天山1號(hào)冰川前緣土壤中光合細(xì)菌的分離鑒定及氮轉(zhuǎn)化能力分析

劉珍珠，樊 振，高 雁，李玉國，劉歡歡,3，馬貴軍，婁 愷，劉建偉，晁群芳，曾 軍*

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，新疆 烏魯木齊 830091；2.新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091；3.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；4.新疆天康飼料科技有限公司生物添加劑分公司，新疆 烏魯木齊 830013；5.烏魯木齊膳源生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，新疆 烏魯木齊 830037)

【研究意義】冰川前緣原生裸地是冰川退縮后暴露的一類營養(yǎng)匱乏，無植物生長，貧瘠的土壤[1]。大量研究表明土壤中氮含量是這種貧瘠土壤發(fā)育，微生物原生演替主要驅(qū)動(dòng)力和限制性因素[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】本實(shí)驗(yàn)室前期通過分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)天山1號(hào)冰川前緣土壤中氮循環(huán)功能微生物的原生演替進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該冰川前緣土壤中存在大約5 %～10 %紫色非硫光合細(xì)菌(例如，類球紅桿菌和沼澤紅假單胞菌)[1-2]。紫色非硫光合細(xì)菌(Non-sulfur Purple potosynthetic bacteria，P,SB)因其能夠在黑暗有氧和光照厭氧條件下進(jìn)行固碳、降解大分子有機(jī)物、固氮、硝化、反硝化和硫化物氧化等代謝，而被廣泛的應(yīng)用于各種有機(jī)含氮廢水處理[3]。其中，類球紅桿菌和沼澤紅假單胞菌是PSB中目前最為廣泛使用的菌株，全基因組測(cè)序結(jié)果顯示這兩種細(xì)菌包含固氮(nifH)和反硝化基因(nirK)[4]，這表明其在氮循環(huán)過程中可能起到獨(dú)特的作用。【本研究的切入點(diǎn)】本研究通過對(duì)冰川前緣土壤進(jìn)行光合細(xì)菌定向富集、分離與純化、以其能夠分離得到可培養(yǎng)菌株，通過對(duì)其生理生化和氮轉(zhuǎn)化(氨氮和硝酸鹽降解以及亞硝酸鹽的生成)能力進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為揭示冰川前緣土壤氮素循環(huán)提供模式菌株以及為環(huán)境有機(jī)污染物降解和修復(fù)提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌種來源：光合細(xì)菌分離自新疆天山1號(hào)冰川退縮后新暴露出的土壤(43°06′N, 86°49′E))。培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基為RCVBN培養(yǎng)基[5]：乙酸鈉3 g；丙酸鈉1 g；硫酸銨1 g；硫酸鎂0.2 g；氯化鈉1.0 g；磷酸二氫鉀0.3 g；磷酸氫二鉀0.5 g；氯化鈣0.05 g；酵母膏0.1 g；微量元素1 mL；蒸餾水1000 mL；pH 7.0。分離、純化培養(yǎng)基：RCVBN固體培養(yǎng)基，添加1.5 %瓊脂。儀器：超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)、滅菌鍋(YXQ-LS-75)、紫外分光光度計(jì)(UV-2550)、pH儀(多參數(shù)測(cè)試儀S220)、電子天平(JY20002)、離心機(jī)(20PR-52)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 光合細(xì)菌的富集 稱取5 g冰川前緣土壤加入至250 mL 的錐形瓶中，加入滅菌的液體RCVBN培養(yǎng)基至瓶口，使用無菌的液體石蠟封口隔絕空氣，放入25 ℃的光照強(qiáng)度為3000～5000 lx的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。觀察瓶中培養(yǎng)基是否出現(xiàn)明顯的紅色，粉紅色或黃色。待培養(yǎng)基變色后重復(fù)2～3次轉(zhuǎn)接，直到瓶中光合細(xì)菌占明顯優(yōu)勢(shì)后，進(jìn)行下一步平板分離和純化。

1.2.2 光合細(xì)菌的分離與純化 采用雙層瓊脂平板法，按照10倍逐級(jí)稀釋富集液，將10-5，10-6兩個(gè)梯度的稀釋液用移液槍吸取100 μl于固體RCVBN平板上，用涂布棒均勻涂布，室溫放置30 min，待菌液被培養(yǎng)基吸收完畢后，平鋪一層無菌液體瓊脂封閉，其凝固后，將平板置于30 ℃光照強(qiáng)度為3000～5000 lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待平板中長出紫色菌落后，挑取不同生長速度的單菌落進(jìn)行純化。

