非小細(xì)胞肺癌移植瘤侵襲組織中血清蛋白的分布

白玉勤 吳 　寶 張 　龍劉曉輝 其木格 劉帥瑩韋學(xué)磊 王　徽

（1. 赤 峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古　赤峰 　024000；2. 赤 峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 　赤 峰 　024005；3. 赤 峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 　赤 峰 　024000；4. 赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院輸血科，內(nèi)蒙古　赤峰　024005；5. 赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 　赤 峰 　024005）

腫瘤微環(huán)境是影響腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[1]。許多研究采用病理檢查的石蠟切片進(jìn)行評(píng)估分析腫瘤微環(huán)境，但傳統(tǒng)標(biāo)本制備過(guò)程中的固定和脫水等影響腫瘤微環(huán)境的精準(zhǔn)分析[2-3]。由日本山梨大學(xué)大野伸一教授研制開發(fā)的活體冷凍技術(shù)(in vivo cryotechnique，IVCT)是活體狀態(tài)下冷凍固定動(dòng)物靶器官，揭示了血液流動(dòng)狀態(tài)下的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，克服了傳統(tǒng)標(biāo)本制作方法血流中斷帶來(lái)的弊端[4]。我們利用IVCT技術(shù)不僅在小鼠肝臟、腎臟、卵巢等器官上清晰觀察到血清蛋白(serum proteins)，如Albumin、IgG、IgA、IgM等，而且在異種移植人非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC) 模型上首次清晰觀察到血清蛋白分布，避免了傳統(tǒng)標(biāo)本制作方法導(dǎo)致的人工假象(artifacts)，提出了腫瘤間質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)的血清蛋白分布與其相對(duì)分子質(zhì)量密切相關(guān)[5-6]，研究發(fā)現(xiàn)在A549移植瘤周邊和中心區(qū)域的血清蛋白如Albumin、IgG1、IgM的分布不同[6]，為了進(jìn)一步研究A549移植瘤周邊區(qū)域(侵襲組織)血清蛋白分布情況，本研究再次利用凍存的A549細(xì)胞，在日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室制作模型，在大野教授指導(dǎo)下制備冷凍標(biāo)本，探討移植瘤侵襲組織血清蛋白分布與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal g rowth f actor r eceptor，EGFR)的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及移植瘤模型的建立

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)日本山梨大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。雄性BALB/c品系(BALB/c-nu/nu)裸鼠20只，購(gòu)于日本SLC株式會(huì)社，鼠齡為7～8周，動(dòng)物模型建立和飼養(yǎng)均在日本山梨大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF條件下的超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

1.1.2肺癌細(xì)胞系 非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞由日本東北大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所提供，在日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部解剖分子教研室的細(xì)胞培養(yǎng)室常規(guī)傳代培養(yǎng)[7]，細(xì)胞培養(yǎng)于含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。

1.1.3腫瘤移植 運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)移植法，先進(jìn)行A549細(xì)胞培養(yǎng)并傳代，收集約5×106個(gè)細(xì)胞接種到裸鼠背部靠近頭部皮下，接種后觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，于第2周開始使用游標(biāo)卡尺在體外分別測(cè)量瘤體長(zhǎng)徑和寬徑，采用的體積計(jì)算公式為1/2×(長(zhǎng)徑)×(寬徑)2，待腫瘤體積達(dá)到1 000 mm3時(shí)進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察。

1.2　儀器和試劑

1.2.1主要儀器設(shè)備 牙科電鉆，磁力攪拌器，低溫冰箱，轉(zhuǎn)輪切片機(jī)，白色透明濕盒，五片直立瓶，羅紋口玻璃瓶，防脫片，顯微鏡。

1.2.2主要試劑 多聚甲醛，丙酮，異戊烷，丙烷，液氮，干冰。魚明膠，購(gòu)于Sigma公司；羊抗鼠血清蛋白(albumin)、免疫球蛋白G1和M(IgG1、IgM)、兔抗人VEGF和EGFR單克隆抗體、羊抗兔IgG，均購(gòu)自邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；兔抗羊IgG，購(gòu)于Vector Laboratories；二氨基聯(lián)苯胺(3′，3-diaminobenzidine，DAB)試劑盒。

