高效液相色譜—紫外—?dú)浠锇l(fā)生—原子熒光聯(lián)用法檢測稻谷中汞含量

[摘要]高效液相色譜一紫外一氫化物發(fā)生一原子熒光聯(lián)用法（HPLC-UV-HG-AFS）檢測稻谷中汞含量及其化學(xué)形態(tài)。并對HPLC-UV-HG-AFS和HPLC-ICP-MS兩種方法的線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，在低濃度時(shí)，兩種方法的線性和準(zhǔn)確度沒有顯著差異，檢測限低，準(zhǔn)確度高。但在高濃度時(shí)，由于ICP的記憶效應(yīng)、樣品的基體效應(yīng)，使得HPLC-ICP-MS法測定的結(jié)果準(zhǔn)確度降低。HPLC-UV-HG-AFS的線性范圍更寬，成本低，更適合稻谷中汞的測定。

[關(guān)鍵詞]稻谷；汞形態(tài)；高效液相色譜-紫外-氫化物發(fā)生-原子熒光聯(lián)用；HPLC-ICP-MS

中圖分類號：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180115

在自然界中汞主要以無機(jī)汞和有機(jī)汞的形態(tài)存在，存在形態(tài)不同，其毒性和可利用性也有差異。在大氣、水和土壤環(huán)境中都存在不同形態(tài)的汞，對人類的健康存在一定的威脅，特別是隨著冶金和電解化學(xué)的發(fā)展，以及農(nóng)藥、醫(yī)藥領(lǐng)域中含汞防腐劑、殺菌劑、滅藻劑、除草劑的使用，使得糧食作物中汞的含量急劇上升。由于稻谷等糧食作物的生物富集作用，使得稻谷中汞含量高于其周圍的土壤環(huán)境。因此強(qiáng)化糧食作物特別是稻谷、小麥等主食中汞含量及其化學(xué)形態(tài)的分析就顯得尤為重要。當(dāng)前測定糧食作物中的甲基汞已經(jīng)成為汞污染研究的重點(diǎn)之一，其測定結(jié)果不僅對食品中的汞污染控制有重要意義，還能提供水和土壤環(huán)境污染狀況的相關(guān)信息。

早期的研究主要是利用人工提取和分離的方式，利用氣相色譜、毛細(xì)管電泳等方法對有機(jī)汞（甲基汞）進(jìn)行檢測分析。而近年來利用色譜的分離能力與原子光譜的高選擇性、高靈敏度聯(lián)用來進(jìn)行測定不同形態(tài)的元素成為分析化學(xué)發(fā)展的一大熱點(diǎn)，如氣相色譜-冷原子熒光聯(lián)用法、液相色譜-原子熒光聯(lián)用法。

本試驗(yàn)建立了提取液消解HPLC-UV-HG-AFS測定稻谷中汞及其形態(tài)的方法，并對HPLC-UV-HG-AFS和HPLC-ICP-MS兩種方法在汞測定中的準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行了比較分析，以期為糧食中汞檢測提供更經(jīng)濟(jì)高效的檢測方法。

1材料與方法

1.1試劑和材料

稻谷汞陽性樣品：汞礦區(qū)的水稻樣品；大米：市售；氯化鉀、硝酸銅、濃硝酸、氫氧化鉀、硼氫化鉀、乙酸銨、乙腈、Na₂S₂O₃·5H₂O、二氯甲烷（以上試劑均為分析純）：上海申氏化工；L一半胱氨酸（生化試劑）：上海申氏化工；湖南大米：地球物理地球化學(xué)堪測研究所；汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000μg/mL）：中國計(jì)量科學(xué)研究院；氯化甲基汞（純度大于96%）：德國Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司；氨水（優(yōu)級純）：上海申氏化工；汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（甲基汞GBW08675），含量為（76.6±2.9）μg/g：中國計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2儀器和設(shè)備