1.2.3 分離純化菌株生長形態(tài)觀察 在純化培養(yǎng)基上對(duì)已純化的光合細(xì)菌菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，革蘭氏染色和顯微鏡觀察。

1.2.4 活細(xì)胞吸收光譜測(cè)定 取培養(yǎng)7 d的菌液5 mL加入到離心管中，8000 r/min離心10 min，棄上清，加入無菌生理鹽水反復(fù)洗滌2次并離心，棄上清，加入60 %蔗糖溶液充分溶解后定容至10 mL，以60 %蔗糖溶液為空白對(duì)照，在波長300～900 nm范圍內(nèi)測(cè)定吸光值，繪制吸光度曲線。

1.2.5 生長性能測(cè)定 為研究其生長規(guī)律，測(cè)定光合細(xì)菌的生長曲線。取容量為2.5 L的透明塑料袋，置于超凈工作臺(tái)下開紫外殺菌3 h，加入2 L滅菌后的液體培養(yǎng)基，隨后挑取純化后的單菌落加入液體培養(yǎng)基中，混勻。將透明塑料袋中的空氣排空后封口。培養(yǎng)方法同1.2.2，每24 h超凈工作臺(tái)中吸取菌液10 mL使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸光度值。

1.2.6 最適生長pH測(cè)定 將純化后單菌落的菌液分別取1 mL加入到液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH梯度分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0進(jìn)行培養(yǎng)。每隔24 h取樣測(cè)量OD600nm值，共培養(yǎng)7 d。

1.2.7 分子生物學(xué)鑒定 結(jié)合16S rDNA基因序列比對(duì)分析進(jìn)行鑒定。上游引物27F: 5’-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3’,下游引物1492R: 5’-GGT-TACCTTGTTACGACTT-3’。擴(kuò)增體系(50 μl): 上下游引物各1 μl, 模板DNA 3 μl，Mix 25 μl，Taq酶20 μl。擴(kuò)增條件: 預(yù)變性95 ℃ 2 min；35個(gè)循環(huán)包括變性95 ℃ 20 s，引物退火 58 ℃ 20 s,引物延伸 72 ℃ 1 min；最后延伸72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，交由昆泰銳生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)，并下載序列相似性最高菌株。利用MEGA軟件[8]對(duì)光合細(xì)菌16S rDNA序列同源性相近的其他光合細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖1 5株光合細(xì)菌的活菌吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of five photosynthetic bacteria

1.2.8 光合細(xì)菌氮轉(zhuǎn)化能力比較 氨轉(zhuǎn)化能力的比較：為排除有機(jī)氮降解產(chǎn)生的氨氮對(duì)硝化速率的影響，硝化速率測(cè)定在RCVBN液體培養(yǎng)基中去除酵母浸粉。連續(xù)監(jiān)測(cè)15 d，每天同一時(shí)間取樣檢測(cè)氨氮[6,9]，亞硝氮[7,10]，硝態(tài)氮含量[11]。反硝化能力(硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化能力)比較，為了消除培養(yǎng)基中有機(jī)氮對(duì)研究的影響，反硝化能力測(cè)定同樣在RCVBN液體培養(yǎng)基中去除酵母浸粉，并且培養(yǎng)基中的1 g/L硫酸氨換成1 g/L硝酸鉀。

接種：取生長指數(shù)期光合細(xì)菌，12 000 r/min離心10 min，棄去上清使用0.9 %生理鹽水懸浮菌體，共清洗3次，然后將20 g菌泥接種于2 L培養(yǎng)基中(1 %，W/V)，搖勻，放入25 ℃的光照強(qiáng)度為3000～5000 lx的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 光合細(xì)菌的分離與鑒定

2.1.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 在RCVBN瓊脂平板上共分離得到5株紫色菌株，分別命名為1Y、241、LG、G6和GZ。革蘭氏染色結(jié)果顯示5株菌都為革蘭氏陰性桿狀菌。

圖2 5株光合細(xì)菌生長曲線Fig.2 Growth curve of five photosynthetic bacteria

2.1.2 活細(xì)胞吸收光譜測(cè)定 將5株菌的菌液在波長300～900 nm范圍內(nèi)測(cè)定其吸光度值(圖1)。與蔗糖對(duì)照相比5株菌在波長300～900 nm范圍內(nèi)有4個(gè)特征峰，分別位于480、510、590和810 nm處。

