誘導HSP家族基因的表達，讓細胞從熱休克中有效恢復，對不能識別修復的即誘導其凋亡。而且在有無熱壓力的條件下均能刺激HSF1轉錄。這對HeLa細胞應對外界刺激迅速作出反應和損傷細胞進行及時修復具有重要意義[12-13]。

2　輻射條件下IER5的表達

輻射條件下，腫瘤細胞中IER5表達量升高，從而促進細胞凋亡。丁庫克等[15]通 過對HeLa細胞和AHH1細胞進行60Co γ射線照射后發(fā)現(xiàn)IER5表達量升高，并出現(xiàn)明顯的細胞凋亡現(xiàn)象，同時也發(fā)現(xiàn)AHH1細胞比HeLa細胞更敏感，更容易誘導IER5基因表達。之后丁庫克等[15]又進一步將人的4種腫瘤細胞(肝癌HepG2、乳腺癌MCF-3、肺癌A549、腦瘤BT125)接種到裸鼠皮下，待腫瘤塊生長至約1.00 cm×1.00 cm時，采用γ射線照射裸鼠，利用實時熒光定量PCR技術發(fā)現(xiàn)4種腫瘤細胞中IER5的mRNA均出現(xiàn)明顯升高，而且也發(fā)現(xiàn)肝癌、乳腺癌細胞比腦瘤、肺癌細胞對輻射更敏感[15]，這也為肝癌、乳腺癌的臨床放療方案優(yōu)化提供了理論依據(jù)。基于上面的研究，丁庫克等提出IER5基因有可能成為宮頸癌與肝癌新的輻射損傷生物標志物，對宮頸癌與肝癌放療具有潛在的應用價值。劉洋等[16]通過實驗也發(fā)現(xiàn)宮頸癌腫瘤組織中IER5的表達量和腫瘤大小有關，并且提出了IER5蛋白可以作為一種潛在的宮頸癌放療增敏劑，也可以作為一種預測宮頸癌細胞放射敏感性的生物標記物。

GC結合因子(GC binging factor，GCF)是順式調控元件，對IER5的表達起負性調控作用。史海敏等[17-18]通過基因轉染構建了GCF-shRNA-HeLa單克隆細胞系，發(fā)現(xiàn)受輻照的HeLa細胞中IER5蛋白表達量隨著輻照劑量的增加而增加，同時在照射后隨著輻照時間的延長其表達量出現(xiàn)先上升后下降。之所以出現(xiàn)這種趨勢，可能是隨著照射劑量增加，順式調控元件GCF對IER5的抑制作用不斷減弱，IER5的表達增多可進一步啟動細胞內的自我修復和識別機制，損傷較重的細胞不斷被誘導凋亡，從而IER5表達量減少，出現(xiàn)下降趨勢。這種劑量和時間效應關系對我們在腫瘤放療劑量的選擇以及輻射后施加一些放療藥物的時間選擇方面均有一定的指導作用，為IER5基因在臨床中的應用奠定了理論基礎，也有助于我們尋找對輻射敏感的生物標記物。在IER5的調控下，損傷較輕的細胞進行自我修復，而腫瘤細胞分裂較旺盛，對輻射敏感性強，因此在輻射誘導下自我修復能力較弱，出現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象。同時研究[18]也發(fā)現(xiàn)在宮頸癌放療后IER5的表達量與照射劑量有關，而與放療后臨床效果無關。Asano等[19]通過實驗也發(fā)現(xiàn)IER5可以被各種分裂素如血清等刺激誘導表達，我們也發(fā)現(xiàn)IER5在宮頸癌細胞中高表達，這些說明了各種不同的刺激和致癌基因信號都可以誘導IER5的表達。YANG等[8]通過轉染IER5質粒發(fā)現(xiàn)IER5過表達時可以抑制肝癌細胞增殖，且在放療和順鉑誘導下IER5表達量升高，細胞生存率下降。這說明IER5對腫瘤細胞的生長增殖具有重要意義，有望成為腫瘤靶向治療潛在的新靶點。