FS930型原子熒光光度計(jì)：北京吉天儀器有限公司；SA-20型形態(tài)分析儀：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1200型高效液相色譜儀及7500a型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：美國Agilent公司；SIGMA 3K15離心機(jī)：德國Sigma公司；IND205天平：瑞士Mettler公司；Milli-Q型純水機(jī)（出水電阻率18.2MΩ·cm）：法國密理博公司；PRP-X100型陰離子分離柱：瑞士Hamihon公司；ZORBAXXDB-C18型色譜柱（2.1mm×50mm×5μm）：美國Agflent公司。

所有玻璃器皿用HN03浸泡24h，再用去離子水清洗3遍，超聲清洗器清洗，晾干后備用。

1.3溶液的配制

1.3.1甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/mL）

準(zhǔn)確稱取氯化甲基汞13.02mg于100mL容量瓶中，加入少量甲醇溶解并定容至刻度。然后避光保存于4℃冰箱中。

1.3.2汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 Ixg/mL）

準(zhǔn)確移取1000 μg/mL汞標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。避光保存于4℃冰箱中。

1.3.3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（低濃度）

準(zhǔn)確移取100μg/mL甲基汞、無機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00mL于100mL容量瓶中，制成1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL甲基汞、氯化汞100ng，mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于50mL容量瓶中，用超純水定容到刻度，配制成濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ng/mL的汞標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（高濃度）

按1.3.3的方法分別配制濃度為25.00、50.00、100.00、200.00、500.00 ng/mL的汞標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.5 Na₂S₂O₃溶液（0.01mol/L）

準(zhǔn)確稱取0.248g Na₂S₂O₃·5H₂O于燒杯中，加入少量水溶解后轉(zhuǎn)移并定容至100mL容量瓶中。

1.3.6 KOH溶液（25g/100mL）

準(zhǔn)確稱取25g KOH于燒杯中，加入100mL水溶解后轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯瓶中。

1.3.7提取液

在濃硝酸中加入1mL 1mol/t的硝酸銅和1mL18g/100g氯化鉀作為提取液。

1.4樣品的前處理

1.4.1制粉

準(zhǔn)確稱取一定量的稻谷，開糙除殼，制成精米，然后磨粉，過80目篩。

1.4.2微波消解

微波消解工作條件見表1。

1.4.3高效液相色譜-紫外-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜

準(zhǔn)確稱取0.500g大米樣品、標(biāo)準(zhǔn)品及按1.4.1處理后的稻谷陽性樣品，于各個(gè)微波消解罐中，加入提取液溶液5.00mL，輕輕振搖，放入微波消解儀中，按表1中微波條件表提取40min。提取結(jié)束后，將樣品轉(zhuǎn)移至離心管中。再加入10mL二氯甲烷，水平振蕩器振蕩30min，5000r/min離心10min。定量移取5.00mL下層二氯甲烷相于塑料離心管中，加入溶液0.01mol/L Na₂S₂O₃溶液2.00mL，振蕩1h，5000r/min離心10min。取1.00mL上層清液于10mL刻度玻璃管中，用水定容并上機(jī)測定。

1.4.4高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法

稱準(zhǔn)確稱取0.500g大米樣品、標(biāo)準(zhǔn)品及按1.4.1處理后的稻谷陽性樣品，于各個(gè)微波消解罐中，加入4mL 25%四甲基氫氧化銨，輕輕振搖，放入微波消解儀中，按表1中微波條件表提取40min。待消解完成，冷卻至室溫后，打開消解罐，將樣品轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯（PTFE）燒杯中，放置于電熱板上（120～160℃）趕酸至剩余1mL左右，用超純水洗滌3～4次，轉(zhuǎn)移合并于25mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻待測。汞易揮發(fā)，消化液用水多次洗滌后直接合并于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻備用。取2mL上清液于15mL離心管中，逐滴加入1.5mL 35%氨水和0.2mL 2%半胱氨酸，用純水定容至5mL，4℃，8000r/min離心15min，取上清液過0.45μm濾膜，濾液經(jīng)HPLC-ICP-MS進(jìn)行形態(tài)分析。

1.4.5加標(biāo)回收率試驗(yàn)