2.1.3 生長速率比較 由圖2顯示，5株菌的生長速率比較，它們的生長趨勢(shì)基本一致，接種后2 d內(nèi)為生長遲滯期。3～7 d為生長指數(shù)期，8～10 d內(nèi)為生長穩(wěn)定期，第10天開始衰退。菌株GZ和LG的生長速度略高于其余3株菌。

2.1.4 最適生長pH測(cè)定 絕大多數(shù)光合細(xì)菌最適生長pH為7.0，pH低于5.5明顯不生長，超過8.5生長明顯被抑制。如圖3所示，菌株1Y、LG和GZ在pH7.0左右菌體濃度最高。菌株241在pH為6.0左右菌體濃度最高。菌株G6在pH 8.5左右菌體濃度最高。

2.2 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖4顯示， 5株菌中1Y、241、G6和GZ與類球紅桿菌(Rhodobactersphaeroides)基因登錄號(hào)NR029215相似性為99.3 %。菌株LG與沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris，基因登錄號(hào)NR115542)相似性為100 %。

圖3 pH對(duì)5種菌株的生長影響Fig.3 Effect of pH on growth of five strains

2.3 光合細(xì)菌的氮轉(zhuǎn)化能力比較

2.3.1 氨氮轉(zhuǎn)化能力比較 將5株菌培養(yǎng)在去除酵母浸粉的RCVBN液體培養(yǎng)基中，連續(xù)監(jiān)測(cè)15 d。氨氮降解動(dòng)態(tài)變化結(jié)果如圖5所示，其中轉(zhuǎn)化能力最高的是菌株LG，轉(zhuǎn)化率為65.7 %，其次是菌株GZ，轉(zhuǎn)化率為56.22 %。菌株G6的轉(zhuǎn)化率為55.9 %，菌株1Y的轉(zhuǎn)化率為53.99 %，最少的是菌株241，轉(zhuǎn)化率為53.93 %。從圖5A中可看出，前7 d菌株LG的轉(zhuǎn)化速率最快為46.78 %，其次是菌株1Y轉(zhuǎn)化速率為40.13 %，菌株GZ為34.6 %，菌株G6為13.14 %，菌株241的轉(zhuǎn)化速率最慢，為3.58 %。

5株菌降解氨氮生成亞硝酸鹽動(dòng)態(tài)變化如圖5B所示。從第3 天開始，菌株1Y，241，LG亞硝酸根的轉(zhuǎn)化量有所增加，但在第7天菌株1Y，GZ轉(zhuǎn)化的亞硝酸鹽量高達(dá)1.2和2.5 mg/L占整個(gè)降解的氨氮的0.14 %～0.2 %。硝酸鹽生成量監(jiān)測(cè)結(jié)果如圖5C所示，硝酸鹽生成高峰在培養(yǎng)第8～12天，生成量最高為0.4～0.5 mg/L。另外，在整個(gè)培養(yǎng)期間，并未檢測(cè)到有氣體生成。

2.3.2 反硝化能力比較 從圖6可以看出，對(duì)5株菌的反硝化轉(zhuǎn)化能力進(jìn)行檢測(cè)，在以硝酸鹽為唯一氮源情況下(RCVBN培養(yǎng)基不添加酵母粉)，連續(xù)取樣15 d分別檢測(cè)硝酸根的轉(zhuǎn)化和亞硝酸根的生成。從圖6A可以看出，菌株G6對(duì)硝酸根的轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，轉(zhuǎn)化率為95.79 %。菌株LG對(duì)硝酸根的轉(zhuǎn)化能力次之，轉(zhuǎn)化率為95.58 %。菌株1Y對(duì)硝酸根的轉(zhuǎn)化率為94.99 %。菌株GZ對(duì)硝酸根的轉(zhuǎn)化率為87.73 %。菌株241對(duì)硝酸根的轉(zhuǎn)化能力最弱，為69.96 %。亞硝酸鹽的生成如圖6B所示，從培養(yǎng)時(shí)間第7天開始，第8～9天亞硝酸鹽的積累達(dá)到頂峰。其中，菌株GZ的生成量最高，為11.19 mg/L。其次是菌株G6為10.77 mg/L，菌株241的生成量最低為4.10 mg/L。

