小麥中赭曲霉毒素A含量測(cè)定方法的改進(jìn)研究

[摘要]目的：優(yōu)化GB 5009.96-2016中赭曲霉毒素A檢測(cè)的前處理方法和色譜條件，以適應(yīng)大批量樣本的檢測(cè)。方法：樣品經(jīng)甲醇：水（V：V=80：20）漩渦提取、免疫親和層析凈化，超高效液相色譜法測(cè)定。色譜條件為T(mén)hermo Scientific Hypersil GOLD C18反相柱（100mm×2.1mm，粒徑1.9μm），流動(dòng)相為1%乙酸水-乙腈（V：V=60：40），流速為0.25mL/min，進(jìn)樣量4μL，柱溫：25℃，熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)333nm，發(fā)射波長(zhǎng)460nm。結(jié)果：赭曲霉毒素A在1.00～20.00ng/mL時(shí)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，加標(biāo)回收率為82.9%～90.1%，精密度RSD5.1%～6.1%。本方法實(shí)驗(yàn)用時(shí)和流動(dòng)相用量分別比國(guó)標(biāo)法減少72.8%和87.5%。結(jié)論：本方法適用于小麥中赭曲霉毒素A含量的測(cè)定且更靈敏、高效和環(huán)保。在大批量樣品分析中可有效節(jié)約時(shí)間、材料成本。

[關(guān)鍵詞]小麥；赭曲霉毒素A；超高效液相色譜；免疫親和柱；漩渦提取

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180114

赭曲霉毒素A（Ohratoxin A，OTA）主要由曲霉屬、青霉屬等真菌污染產(chǎn)生，在谷物中的污染率和污染水平最高，具有肝腎毒性。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中真菌毒素的限量值為5.0μg/kg。

目前用于赭曲霉毒素A定量分析的方法主要有高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法、免疫膠體金法和免疫親和柱法等，GB 5009.96-2016采用了免疫親和層析凈化-高效液相色譜法、離子交換固相萃取柱凈化-高效液相色譜法、免疫親和層析凈化-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和薄層色譜測(cè)定法共5種方法。其中，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法和薄層色譜測(cè)定法操作復(fù)雜；液相色譜法中普通高效液相色譜法耗時(shí)長(zhǎng)、乙腈和甲醇試劑消耗大，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)需要高端質(zhì)譜儀；提取用均質(zhì)器清洗費(fèi)時(shí)費(fèi)力且容易造成樣品交叉污染；搖床振蕩提取需耗時(shí)約30min；磷酸鹽緩沖液配制繁雜等限制了檢測(cè)工作效率的提升。

本次采用GB 5009.96-2016中對(duì)樣品有針對(duì)性的純化作用、過(guò)柱后可直接用于上機(jī)分析的免疫親和層析凈化法，同時(shí)對(duì)小麥中赭曲霉毒素A的提取方法、檢測(cè)儀器和色譜條件進(jìn)行了改進(jìn)：①用甲醇，水（V：V=80：20）替代磷酸鹽緩沖液；②用漩渦提取替代均質(zhì)/振蕩；③探索建立小麥中赭曲霉毒素A免疫親和層析凈化-超高效液相色譜法（UPLC），以期獲得靈敏、高效、快速和環(huán)保的方法滿足大批量檢測(cè)的需要。

1材料與方法

1.1材料與試劑

糧庫(kù)中自然產(chǎn)生的赭曲霉毒素A陽(yáng)性小麥；赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液50μg/mL（苯：乙酸=99：1）：美國(guó)Supelco；甲醇（色譜純）：美國(guó)Fisher；乙腈（色譜純）：Sigma Mofich；冰乙酸、甲醇（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氯化鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水經(jīng)Sartorius純水機(jī)制備，0.22μm膜過(guò)濾。

1.2儀器

超高效液相色譜儀Thermo U3000+（配FLD檢測(cè)器及自動(dòng)進(jìn)樣裝置）：美國(guó)Thermo Fisher公司；旋渦混合器：韓國(guó)Daihan公司；實(shí)驗(yàn)?zāi)ィ讖剑?0目）：瑞典Perten公司；純水超純水系統(tǒng)：德國(guó)Sartorius公司；電子天平（分度值0.01g）：Mettler Toledo公司；玻璃纖維濾紙（Grade 934-AH，孔徑1.5μm）：Whatman公司；赭曲霉毒素A免疫親和柱：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；有機(jī)微孔濾膜（孔徑0.22μm）：Biosharp Life sciences公司。