（1）無機(jī)汞加標(biāo)回收率試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取0.500g制備的樣品（汞陰性稻谷粉末樣品）于微波消解罐中，準(zhǔn)確加入1.00mL氯化汞標(biāo)準(zhǔn)溶淮，以下步驟同

1.4.3和1.4.4。

（2）甲基汞加標(biāo)回收率試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取0.500g制備的樣品（汞陰性稻谷粉末樣品）于微波消解罐中，加入1.00mL甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶淮，以下步驟同1.4.3和1.4.4。

1.4.6儀器條件

（1）HPLC-UV-HG-AFS法液相色譜工作條件：色譜柱為ZORBAX XDB-C18（2.1mm×50mm×5μm）；流動相為60mmol/L L-半胱氨酸-10mmol/L乙酸銨-乙腈（5：5：90）；流速1.0mL/min；進(jìn)樣體積20μL。

（2）HPLC-UV-HG-AFS法原子熒光光譜儀相關(guān)參數(shù)配置。氫化物發(fā)生參數(shù)：還原劑為2%KBH₄+0.35%KOH（1：1）；氧化劑為1%K₂S₂O₈-V₂O₅-HNO₃（1：1：1）；載流為5%HNO₃；間隔氣為空氣。AFS參數(shù)：元素?zé)魹镠g（100mA/45mA）；負(fù)電壓300V；燈電流60mA；載氣為氬氣，流速300mL/min；屏蔽氣同樣為氬氣，流速600mL/min。測定形態(tài)：Hg（Ⅱ）、MeHg、EtHg、PhHg。

（3）ICP-MS法液相色譜工作條件：色譜柱為ZORBAX XDB-C18（2.1mm×50mm×5μm）；流動相為60mmol/L L-半胱氨酸-10mmol/L乙酸銨-甲醇（5：5：90）；流速0.4mL/min；進(jìn)樣體積20μL。

（4）ICP-MS法質(zhì)譜儀相關(guān)參數(shù)配置：RF功率1500W，反射功率<5W，霧室溫度-5℃，等離子氣（Ar）流量15L/min，輔助氣體（Ar）流量0.8L/min，載氣（Ar）流量0.7L/min，氬氧混合氣（Ar/O₂）流量0.2L/min，采樣深度9mm，檢測離子Hg（m/z=2O₂），信號采集模式為時(shí)間分辯模式，積分時(shí)間0.1s。

2結(jié)果與討論

2.1

25%KOH水溶液-微波輔助萃取和濃硝酸/硝酸銅/氯化鉀-微波輔助萃取法的比較

在濃硝酸中加入1mol/L的硝酸銅和18g/100g氯化鉀作為消解萃取液，與單獨(dú)的濃硝酸相比，在無機(jī)汞測定中，二者沒有顯著區(qū)別，而在甲基汞的測定中，濃硝酸，硝酸銅/氯化鉀表現(xiàn)出更高效的提取效率，最高可達(dá)89%?？赡苁倾~離子的存在，加速了汞-巰基鍵的斷裂，而氯離子的存在，促進(jìn)了鹵代烷基汞的（特別是MeHgCl）形成，兩者的協(xié)同作用，使得有機(jī)汞的提取效率更高。故本實(shí)驗(yàn)中HPLC-UV-HG-AFS法選用濃硝酸，硝酸銅/氯化鉀對樣品中的汞化合物進(jìn)行提取?；厥章试囼?yàn)見表2。

HPLC-UV-HG-AFS測定汞化合物多采用氫氧化鉀或氫氧化鈉調(diào)節(jié)酸度，但采用HPLC-ICP-MS測定時(shí)，引入的鉀/鈉鹽會抑制ICP，使其穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致數(shù)據(jù)波動，影響準(zhǔn)確性，故本實(shí)驗(yàn)采用堿微波提取法，用35%氨水調(diào)節(jié)酸度。另外ZORBAXXDB-C18柱適用pH范圍較寬（pH1.5～8.5），故提取液酸度不必嚴(yán)格控制。

