火龍果成年植株莖段直接誘導不定芽快繁體系建立

鄧仁菊，范建新，王永清，劉 濤，金吉芬，彭志軍

(1. 貴州省農業(yè)科學院 生物技術研究所，貴州 貴陽 550006；2. 貴州省農業(yè)科學院 亞熱帶作物研究所，貴州 貴陽 550006；3. 四川農業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130；4. 貴州省農業(yè)科學院 果樹科學研究所，貴州 貴陽 550006；5. 貴州省農業(yè)科學院 品種資源研究所，貴州 貴陽 550006)

【研究意義】火龍果為仙人掌科三角柱屬多年生攀援性肉莖植物，是集水果、花卉、營養(yǎng)、保健于一身的熱帶亞熱帶名優(yōu)水果，也是一種耐瘠、耐旱的高產經濟作物[1]。目前，火龍果大田生產主要采用15～20 cm莖段扦插繁殖或直接采用50 cm以上大苗定植[2-3]，但這種方法在遺傳母本優(yōu)良性狀的同時，特別容易攜帶母本病原體，且繁殖效率低下，耗時較長，插枝易于腐爛。組織培養(yǎng)可以在相對較短的時間和有限的空間內，利用較少的原材料快速獲得大量健康的無菌苗[4]?！厩叭搜芯窟M展】目前，國內外已有關于火龍果組織培養(yǎng)方面的相關報道，并建立了火龍果快繁的相關體系[5-13]?！颈狙芯壳腥朦c】但絕大數有關此方面的研究都是通過種子萌發(fā)的子葉、莖段或幼苗等直接誘導成苗[5,8,14-15]，其后代可能會因種子的基因型不同而出現千差萬別的類型。另外，不同基因型的火龍果品種對同一培養(yǎng)條件也存在較大差別[16-18]，因此，需要不斷改進培養(yǎng)方案來適應更多基因型的火龍果快速增殖。為建立高效的火龍果快繁體系和更好地保存母本優(yōu)良性狀，在前人研究基礎上，以不同類型成年火龍果植株為試材，研究了不同生長調節(jié)劑及配比、基本培養(yǎng)基濃度、外植體類型等對莖段不定芽誘導的影響，篩選出最適不定芽增殖、生根及移栽的培養(yǎng)條件?！緮M解決的關鍵問題】以期為火龍果的工廠化育苗及采用生物技術遺傳改良提供參考和奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以貴州主栽火龍果品種晶紅龍、紫紅龍和粉紅龍3年生成年植株的1年生枝條為試材。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長調節(jié)劑配比對不定芽誘導的影響 以紫紅龍火龍果1年生枝條為試材，消毒滅菌后，將外植體切割成約1 cm×1 cm左右大小的莖段，每個莖段帶1個完整的刺座，分別接種在MS附加不同濃度6-BA (0.5、1.0和2.0 mg/L)和2, 4-D (0.1、0.2和0.5 mg/L)的培養(yǎng)基上。采用2因素3水平試驗設計，共9個處理，每處理接種120個外植體，30 d后統(tǒng)計不定芽誘導率。

1.2.2 基本培養(yǎng)基濃度及外植體類型對不定芽誘導的影響 以紫紅龍火龍果1年生枝條為試材，消毒滅菌后，將外植體切割成3種類型：帶刺座含小刺和絨毛的莖段、帶刺座抹掉小刺和絨毛的莖段和不帶刺座莖段，然后分別接種于不同濃度(MS、1/2MS、1/4MS和1/8MS)的基本培養(yǎng)基上，共12個處理，每處理接種90個外植體，30 d后統(tǒng)計不定芽誘導率。

1.2.3 不同基因型火龍果對不定芽誘導的影響 以晶紅龍、紫紅龍和粉紅龍3種不同基因型火龍果成年植株的1年生枝條為試材，消毒滅菌后，將外植體切割成1 cm×1 cm左右大小的莖段，每個莖段帶1個完整刺座，接種在MS+6-BA 2.0 mg/L+2, 4-D 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，共3個處理，每處理接種120個外植體，30 d后統(tǒng)計不定芽誘導率。

1.2.4 火龍果不定芽的增殖培養(yǎng) 不定芽的增殖培養(yǎng)基以MS附加不同濃度的6-BA (0.5、1.0和2.0 mg/L) 、NAA (0.1、0.2和0.3 mg/L)和Tryptone (250、500和750 mg/L)。采用3因素3水平正交試驗設計，共9個處理，每處理接種45個外植體。接種后觀察并記錄芽苗增殖及生長情況，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計其增殖系數和芽苗長勢。

