農(nóng)藥哌蟲啶的遺傳毒性試驗(yàn)

夏 　瑩，付少華，張寅靜，王 　薇

（湖北省疾病預(yù)防控制中心，湖北省預(yù)防科學(xué)院，湖北 　武 漢 　430065）

農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展使農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)越來越依賴于農(nóng)藥等外源物質(zhì)。我國農(nóng)藥的用量居高不下，隨著過去使用的許多農(nóng)藥被檢測出具有致突變、致畸和致癌性，新上市的農(nóng)藥品種也越來越多，對這些品種農(nóng)藥的快速評價(jià)成為目前亟待解決的問題。目前已建立的短期遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)較多，這些試驗(yàn)方法耗時(shí)短、價(jià)廉、靈敏度高，在農(nóng)藥、化學(xué)品暴露的生物學(xué)效應(yīng)評價(jià)中取得了較好的評價(jià)效果。農(nóng)藥哌蟲啶是一種新煙堿類殺蟲劑，具有高效、廣譜等特點(diǎn)，本研究采用哌蟲啶進(jìn)行體外CHO-K1細(xì)胞HGPRT基因突變試驗(yàn)和小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)，旨在短期內(nèi)分析農(nóng)藥哌蟲啶是否具有遺傳毒性。

1　材料與方法

1.1　HGPRT基因突變試驗(yàn)[1]

1.1.1試劑及儀器 細(xì)胞株及來源：中國地鼠卵巢(CHO-K1)細(xì)胞株，購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，采用DMEM/F12培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清及1%雙抗)，37.0℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。代謝活化系統(tǒng)：代謝活化劑為哺乳動(dòng)物肝微粒體酶活化系統(tǒng)(S9)，購自美國Moltox公司，批號(hào)4027。每毫升S9 mix的成分為S9 1.25 mL，MgCl2(0.4 mol/L) 0.2 mL，KCl(1.65 mol/L) 0.2 mL，葡萄糖-6-磷酸17.91 mg，輔酶Ⅱ(氧化型，NADP)30.615 mg，用無血清DMEM/F12 培養(yǎng)液補(bǔ)足至10 mL。主要儀器：SANYO MCO-18AIC 二氧化碳培養(yǎng)箱，SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)。主要試劑：95%哌蟲啶原藥，江蘇克勝公司提供；3-甲基膽蒽(methylcholanthrene，MCA，2.0 μL/mL)，美國Sigma 公司生產(chǎn)，批號(hào)LB83414V；甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS，0.25 μL/mL)美國Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)BCBC4573V；以上試劑均用0.5%二甲基亞砜(DMSO，國藥集團(tuán)生產(chǎn))溶解，批號(hào)20121130；6-巰基鳥嘌呤(6-mercaptopurine，6-TG)，美國Sigma公司生產(chǎn)。

1.1.2劑量設(shè)計(jì)與分組 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以625.0 μg/mL作為最高劑量(無細(xì)胞毒性，有可見沉淀)，以下劑量依次為312.5、156.3、78.1 μg/mL，同時(shí)作陰性對照組和陽性對照組。陰性對照組給予無菌DMSO(+S9/-S9)；陽性對照組給予3-甲基膽蒽(+S9)、甲基磺酸乙酯(-S9)。

1.1.3突變試驗(yàn) 將經(jīng)6-硫代鳥嘌呤篩選，選擇生長良好的CHO-K1細(xì)胞用0.25%胰酶消化處理，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(1.5×106/mL)，每個(gè)培養(yǎng)瓶(25 cm2)接種細(xì)胞懸液1.0 mL，另加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基4 mL(3.0×105/mL)，置37 ℃、CO體積

2分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄其培養(yǎng)液，加入4.5 mL含有陰性、陽性物或不同濃度受試物的培養(yǎng)液(不含血清)，+S9每培養(yǎng)瓶加S9混合液0.5 mL，-S9加入0.5 mL培養(yǎng)液?；靹蚝?，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，棄上清，用D-Hanks液洗滌3次，加入5 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)7 d后進(jìn)行突變體的選擇及集落形成率的測定，同時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)皿接種200個(gè)細(xì)胞，每個(gè)劑量組設(shè)5個(gè)培養(yǎng)皿，7 d后，甲醇固定，Giemsa染色，觀察細(xì)胞集落數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。培養(yǎng)7 d后，以2×105/皿接種，細(xì)胞貼壁后加入6-TG(終濃度為5 μg/mL)，每劑量設(shè)5個(gè)培養(yǎng)皿。同時(shí)另按200/皿接種，每劑量組設(shè)5個(gè)培養(yǎng)皿。與上述平皿同時(shí)放入培養(yǎng)箱7 d，固定、染色，計(jì)數(shù)集落并計(jì)算集落數(shù)、存活率(CFE)和突變頻率(mutation frequency，MF)。計(jì)算公式為：

絕對CFE=形成集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)；

相對CFE=試驗(yàn)組絕對CFE/溶劑對照組絕對CFE×100%；

突變頻率=突變型細(xì)胞克隆數(shù)/(接種細(xì)胞數(shù)×克隆形成率)×100%

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)法。

1.2　小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)[1]