1.3 UPLC分析條件

色譜條件為T(mén)hermo Scientific Hypersil GOLD C 1 8反相柱：100mm×2.1mm，粒徑1.9μm；流動(dòng)相：1%乙酸水-乙腈（V：V=60：40、），流速：0.25mL/min，進(jìn)樣量：4μL；柱溫：25℃；熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)333nm，發(fā)射波長(zhǎng)460nm。

1.4赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

用甲醇（色譜純）作溶劑，配制濃度分別為1.25、2.5、3.75、5ng/mL赭曲霉毒素A的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5樣品的制備

用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ⅳ髑苟舅谹陽(yáng)性小麥樣品粉碎，稱(chēng)取5.00g于離心管中，加入1.00g氯化鈉和25mL甲醇：水（V：V=80：20）提取液，旋渦混合4min，8000r/min離心10min，取上清液10mL，加入40mL水，混勻，用玻璃纖維濾紙過(guò)濾，收集25mL濾液過(guò)免疫親和柱凈化，用1mL甲醇：乙酸（V：V=49：1）洗脫，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行超高效液相色譜分析。結(jié)果計(jì)算：

式中：X為試樣中赭曲霉毒素A的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；ρ為試樣測(cè)定液中赭曲霉毒素A的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V為試樣測(cè)定液最終定容體積，單位為毫升（mL）；1000為單位換算常數(shù)；m為試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；F為稀釋倍數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)表1及圖1，保留時(shí)間為8.033min。以赭曲霉毒素A含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見(jiàn)圖2。

2.2樣品譜圖

按上述方法處理赭曲霉毒素A陽(yáng)性小麥試樣，赭曲霉毒素A色譜圖見(jiàn)圖3，保留時(shí)間為7.857min。

2.3精密度

取上述赭曲霉毒素A陽(yáng)性小麥試樣重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，該方法赭曲霉毒素A的RSD為5.99（<15%），滿足分析方法的精密度要求。

2.4加標(biāo)回收率

按表3添加20ng/mL赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液于5.00g上述赭曲霉毒素A陽(yáng)性小麥試樣（赭曲霉毒素A含量0.9184μg/kg）中，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，混勻，室溫保存過(guò)夜，測(cè)定方法回收率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由表3可知，上述條件的加標(biāo)回收率為82.9%～90.1%，RSD為5.1%～6.1%，表明測(cè)定方法有較好的可行性和準(zhǔn)確度。

2.5與國(guó)標(biāo)方法比較

用國(guó)標(biāo)的振蕩提取法提取一個(gè)樣品約30min，用本研究的漩渦提取法約4min，用時(shí)減少86.7%，更高效、快速。

用國(guó)標(biāo)的高效液相色譜法測(cè)一個(gè)樣品約16.0min，消耗乙腈8mL，用本研究的超高效液相色譜法約8min，消耗乙腈1.0mL，用時(shí)減少50%，用量減少87.5%，更節(jié)約、更環(huán)保。

3結(jié)論

文章優(yōu)化了GB 5009.96-2016中赭曲霉毒素A檢測(cè)的前處理方法和色譜條件，用甲醇：水（V：V=80：20）替代磷酸鹽緩沖液，采用更高效、便捷的漩渦法提取樣品中赭曲霉毒素A；建立了免疫親和層析凈化一超高效液相色譜法，可減少實(shí)驗(yàn)用時(shí)72.8%，減少流動(dòng)相用量87.5%，方法在1.00～20.00ng/mL時(shí)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R₂=0.9997，加標(biāo)回收率82.9%～90.1%，精密度RSD5.1%～6.1%，適用于小麥中赭曲霉毒素A含量的測(cè)定且更靈敏、高效和環(huán)保。在大批量樣品分析中可有效節(jié)約時(shí)間、材料成本，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。