1.2.5 火龍果不定芽的生根培養(yǎng) 當增殖的叢芽長到2 cm左右時，將其切割成單個轉接到生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基以MS附加不同濃度的6-BA (0.5、1.0、2.0和4.0 mg/L)、NAA (0.1、0.2、0.3和0.5 mg/L)、CCC (矮壯素，0.5、1.0、1.5和2.0 mg/L)及AC(活性碳，0、0.01、0.03和0.05 mg/L)。釆用4因素4水平試驗設計，共16個處理，每個處理接種135個外植體。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根率、平均生根條數及平均根長。

1.2.6 火龍果煉苗與移栽 移栽前，在培養(yǎng)室內將生根后的無菌苗揭膜煉苗3～5 d后從瓶中取出，清洗干凈根部的培養(yǎng)基；移栽時，先用0.2 %多菌靈消毒處理基質，再將其裝入塑料盆中，每盆移栽1株苗，置溫室中培養(yǎng)，每15 d噴施0.1 %～0.2 %的磷酸二氫鉀溶液1次，60 d后統(tǒng)計其成活及生長情況。

1.3 數據處理與統(tǒng)計分析

不定芽誘導率 = (誘導出不定芽的外植體/接種成活的外植體)×100 %

不定芽增殖系數 = 增殖總芽苗數/接種前芽苗數

生根率= (生根無菌苗/接種無菌苗)×100 %

移栽成活率=(移栽成活數/移栽總數)×100 %

所有數據均采用EXCEL 2016和DPSv 7.05進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 火龍果不定芽的誘導情況

2.1.1 生長調節(jié)劑配比對火龍果不定芽誘導的影響 從表1和圖1看出，不同生長調節(jié)劑濃度及配比對外植體的成活及不定芽誘導都有一定影響。以外植體的成活數量為基數，各處理中不定芽的誘導率都在70 %以上。外植體成活率最高的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，達93.3 %；不定芽誘導率最高的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，達89.1 %。

2.1.2 基本培養(yǎng)基濃度和外植體類型對不定芽誘導的影響 從表2看出，外植體含有小刺和絨毛的完整刺座，其不定芽誘導率顯著高于抹去小刺和絨毛的外植體，不帶刺座的外植體沒有誘導出不定芽。另外，無論外植體是否去掉刺座，均以MS基本培養(yǎng)基的不定芽誘導率最高，且顯著高于1/2MS、1/4MS和1/8MS。

表1 不同生長調節(jié)劑配比火龍果不定芽的誘導情況

注：同列不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.05 level. The same as below.

表2 不同基本培養(yǎng)基和外植體類型火龍果不定芽的誘導情況

2.1.3 不同基因型外植體對不定芽誘導的影響 從表3看出，對于3種不同類型的外植體，莖段接種后一般在18～25 d開始出新芽，且不定芽的誘導率均在80 %以上。其中，紫紅龍莖段的不定芽誘導率最高(88.2 %)，出芽時間最早，接種18 d左右，刺座處開始冒出新芽點。晶紅龍和粉紅龍莖段的不定芽誘導率沒有顯著差異，但出芽時間以晶紅龍早于粉紅龍。

圖1 火龍果莖段直接誘導不定芽的生長情況Fig.1 Induction of adventitious bud directly from stem of mature pitaya

表3 不同基因型外植體火龍果不定芽的誘導情況

表4 不同處理火龍果不定芽的增殖培養(yǎng)情況

注：表中“+”為芽苗生長差，“++”為芽苗生長一般，“+++”為芽苗生長良好，下同。

Note: +, ++ and +++ represent poor growth, general growth, good growth respectively. The same as below.

2.2 火龍果不定芽的增殖培養(yǎng)情況

火龍果不定芽轉接至增殖培養(yǎng)基中10～15 d后，不定芽的刺座處開始萌動；培養(yǎng)30 d左右時已形成叢生芽。從表4看出，不同生長激素濃度及配比對火龍果不定芽增殖的影響差異較大，當MS培養(yǎng)基中附加6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+Tryptone 500 mg/L時，不定芽的增殖系數最高，為 5.74，長勢較好(圖2A)；其次為MS培養(yǎng)基附加 6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ Tryptone 250 mg/L時，增殖系數為 5.36；MS培養(yǎng)基附加6-BA 2.0 mg/L+NAA 0. 5 mg/L+Tryptone 250 mg/L時，增殖系數最低，僅1.93，不定芽長勢相對較弱(圖2 B )。結合增殖系數及不定芽長勢認為，適宜試驗火龍果不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1～0.2 mg/L+Tryptone 250～500 mg/L，增殖系數都在5.0以上。

2.3 火龍果不定芽的生根培養(yǎng)情況

將不定芽接種在含不同生長調節(jié)劑濃度的培養(yǎng)基上，15 d左右開始長根。由表5可知，在適宜的培養(yǎng)基中添加一定濃度的活性碳 (AC) 有利于促進生根，而添加一定濃度的矮壯素 (CCC) 有利于芽苗的粗壯。當MS培養(yǎng)基附加生長調節(jié)劑6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L+CCC 0.5～1.0 mg/L+AC 0.03 %～0.05 % 時，不定芽的生根率在98 %以上，平均生根條數6.8～7.0條，平均根長6.7～7.4 cm，根和苗都生長健壯(圖3)；MS培養(yǎng)基附加生長調節(jié)劑6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+CCC 1.5 mg/L的火龍果不定芽生根率最低，僅34.3 %，平均生根條數和平均根長分別為2.8條和6.6 cm，根和苗的長勢一般。