3　IER5基因與p53

p53基因屬于抑癌基因家族，與熱休克因子HSF1一樣，都可以調節(jié)壓力反應，幫助受壓迫的細胞修復。正常情況下，p53可以激活抑癌基因的表達，同時它的一些靶基因[20-22](如p21、cyclin、Gadd45、AEN等基因)具有調節(jié)細胞周期阻滯、DNA修復、細胞死亡、新陳代謝和體內平衡等作用，在壓力條件下這些靶基因可以通過清除一些不可修復的細胞，誘導其凋亡。但p53又是人體內突變頻率最高的基因，在p53基因發(fā)生突變的情況下，因不能有效誘導抑癌基因的表達，進而可能導致腫瘤形成，在壓力條件下，p53的生存反應可能會通過新陳代謝發(fā)生改變如營養(yǎng)剝奪，讓一些本該發(fā)生凋亡的細胞存活下來[19]。

Asano等[19]通過芯片技術對IER5啟動子序列進行分析，發(fā)現(xiàn)在其啟動子區(qū)域附近有兩個p53結合位點，將其命名為 RE1和RE2，分別位于IER5基因下游46 kb (RE1)和11 kb (RE2)的位置。他們通過實驗觀察到RE2是超強子結合位點[23]，p53通過與RE2或者RE1結合有助于運行軌跡上高階染色質結構的形成，而高階染色質結構形成時，RE2定位在IER5啟動子附近，對IER5啟動子基因起作用，因此認為p53是通過RE2作用于IER5，誘導IER5基因表達。該研究表明許多腫瘤細胞需要通過超強子去驅動關鍵致癌基因才能形成腫瘤[24]。因此把超強子和IER5基因的表達聯(lián)系起來，可以看出IER5基因很可能是腫瘤形成的一個重要基因，該研究也發(fā)現(xiàn)IER5在腫瘤細胞錨定增殖及非依賴性生長中也有重要的作用[19]。HSF1在腫瘤細胞的形成和增殖中也發(fā)揮著重要的作用，癌細胞中IER5被生長因子刺激后過表達，激活HSF1，HSF1又激活和腫瘤形成相關的基因(包括HSP家族基因)[11-13]。在此過程中HSF1會受到p53和IER5的調控。而IER5基因是p53的靶基因，而當p53功能缺失或突變如野生型p53形成時可能導致腫瘤的形成[19]，因此可以說他們都具有促進腫瘤形成的潛質。

4　IER5參與細胞周期調控

生物信息學分析顯示在IER5啟動子區(qū)域有3個順式調控元件，其中包括GC結合因子(GC binging factor，GCF)和核因子I(nuclear factor I，NFI)，GCF對IER5的表達起負性調控作用，NFI對IER5起正性調控作用。丁庫克等[6，25]證實HeLa細胞中GCF和IER5啟動子結合可抑制IER5的表達，而在輻射條件下這種抑制作用逐漸消失，IER5的表達量隨著輻射劑量的增加而增加，同時也觀察到部分受照射的HeLa細胞出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象和G2期阻滯。而一部分處于G2期的細胞在接受輻照后發(fā)生細胞周期解偶聯(lián)現(xiàn)象即處于G2期的細胞既不發(fā)生G2期阻滯也不進入有絲分裂M期，而是返回S期繼續(xù)進行DNA復制形成巨核，直到死亡。細胞周期解偶聯(lián)現(xiàn)象也是輻射誘導凋亡的重要方式[26-27]。其原因可能是因為p21功能缺失或者p53表達異常所致，目前尚無確切定論[22，26-27]。

關于IER5在輻射損傷誘導G2期阻滯的機制，國內外學者做了大量的研究。Beatrix等[28]報道Cdc25B是細胞從G2期過渡到M期的重要的周期調控蛋白，當Cdc25B表達量減少時發(fā)生G2期阻滯。Nakamura等[29]通過生物信息學技術發(fā)現(xiàn)Cdc25B啟動子有多個轉錄因子結合調控元件，其中包括SP1、SP3和NF-YB，而NF-YB與Cdc25B啟動子結合可促進Cdc25B轉錄。研究[29-31]表明，在輻射等刺激條件下在腫瘤細胞中IER5競爭性的結合Cdc25B啟動子轉錄因子結合位點，抑制Cdc25B啟動子與NFYB的結合，從而達到抑制Cdc25B的表達進而影響腫瘤細胞周期與有絲分裂的進程，使腫瘤細胞阻滯在G2/M期。