1.2.1試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，雌雄各25只。體質(zhì)量25～30 g。SPF級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于塑料飼育盒內(nèi)，每籠5只，籠具、食盒每周更換一次并進(jìn)行清洗消毒。環(huán)境條件：溫度(23±3)℃，濕度40%～70%，12 h/12 h明暗交替，噪音在60 dB以下；換氣次數(shù)每小時(shí)10～18次。

1.2.2主要儀器和試劑 主要儀器有Olympus CX21顯微鏡。主要試劑有甲醇(國藥集團(tuán)生產(chǎn))、吉姆薩染液(美國Sigma公司生產(chǎn))

1.2.3劑量設(shè)計(jì)和分組 根據(jù)資料該受試物對雌、雄性大鼠的LD50均 大于5 000 mg/kg。按LD50的1/8、1/4、1/2設(shè)置低、中、高3個(gè)劑量組，分別為625、1 250、2 500 mg/kg，另設(shè)陰性對照組和陽性對照組。陰性對照組給予純水，陽性對照組按40 mg/kg給予環(huán)磷酰胺(CP)。動(dòng)物按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組小鼠雌性5只，雄性5只。

1.2.4試驗(yàn)方法 分兩次灌胃給予受試物，間隔24 h，受試樣品各組每次小鼠灌胃容量均為20 mL/kg。于末次給予受試物后22 h處死動(dòng)物，取股骨做骨髓涂片，自然干燥后用甲醇固定，Giemsa染色。每只動(dòng)物油鏡下觀察1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，記錄出現(xiàn)微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，其微核發(fā)生率以含微核的PCE千分率計(jì)；計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞數(shù)(PCE)，同時(shí)計(jì)數(shù)成熟紅細(xì)胞數(shù)(NCE)，并計(jì)算PCE占紅細(xì)胞總數(shù)(PCE+NCE)的百分比。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)法。

2　結(jié)果

2.1　HGPRT基因突變試驗(yàn)結(jié)果

如表1所示，細(xì)胞毒性測試表明各組細(xì)胞相對存活率均大于50%。如圖1所示，與陰性對照組比較，在活化系統(tǒng)和非活化系統(tǒng)條件下，受試樣品各劑量組細(xì)胞基因突變頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，陽性對照組細(xì)胞基因突變頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。

表1　細(xì)胞毒性測試和集落形成率(n=200)

圖1　各受試物對基因位點(diǎn)突變頻率的影響

2.2　小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見表2。結(jié)果表明，受試物各組未成熟紅細(xì)胞占紅細(xì)胞總數(shù)的比例[PCE/(PCE+NCE)總數(shù)]均不少于陰性對照組的20%；與陰性對照組比較，陽性對照組雌雄小鼠微核率明顯增加(p＜0.01)，而受試樣品各劑量組雌雄小鼠微核率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明該受試樣品骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

3　討論

農(nóng)藥哌蟲啶HGPRT基因突變試驗(yàn)與小鼠微核試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，在本實(shí)驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)致突變性。化學(xué)有害物質(zhì)導(dǎo)致的DNA損傷后主要表現(xiàn)為體細(xì)胞基因突變，此突變可導(dǎo)致發(fā)生多種疾病，并和腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，在化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致基因突變作用中占有特殊地位[2]。在檢測體細(xì)胞基因突變體系中，HGPRT基因突變是一種常用的方法，在有關(guān)化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性檢測策略的文獻(xiàn)中也提到，為有效鑒定物質(zhì)是否具有致突變性，一組小型試驗(yàn)中應(yīng)當(dāng)含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞突變試驗(yàn)[3]。因此，在評價(jià)農(nóng)藥哌蟲啶遺傳毒性的體外試驗(yàn)中，能夠?qū)w細(xì)胞的基因突變進(jìn)行準(zhǔn)確檢測分析的方法常作為必選方法。有研究顯示，應(yīng)用中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO/ HGPRT基因突變試驗(yàn)方法，43種已知的具有致癌性化學(xué)物質(zhì)中的40種化學(xué)物質(zhì)在該試驗(yàn)結(jié)果中為陽性[4]。并且哌蟲啶HGPRT基因突變試驗(yàn)結(jié)果還可為后續(xù)致癌性評價(jià)試驗(yàn)提供劑量參考。有幾項(xiàng)研究中提到，微核試驗(yàn)在敏感性、準(zhǔn)確性和特異性方面與染色體畸變試驗(yàn)方法幾乎相當(dāng)[5-6]。由于微核試驗(yàn)方法具有簡便、快速、試驗(yàn)結(jié)果可信度高[7]、可在較短時(shí)間內(nèi)檢出染色體損傷效應(yīng)、背景清楚、影響因素少、易重復(fù)等特點(diǎn)，故可被應(yīng)用于哌蟲啶的遺傳毒理學(xué)中的染色體損傷的檢測之前。此外，體內(nèi)微核試驗(yàn)往往采用適合濃度的化合物處理，符合體內(nèi)的正常生理狀態(tài)，故在哌蟲啶的安全性評價(jià)上更具生理學(xué)意義。

表2　哌蟲啶原藥試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

[1] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. GB 15670-1995 農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995：8.

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