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)通過雙層瓊脂平板法分離純化出5株純菌株，經(jīng)革蘭氏染色與活細(xì)胞吸收光譜測(cè)定，5株菌都為革蘭氏陰性菌，并且在480 和510 nm處有吸收峰，說明活菌中含有類胡蘿卜素[12]；在590 nm處有吸收峰，說明活菌中含有細(xì)菌葉綠素a；光合細(xì)菌的吸收光譜主要受類胡蘿卜素和細(xì)菌葉綠素a的影響。在790～1030 nm之間的810 nm處有吸收峰，綜合這幾處吸收峰結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的紫色非硫光合細(xì)菌的吸收峰完全一致[12]。進(jìn)一步的基于16S rRNA基因測(cè)序的分子生物學(xué)鑒定，NCBI數(shù)據(jù)庫上其他同源性序列的進(jìn)化樹分析，進(jìn)一步的確定了這五株菌為紫色非硫光合細(xì)菌，并且1Y、G6、241和GZ為類球紅桿菌，LG為沼澤紅假單胞菌。最適pH檢測(cè)結(jié)果顯示大部分菌株在pH 7.0的培養(yǎng)環(huán)境下菌濃度最高，說明光合細(xì)菌喜好中性偏堿的生長環(huán)境，這一結(jié)果也與其所處的冰川前緣新暴露出的土壤普遍偏弱堿性(pH>7.5)有關(guān)[2,4]。

圖4 光合細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of the photosynthetic bacteria

A:氨氮降解；B:亞硝酸鹽；C:硝酸鹽生成動(dòng)態(tài)變化圖5 株光合細(xì)菌對(duì)氨氮的降解Fig.5 Dynamic changes of ammonia nitrogen degradation, nitrite and nitrate production by the five strains

A：亞硝酸鹽的生成；B:亞硝酸鹽生成動(dòng)態(tài)變化圖6 5株菌對(duì)硝酸根的轉(zhuǎn)化Fig.6 Dynamic changes of denitrification

這5株菌對(duì)氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化結(jié)果可知，在以(NH4)2SO4為唯一氮源情況下，其能夠?qū)⒔^大多數(shù)的氨用于菌體生長，繁殖，僅有少部分氨被轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和硝酸鹽。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這類光合細(xì)菌在冰川0年土壤固氮微生物中相對(duì)豐度占10 %左右[4]，因此推測(cè)其可能對(duì)推動(dòng)冰川前緣早期土壤發(fā)育具有重要作用。這5株菌的反硝化能力測(cè)定結(jié)果顯示，其能夠在以硝酸鹽為唯一氮源的RCVBN培養(yǎng)基上生長，并且隨著硝酸鹽的被利用，亞硝酸鹽的量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且在短暫的時(shí)間內(nèi)降低，這可能與沼澤紅假單胞菌和類球紅桿菌被報(bào)道具亞硝酸鹽還原酶基因(nirK)有關(guān)[13-15]。本研究培養(yǎng)期間也發(fā)現(xiàn)密閉培養(yǎng)容器內(nèi)有大量氣體生成，經(jīng)定性檢測(cè)氣體主要是以N2為主，N2O，NH3，CO2。此外，菌體量也有所增加，但增加幅度不高，表明光合細(xì)菌雖然可以利用硝態(tài)氮，但利用硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為菌體蛋白率較低，硝態(tài)氮主要是通過反硝化作用生成氮?dú)?，氧化亞氮，氨氣等方式損失，但其對(duì)氮損失過程中的貢獻(xiàn)量，需要進(jìn)一步的研究。

本研究從新疆天山1號(hào)冰川前緣土壤中分離到的紫色非硫光合細(xì)菌純菌株，據(jù)其特殊的低溫生長環(huán)境可推測(cè)，而本研究所分離得到的菌株可能屬于低溫菌；并且對(duì)其氨氮和硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化活性進(jìn)行了研究，揭示了其對(duì)氨氮的高固定率和硝態(tài)氮的反硝化過程，為揭示冰川前緣土壤發(fā)育過程中氮素循環(huán)具有重要參考價(jià)值，并且這一研究結(jié)果在國內(nèi)外目前尚屬首次。此外，由于紫色非硫光合細(xì)菌已被廣泛的應(yīng)用于諸如高化學(xué)需氧量(COD)，氨氮的有機(jī)廢水處理和資源化等方面研究，因此其可以作為低溫污染物修復(fù)提供高效菌種的依據(jù)。