白及屬3個(gè)種花部特征和花粉形態(tài)的掃描電鏡觀察比較

張雅瓊，黃 莉，尹元萍，劉 萍，董蓉嬌，彭進(jìn)喬，楊曉菲，梁 泉*

(1. 云南中醫(yī)藥大學(xué), 云南 昆明 650500；2.中國西南野生生物種質(zhì)資源庫，云南 昆明 650204；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

【研究意義】白及屬(Bletilla)為蘭科(Orchidaceae)多年生草本植物，不僅具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，亦是中國重要的中藥材之一。白及屬全世界約有6種[1]，中國該屬植物有 4 種，分別為白及[Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.]、小白及[Bletillaformosana(Hayata)Schltr.]、華白及[Bletillasinensis(Rolfe)Schltr.]、黃花白及[BletillaochraceaSchltr.][2]。白及屬植物藥用歷史已有千年，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，以干燥塊莖入藥，既具有收斂止血、消腫生肌的傳統(tǒng)功效作用[3-5]，又在抗菌及抗癌方面顯示出了新的活性[6-7]。姚宗凡等[8]比較了白及屬4個(gè)種，認(rèn)為紫紅花的大種白及[B.striata(Thunb.)Rchbf.]藥效最好。目前，中國藥典收載的僅 1種，即白及[Bletillastrata.(Thumb.)Rchbf.]。白及屬植物在中國分布于北起灌南、江蘇至臺(tái)灣，東起浙江至西藏東南部等地[1]。雖然民間習(xí)用藥材由來已久，但從2014年才開始大規(guī)模人工種植[9]。因生態(tài)環(huán)境和遺傳基礎(chǔ)不同，以及由于人工種植歷史短，未經(jīng)過長期嚴(yán)格的人工選擇，在種間和種內(nèi)其形態(tài)和基因型均保留了較高的多樣性。近年來，由于白及用量的增加，價(jià)格也不斷上升，大量混偽品也隨之進(jìn)入市場(chǎng)，對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的品質(zhì)和功效造成較大影響[9]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】花粉攜帶有種子植物大量的遺傳信息，其表型特征可以作為植物分類的重要依據(jù)。王彩霞等[10]詳細(xì)觀察和描述了白及花的外部特征，田愛梅等[11]對(duì)白及花粉和種子進(jìn)行了掃描電子顯微比較，王明君等[12]對(duì)白及屬4個(gè)種種子進(jìn)行了掃描電鏡形態(tài)學(xué)觀察，也有利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)白及屬植物資源進(jìn)行遺傳多樣性分析[13-16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】種間或?qū)偻獾膮^(qū)分度較高，種內(nèi)分類依據(jù)尚未明確。國內(nèi)外關(guān)于白及屬花粉顯微形態(tài)比較的研究尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】擬對(duì)白及屬3個(gè)種的花粉形態(tài)進(jìn)行電鏡掃描比較分析，為白及屬植物形態(tài)學(xué)分類研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為白及屬的3個(gè)種：①白及：白及(白花，B1)、白及(良寶大白及1號(hào)，云種鑒定 2014023號(hào)，桃紅，B2)、白及(皖白及1號(hào)，皖 S-SV-BS-023-2014，玫瑰紅，B3)，共3個(gè)品種(品系)。②黃花白及(B4)：分別來自陜西漢中、云南昭通市、云南大理市的3個(gè)品系；③小白及(B5)：分別來自云南鎮(zhèn)沅縣、云南祿勸縣、云南大理市的3個(gè)品系。

植物鑒定由梁泉和黃莉完成，并統(tǒng)一種植于白及屬植物種質(zhì)資源圃。

供試品種(品系)花色見圖1(封三)。

1.2 試驗(yàn)方法

(1)取樣。選擇3年生白及屬植物，隨機(jī)取樣10株，測(cè)量株高、葉片和花朵等器官相關(guān)性狀，取平均值。在白及3個(gè)品種(系)及黃花白及、小白及的每個(gè)品系中分別選取典型的花朵樣品20朵，調(diào)查其花部特征性狀，取平均值。

(2)電子掃描顯微鏡觀察。供試材料花粉成熟后采集新鮮花朵，采用常溫硅膠干燥法對(duì)花朵進(jìn)行干燥，將新鮮花朵裝入硫酸紙袋，然后放入有變色硅膠的密封盒內(nèi)干燥保存24～72 h。將經(jīng)過硅膠干燥處理的花粉分散撒到粘有雙面膠的樣臺(tái)上，將粘有花粉的載物銅臺(tái)放入SBC-2離子濺射儀中噴鍍鉑金，置于SS-570 型掃描電子顯微鏡下，在7kV加速電壓下對(duì)花粉的形狀、外壁紋飾等進(jìn)行觀測(cè)拍照，并測(cè)量單?；ǚ鄣臉O軸長(P) 、赤道軸長(E)。

(3)形態(tài)描述。形態(tài)描述的方法及專業(yè)術(shù)語參照王伏雄等[17]文獻(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物學(xué)形態(tài)特征比較

從表1中發(fā)現(xiàn)， B1、B2和B3是3個(gè)不同花色的白及品種(系)，分別為白花、桃紅和玫瑰紅。植株高36.5～70.4 cm，品種(系)之間有差異；葉長4.5～45.1 cm，寬1.8～5.9 cm；B1、B2和B3葉片夾角分別為52.67°、35.64°和56.67°；花序軸長103.5～288.6 cm，有花3～10朵；花直徑44.5～56.7 mm；花苞片長16.8～19.3 mm；花瓣長28.6～32.6 mm，寬6.9～7.6 mm；萼片長24.2～29.2 mm，寬6.1～7.2 mm；唇瓣長24.1～27.1 mm，寬8～12 mm；蕊柱長20.0～21.6 mm；子房長18.6～20.9 mm。