5　展　望

IER5基因作為一種細胞對外界刺激做出反應的早期反應基因，在保證機體正常的生命活動中意義重大，因此具有重要的研究價值。近年來國內外對于IER5在腫瘤細胞放療方面有許多研究，對IER5生物學功能的認識也在不斷深入。在放射治療中IER5的表達量與照射劑量和腫瘤大小相關，因此它可以作為放射敏感性的標記物，對放療方案的制定和優(yōu)化具有臨床意義。目前對于在突變的p53基因與IER5作用情況下促進腫瘤的形成與IER5過表達抑制腫瘤細胞的生長方面存在怎樣的關系我們還不得而知，因此還需要進一步研究，如能明確這種關系，將對臨床腫瘤的防治具有重要意義。

[1] WILLIAMS M，LYU M Y，LIN E，et al. IER5，a novel member of the slow-kinetics immediate-early genes[J]. Genomics， 1999， 55(3)：327-334.

[2] GREGORY S G，BARLOW K F，MCLAY K E，et al. Corrigendum：The DNA sequence and biological annotation of human chromosome1[J].Nature，2006，443(7114)：315-321.

[3] DAZZI L，SEU E，CHERCHI G，et al. Transcriptional regulation of the stem cell leukemia gene (SCL)-comparative analysis of five vertebrate SCL loci[J]. Genome Res，2002，12(5)：749-759.

[4] WANG H P，LONG X H，SUN Z Z，et al. Identification of differentially transcribed genes in human lymphoblastoid cells irradiated with 0.5 Gy of gamma-ray and the involvement of low dose radiation inducible CHD6 gene in cell proliferation and radiosensitivity[J]. Int J Radiat Biol，2006，82(3)：181-190.

[5] LONG X H，ZHAO Z Q，HE X P，et al. Dose-dependent expression changes of early response genes to ionizing radiation in human lymphoblastoid cells[J]. Int J Mol Med，2007，19(4)：607-615.

[6] DING K K，SHANG Z F，HAO C，et al. Induced expression of the IER5 gene by γ-ray irradiation and its involvement in cell cycle checkpoint control and survival[J]. Radiat Environ Biophys，2009，48(2)：205-213.

[7] 李秀楠，李莉，楊川杰，等. IER5基因對HeLa細胞輻射敏感性的影響[J]. 生物化學與生物物理進展，2009，36(7)：847-853.

[8] YANG C，WANG Y，HAO C，et al. IER5 promotes irradiation- and cisplatin-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells[J].Am J Transl Res，2016，8(4)：1789.

[9] LI M J，WANG W W，Chen S W，et al. Radiation dose effect of DNA repair-related gene expression in mouse white blood cells[J]. Med Sci Monit Basic Res，2011，17(10)：290-297.

[10] 李莉，趙煥英，楊川杰，等. 利用RNA干擾技術構建IER5-siRNAHeLa細胞系[J]. 中國實驗診斷學，2011，15(1)：3-6.

[11] ISLKAWA Y，SAKURAI H，KAWABATA S，et al. Heat-induced expression of the immediate-early gene IER5，and its involvement in the proliferation of heat-shocked cells[J]. FEBS J，2015，282(2)：332-340.

[12] ISLKAWA Y， SAKURAI H， KAWABATA S， et al. HSF1 transcriptional activity is modulated by IER5 and PP2A/B55[J]. FEBS Lett，2015，589(10)：1150-1155.

[13] KAWABATA S，ISHATA Y，ISLKAWA Y，et al. Immediate-early response 5 (IER5) interacts with protein phosphatase 2A and regulates the phosphorylation of ribosomal protein S6 kinase and heat shock factor 1[J]. FEBS Lett，2015，589(23)：3679-3685.