1.3　標(biāo)本的制備

帶有移植瘤的裸鼠用乙醚麻醉，剪開背部皮膚暴露移植瘤進(jìn)行活體冷凍固定并制備標(biāo)本[8]。用-196 ℃液氮致冷的異戊烷-丙烷冷凍液(-193 ℃)冷凍固定移植瘤，在液氮里用牙科電鉆取下腫瘤組織后，移到-80℃干冰預(yù)冷的2%多聚甲醛-丙酮液中進(jìn)行冷凍置換[6]。冷凍置換是固定在2%多聚甲醛-丙酮液的冷凍標(biāo)本逐漸升溫從-80 ℃到室溫的過(guò)程。移植瘤冷凍置換后用聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物或石蠟包埋劑包埋，進(jìn)行冰凍或石蠟切片，顯微鏡下觀察。

1.4　免疫組織化學(xué)染色

石蠟標(biāo)本3 μm連續(xù)切片后貼附于含MAS的防脫載玻片(購(gòu)于日本Matsunami Glass)。一部分切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，另一部分切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，最后蒸餾水水化后用PBS沖洗，用于免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色。IHC采用親和素-生物素-過(guò)氧化物酶(ABC)法。首先用1%過(guò)氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，2%魚明膠溶液封閉。PBS漂洗3次，分別滴加一抗羊抗鼠血清蛋白(albumin)、 免 疫 球 蛋 白 G1和 M(IgG、 IgM)(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX，USA)，兔抗人VEGF和EGFR單克隆抗體，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。PBS沖洗后滴加與第一抗體種屬匹配的二抗兔抗羊IgG或羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。DAB顯色，采用蘇木精進(jìn)行細(xì)胞核淡染，梯度酒精脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。每次染色均設(shè)空白對(duì)照(PBS)和自身陽(yáng)性對(duì)照。自身陽(yáng)性對(duì)照是在同一切片上與檢測(cè)的目的物對(duì)照比較。如albumin在血管腔內(nèi)應(yīng)為陽(yáng)性，IgG1和IgM在某免疫細(xì)胞漿或血管腔內(nèi)應(yīng)為陽(yáng)性，EGFR和VEGF在紅細(xì)胞膜或某梭形細(xì)胞漿應(yīng)為陽(yáng)性。

1.5　判斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)免疫組化染色程度分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)、中度陽(yáng)性(++)和弱陽(yáng)性(+)，無(wú)著色為陰性(-)。在連續(xù)切片上對(duì)NSCLC(包括血管、腫瘤周圍結(jié)締組織、腫瘤間質(zhì)、腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)、免疫細(xì)胞)的albumin、IgG1和IgM蛋白表達(dá)程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，VEGF和EGFR蛋白免疫組化染色在胞膜或細(xì)胞漿呈棕色判斷為陽(yáng)性，無(wú)著色為陰性。

2　結(jié)果

2.1　Albumin、IgG1和IgM在NSCLC移植瘤侵襲組織的分布

A549移植瘤侵襲組織HE染色和albumin、IgG1、IgM蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖1。可見在HE切片上NSCLC侵襲組織觀察到擴(kuò)張的血管及血管內(nèi)流動(dòng)的紅細(xì)胞，癌細(xì)胞核及清晰的核仁，豐富的細(xì)胞漿，并且細(xì)胞與細(xì)胞間連接比較緊密。Albumin免疫組化染色在血管、癌周圍結(jié)締組織、細(xì)胞外基質(zhì)及腫瘤間質(zhì)呈強(qiáng)-中度陽(yáng)性。IgG1免疫組化染色在血管和腫瘤周圍結(jié)締組織呈中度陽(yáng)性，在腫瘤間質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)呈弱陽(yáng)性。IgM免疫組化染色在血管和腫瘤周圍纖維結(jié)締組織呈中度陽(yáng)性，但是在腫瘤間質(zhì)和癌細(xì)胞外基質(zhì)呈陰性。IgG1和IgM在免疫細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性，半定量分析見表1。

圖1　A549移植瘤侵襲組織HE染色和albumin、IgG1、IgM蛋白免疫組織化學(xué)染色圖片(×200)

表1　NSCLC侵襲組織albumin、IgG1和IgM表達(dá)的半定量分析

2.2　VEGF和EGFR蛋白在NSCLC移植瘤侵襲組織的分布

VEGF免疫組化染色(圖2A和2B)在腫瘤周圍纖維結(jié)締組織和間質(zhì)內(nèi)某梭形細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞和紅細(xì)胞膜也呈陽(yáng)性表達(dá)，癌細(xì)胞漿呈細(xì)顆粒狀陽(yáng)性表達(dá)。EGFR蛋白(圖2C和2D)在腫瘤周圍纖維結(jié)締組織和間質(zhì)內(nèi)某梭形細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)，血管內(nèi)皮細(xì)胞和紅細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)，但是癌細(xì)胞漿和膜未見VEGF蛋白表達(dá)，呈陰性。