圖2 火龍果不定芽分化及生長Fig.2 Adventitious bud differentiation and growth of pitaya

表5 不同生長調節(jié)劑濃度配比火龍果的生根情況

2.4 火龍果的煉苗與移栽情況

從表6和圖4看出，無菌苗對環(huán)境的適應能力較強，各處理火龍果無菌幼苗的成活率均在85 %以上。成活率帶根移栽苗的略高于不帶根移栽苗的。總的來講，珍珠巖∶腐殖土為2∶1和蛭石∶腐殖土為1∶1處理移栽的無菌苗全部成活，60 d的平均生長高度為3.5 cm；僅用珍珠巖移栽的無菌苗成活率最低，為86.7 %，60 d后平均生長高度為1.2 cm；直接采用大田土移栽成活率也能完全成活，但生長相對緩慢。

3 討 論

前期研究表明，采用火龍果成年植株莖段誘導愈傷組織進行再分化比較困難[19]，且直接利用莖段誘導不定芽再進行快繁增殖的研究相對也較多。結果表明，外植體上保留完整刺座，即帶小刺和絨毛，其不定芽誘導率最高 (85.1 %)，顯著高于帶刺座而抹掉刺座上小刺和絨毛的外植體；不帶刺座的外植體不能直接誘導出不定芽。研究結果與彭綠春等[12]的研究結論相似，這可能由于刺座處含有不定芽生長的原基，在抹掉刺座處的小刺和絨毛過程中，可能會對不定芽原基造成一定損傷，或直接拔掉了不定芽原基，而影響不定芽的再生。另外，植物生長調節(jié)劑也是影響不定芽誘導成功率的主要因素之一。周傳明等[20]的結果表明，MS基本培養(yǎng)基附加生長調節(jié)劑6-BA 2.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L時，有利于提高不定芽的誘導率；MS培養(yǎng)基附加生長調節(jié)劑6-BA 12.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L時，有利不定芽的誘導增殖和繼代培養(yǎng)。彭綠春等[12]的研究表明，適宜火龍果不定芽誘導的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2～4 mg/L+NAA 0.1 mg/L和MS+TDZ 0.4～0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L，誘導成功率達80 %；不定芽增殖系數最高的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖系數可達6.4。HUA等[10]研究認為，ZT生長素對莖段不定芽的誘導和生長具有明顯促進作用，效果優(yōu)于常規(guī)用的TDZ、6-BA和2,4-D等植物生長調節(jié)劑。研究結果與彭春綠[12]的較接近，莖段不定芽誘導率最高的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；不定芽增殖系數最高的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+Tryptone 500 mg/L。不同基因型的火龍果外植體，在同一培養(yǎng)基中的不定芽誘導率也存在一定差異，這可能與不同的基因調控有關[9]。總的來講，3種基因型的火龍果莖段不定芽的誘導率都在80 %以上，以紅皮紅肉型的紫紅龍火龍果莖段的不定芽誘導率最高，紅皮白肉型的晶紅龍和紅皮粉肉型的粉紅龍火龍果莖段的不定芽誘導率差異不明顯。另外，相對其他植物而言，火龍果無菌苗的生根和移栽都較容易，即使未帶根移栽成活率也在90 %以上，說明火龍果對土壤環(huán)境的適應力較強，但在透氣性較好的土壤中生長更佳。

圖3 火龍果不定芽生根培養(yǎng)Fig.3 Rooting culture of adventitious buds of pitaya

表6 不同基質配比處理火龍果無菌幼苗的生長情況

4 結 論

通過火龍果成年植株莖段直接誘導不定芽的研究表明，利用帶完整刺座(包括小刺和絨毛)的莖段直接誘導不定芽的成功率較高，培養(yǎng)周期較短，生根移栽較易；不帶刺座的莖段不能直接誘導出不定芽。適宜火龍果不定芽誘導的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L，不定芽增殖系數最高的培養(yǎng)基為MS + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L+Tryptone 500 mg/L；適宜不定芽生根的培養(yǎng)基為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L+CCC 0.5～1.0 mg/L+AC 0.03 %～0.05 %；基質采用珍珠巖∶腐殖土為2∶1或蛭石∶腐殖土為1∶1進行配比，火龍果無菌幼苗移栽成活率最高、長勢較好。

圖4 火龍果無菌苗煉苗與移栽Fig.4 Climatization and transplanting of pitaya plantlets