[14] LI T，DAI W，LU L，et al. Ultraviolet-induced junD activation and apoptosis in myeloblastic leukemia ML-1 cells[J]. J Biol Chem，2002，277(36)：32668-32676.

[15] 丁庫克，沈晶晶，許莉莉，等.γ射線照射對IER5基因mRNA表達的影響[J]. 中華放射醫(yī)學與防護雜志，2008，28(1)：5-8.

[16] YANG LIU，MING TIAN，HUI ZHAO，et al. IER5 as a promising predictive marker promotes irradiation-induced aproptosis in cervical cancer tissues from patients undergoing chemoraditherapy[J]. Oncotarget，2017，8(22)：36438-36448.

[17] 史海敏，丁庫克，周平坤，等. GCF低表達宮頸癌HeLa細胞系的構建及輻射對其調控IER5基因表達的初步探究[J]. 醫(yī)學研究雜志，2015，44(4)：37-41.

[18] SHI H M，DING K K，ZHOU P K，et al. Radiation-induced expression of IER5 is dose-dependent and not associated with the clinical outcomes of radiotherapy in cervical cancer[J]. Oncol Lett，2016，11(2)：1309.

[19] ASANO Y，KAWASET T，OKABE A，et al. IER5 generates a novel hypo-phosphorylated active form of HSF1 and contributes to tumorigenesis[J]. Sci Rep，2016，6：19174.

[20] 郭志云，熊莉麗，辛洪波，等. p53直接調控microRNA及其靶基因的高通量篩選[J]. 生物化學與生物物理進展，2009，36(9)：1154-1164.

[21] KAWASE T，ICHIKAWA H，OHTA T，et al. p53 target gene AEN is a nuclear exonuclease required for p53-dependent apoptosis[J].Oncogene， 2008，27：3797-3810.

[22] WALDMAN T，LENGAUER C，KINZKER K W，et al. Uncoupling of S phase and mitosis induced by anticancer agents in cells lacking p21[J].Nature，1996，381：7132716.

[23] HNISZ D，ABRAHAM B J，LEE T I，et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease[J]. Cell，2013，155：934-947.

[24] LOVEN J，HOKE H A，LIN C Y，et al. Selective inhibition of tumor oncogenes by disruption of super-enhancers[J]. Cell，2013， 153：320-334.

[25] 崔巍，尹玲玲，董凌月，等. 早期反應基因IER5啟動子區(qū)輻射敏感的轉錄因子結合位點研究[J]. 中華放射醫(yī)學與防護雜志，2012，32(1)：15-19.

[[26] 鞠桂芝，付士波，閆鳳琴，等. 電離輻射誘導細胞解偶聯(lián)的實驗研究[J]. 中華放射醫(yī)學與防護雜志，2004，24(4)：295-296.

[27] BRACET T S，WILLIAMS A C，PARASKEVA C. Inhibition of radiation-induced G2 delay potentiates cell death by apoptosis and Πor the induction of giant cells in colorectal tumor cells with disrupted p53 function[J]. Clin Cancer Res，1997，3：1371-1381.

[28] BUGLER B，SCHMITT E，ARESSY B，et al. Unscheduled expression of CDC25B in S-phase leads to replicative stress and DNA damage[J].Mol Cancer，2010，9：29.

[29] NAKAMURA S，NAGATA Y，LIN T，et al. Transcriptional repression of Cdc25B by IER5 inhibits the proliferation of leukemic progenitor cells through NF-YB and p300 in acute myeloid leukemia[J]. PLoS One，2011，6(11)：28011.

[30] 楊明月. 輻射后HepG2細胞IER5與Cdc25B啟動子的相互作用[D]. 石家莊：河北醫(yī)科大學，2014.

[31] PAN C，ZHU D，WANG Y，et al. Human cytomegalovirus miRUL148D facilitates latent viral infection by targeting host cell immediate early response gene 5[J]. PLoS Pathog，2016，12(11)：1006007.