2.2高效液相色譜條件的選擇

根據(jù)原子熒光和ICP-MS的不同特性，對其色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。對HG-AFS和ICP-MS而言，提取分離的效率至關(guān)重要，由于提取方法的不同（前者采用提取液酸法，后者采用堿提取法），提取液的最終酸度會在一個(gè)較寬范圍內(nèi)分布，所以本實(shí)驗(yàn)采用適用范圍較大（pH1.5～8.5）的ZORBAX XDB-C18色譜柱。由于流動相乙腈的分離效果好于甲醇，故在HG-AFS中，選用乙腈作為流動相。但由于乙腈含碳量較高，易堵塞ICP-MS的錐孔，故ICP-MS采用含碳量低的甲醇作為流動相。由于L-半胱氨酸無毒無害，且易于汞絡(luò)合，故兩種條件下，均使用L-半胱氨酸作為絡(luò)合劑。

2.3氧化劑過硫酸鉀和五氧化二釩的氧化效率的分析

以1%K₂S₂O₈-KOH溶液和1%K₂S₂O₈-V₂O₅-HNO₃溶液作為氧化劑，作無機(jī)汞和甲基汞的含量分析。通過圖1和圖2可以看出，1%K₂S₂2O₈-V₂O₅-HNO₃溶液的氧化效率更高，測得的值更接近推薦值。究其原因，可能是V₂O₅在酸性溶液中的催化氧化作用，加速了汞的原子化。故本實(shí)驗(yàn)采用1%K₂S₂O₈-V₂O₅-HNO₃作為氧化劑。不同氧化劑測定無機(jī)汞的平行試驗(yàn)見表3、表4。

2.4兩種方法的線性范圍、回收率、精密度實(shí)驗(yàn)

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，以3倍基線噪聲測定2種形態(tài)汞的檢出限（S/N=3），同時(shí)考察兩種方法的線性范圍和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDS）（以10ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行7次進(jìn)樣測定），得到了兩種方法的線性范圍、檢出限、相對標(biāo)準(zhǔn)差見表5、表6。

在高濃度范圍內(nèi)25.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL、200.0ng/mL、500.0ng/mL，AFS試驗(yàn)方法的線性和重現(xiàn)性和低濃度沒有顯著差異，而在高濃度下，ICP會產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使得測定結(jié)果偏高，而且濃度越高記憶效應(yīng)越明顯，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線線性偏離，影響了最終測定的準(zhǔn)確性。AFS試驗(yàn)方法的精密度、線性范圍及檢出限見表7。

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，HPLC-UV-HG-AFS測得稻谷陽性樣品中汞的總含量在267.8～353.1ng/g，甲基汞含量在32.5～43.2ng/g，占總汞含量的5.2%～8.6%。該方法的回收率在84.3%～102.1%。

綜上所述，AFS法的線性范圍較ICP-MS法的更寬。在低濃度范圍下，兩者的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性沒有顯著差異；但高濃度時(shí)，由于含碳量高的有機(jī)相進(jìn)入ICP-MS，會導(dǎo)致錐孔堵塞，以及ICP的記憶效應(yīng)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)，故重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度不如AFS。

3結(jié)論

本文對HPLC-UV-HG-AFS和ICP-MS的前處理方法進(jìn)行了比較優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)提取液-微波消解法可以有效地將無機(jī)汞和甲基汞提取出來，并能減少汞的損失，同時(shí)以1%K₂S₂O₈-V₂O₅-HNO₃為氧化劑，進(jìn)行在線紫外氧化，可以提高氧化效率，進(jìn)一步提高HPLC-UV-HG-AFS測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。提高了測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。而在HPLC-ICP-MS試驗(yàn)中通過避免使用鈉鉀鹽以用使用含碳量較低的甲醇，確保了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，在低濃度范圍時(shí)，AFS法和ICP-MS法的精密度和準(zhǔn)確度沒有顯著差異，均表現(xiàn)出優(yōu)良的線性和準(zhǔn)確性。但在高濃度下，由于ICP的記憶效應(yīng)和錐孔孔徑的限制，使得HPLC-ICP-MS的線性和準(zhǔn)確性都有一定程度的偏移。