3　討論

動(dòng)物切除組織制作病理學(xué)標(biāo)本過(guò)程中，通過(guò)化學(xué)固定和酒精脫水步驟，通常會(huì)導(dǎo)致組織收縮、分子易位和抗原封閉[9，11]等，產(chǎn)生人工假象。IVCT技術(shù)是瞬間冷凍固定組織和細(xì)胞，防止了傳統(tǒng)化學(xué)固定的弊端。本研究采用A549細(xì)胞異種移植模型，通過(guò)IVCT 技術(shù)制備的NSCLC標(biāo)本，觀察HE染色的侵襲組織的組織學(xué)特點(diǎn)，并進(jìn)行albumin、IgG1和IgM免疫組化染色分析。IVCT技術(shù)制備標(biāo)本的HE形態(tài)同樣觀察到均勻紅染的細(xì)胞外基質(zhì)，沒有因傳統(tǒng)標(biāo)本制備方法而導(dǎo)致細(xì)胞收縮的縫隙[6]。清晰觀察到利用IVCT制備NSCLC侵襲組織的albumin、IgG1和IgM免疫組織化學(xué)染色分布，半定量分析進(jìn)一步說(shuō)明了移植瘤侵襲組織不同分布，在腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的免疫組織化學(xué)分布有可能與它們的分子量密切相關(guān)。另外，還有可能與血清蛋白的電荷及血管構(gòu)造有關(guān)，反映了NSCLC侵襲組織腫瘤細(xì)胞間復(fù)雜相互作用導(dǎo)致局部微環(huán)境的改變。

圖2　A549移植瘤侵襲組織VEGF和EGFR蛋白免疫組織化學(xué)染色分布

VEGF是作用最強(qiáng)的促血管形成因子之一，它可以通過(guò)與其特異性受體結(jié)合引起一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，釋放多種細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管形成，增加血管通透性，并且參與肺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[12]。我們研究了BI6-BL6黑色素瘤細(xì)胞移植瘤組織IgM免疫組化表達(dá)與線粒體功能的關(guān)系[13]，并且在Lu99和Lu65移植瘤組織中討論了VEGF、vWF和IgM三者的關(guān)系[8]，得出了腫瘤細(xì)胞胞漿VEGF強(qiáng)陽(yáng)性區(qū)域的細(xì)胞外基質(zhì)中IgM免疫組化染色陰性，證明了Lu99和Lu65移植瘤組織VEGF強(qiáng)陽(yáng)性區(qū)域的血管壁不能透過(guò)大分子量IgM，發(fā)現(xiàn)了NSCLC組織的功能性血管。本研究中明確提出NSCLC侵襲組織癌細(xì)胞VEGF和EGFR蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了VEGF蛋白在癌細(xì)胞漿、間質(zhì)梭形細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及紅細(xì)胞膜或漿均陽(yáng)性表達(dá)，但是EGFR蛋白在A549移植瘤侵襲組織癌細(xì)胞漿或膜陰性表達(dá)，在間質(zhì)梭形細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及紅細(xì)胞膜或漿陽(yáng)性表達(dá)。圖1和圖2說(shuō)明了A549移植瘤侵襲組織細(xì)胞外基質(zhì)血清蛋白質(zhì)albumin、IgG1、IgM的免疫組化染色分布與VEGF和EGFR表達(dá)無(wú)關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Weiss等[14]認(rèn)為EGFR蛋白表達(dá)與microRNA-128b調(diào)節(jié)密切相關(guān)。并且EGFR參與多種信號(hào)途徑促進(jìn)血管形成和腫瘤細(xì)胞增殖。Nicholson等[15]研究分析了1985年到2000年發(fā)表的有關(guān)EGFR與癌預(yù)后的文獻(xiàn)，不同的研究其結(jié)果也不同，產(chǎn)生這些差異可能與標(biāo)本數(shù)量和缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的免疫組織化學(xué)判定標(biāo)準(zhǔn)等有關(guān)。我們通過(guò)IVCT技術(shù)，清晰顯示了A549移植瘤侵襲組織EGFR 蛋白分布，證明了EGFR表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲無(wú)關(guān)。

綜上所述，在異種移植A549細(xì)胞模型上，IVCT技術(shù)制備的標(biāo)本采用免疫組化染色分析albumin、IgG、IgM、VEGF和EGFR蛋白分布，清晰觀察到albumin、IgG1 和IgM在移植瘤侵襲組織細(xì)胞外基質(zhì)的不同分布，有可能與其分子量有關(guān)，與VEGF和EGFR蛋白分布無(wú)關(guān)。

(感謝日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部解剖分子組織學(xué)教研室大野教授大力支持)

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