表1 白及、黃花白及和小白及植物學(xué)特征比較

續(xù)表1(Continued table 1)

項(xiàng)目Item白及(B.striata)黃花白及(B.ochracea)小白及(B. formosana)B1B2B3B4B5范圍Range平均Average范圍Range平均Average范圍Range平均Average范圍Range平均Average范圍Range平均Average葉片夾角(°)43.7～64.552.67±3.4532.1～43.435.64±3.6744.6～62.356.67±4.2254.3～70.460.43±4.5617.5～32.424.45±2.21花色白White桃紅Pink 玫瑰紅Purple黃Yellow紫紅Purple花序軸長(cm)103.5～256.4178.5±20.4145.5～288.6245.6±25.2125.4～278.4256.2±24.8132.4～297.8273.42±18.46143.5～267.8214.63±16.54著生花朵(朵)4～94.65±1.244～106.87±1.453～105.89±1.673～83.45±0.523～83.25±0.44花直徑(mm)44.5～52.249.67±4.7247.3～54.452.43±3.5646.6～56.754.67±3.6232.6～40.335.65±1.8728.9～36.832.43±1.64苞片長(mm)16.8～18.317.85±2.2117.2～18.918.63±1.6716.7～19.318.46±2.0418.4～20.419.54±0.669.8～13.610.66±0.45花瓣長(mm)28.6～30.829.35±1.4529.5～31.230.46±0.8729.4～32.631.28±0.6418.3～22.821.48±2.0615.8～21.120.78±2.03花瓣寬(mm)6.9～7.47.05±0.147.1～7.67.25±0.167.1～7.67.30±.0165.2～6.96.35±0.224.4～6.15.23±0.26中萼片長(mm)27.6～29.828.46±1.2428.7～31.430.08±2.2329.2～31.430.65±2.4618.2～22.721.27±2.1415.2～21.220.28±1.24中萼片寬(mm)6.6～7.16.76±0.246.7～7.27.03±0.226.7～7.27.08±0.185.1～7.06.28±0.264.3～6.05.18±0.16側(cè)萼片長(mm)24.2～25.224.68±1.8724.6～26.426.04±2.3424.6～26.425.88±2.4518.2～22.421.24±1.8715.3～20.920.23±1.14側(cè)萼片寬(mm)6.1～6.46.22±0.436.2～6.56.46±0.656.2～6.76.57±0.875.1～6.86.32±0.344.2～6.05.21±0.22唇瓣長(mm)24.1～25.624.46±1.7824.5～26.525.89±2.2124.6～27.125.96±3.4616.4～25.223.35±1.6515.2～17.816.43±1.12蕊柱長(mm)20.0～20.920.12±0.6520.2～21.521.04±0.8720.2～21.621.07±1.0213.4～14.814.13±0.8412.2～13.212.54±0.32子房長(mm)18.6～20.119.64±0.6419.1～20.819.87±0.8219.3～20.919.76±1.028.5～12.111.02±0.748.2～12.210.45±0.63

表2 白及、黃花白及和小白及植物學(xué)特征區(qū)別

A：花粉囊；B：白及(白花，B1)花粉(2000倍)；C：白及(桃紅，B2)花粉(2000倍)；D：白及(玫瑰紅，B3)花粉(2000倍)；E：黃花白及(1980倍)；F：小白及(2000倍)A: The anther structure of B. striata; B: B1(2000×); C: B2(2000×); D: B3(2000×); E: B4(1980×); F: B5(2000×)圖2 白及、黃花白及和小白及的花粉形態(tài)Fig.2 The pollens morphology of B.striata, B.ochracea and B. formosana

黃花白及植株高40.8～50.4 cm；葉長3.1～35.2 cm，寬1.8～3.7 cm；葉片夾角為60.43°；花序軸長132.4～297.8 cm，有花3～8朵，黃色；花直徑32.6～40.3 mm；花苞片長18.4～20.4 mm；萼片與花瓣幾乎等長，18.2～22.7 mm，寬5.1～6.9 mm；唇瓣長16.4～25.2 mm，寬8～11 mm；蕊柱長13.4～14.8 mm；子房長8.5～12.1 mm。

小白及植株高19.2～40.6 cm；葉長3.8～22.5 cm，寬0.9～2.2 cm；葉片夾角為24.45°；花序軸長143.5～267.8 cm，有花3～8朵，紫色；花直徑28.9～36.8 mm；花苞片長9.8～13.6 mm；萼片與花瓣幾乎等長，15.2～21.2 mm，寬4.3～6.1 mm；唇瓣長15.2～17.8 mm，寬8～10 mm；蕊柱長12.2～13.2 mm；子房長8.2～12.2 mm。

白及3個(gè)品種(系)之間除了花色不同、株高略有差異外，其花部特征性狀沒有明顯的差異。

表3 白及、黃花白及和小白及花粉大小比較

注：花粉長度和寬度的差異性采用t測(cè)驗(yàn)，同一行數(shù)字后不同小寫字母表示不同種(品種)間的差異顯著(P<0.05)。

Note: The difference comparison using of the t test with the length and width of pollens. Data following by different small letters in the same line indicated significant difference at 0.05 level.

從表2可以看出，白及、黃花白及和小白及除了植株、假鱗莖和葉部性狀等方面均有明顯區(qū)別，尤其是在花部特征性狀方面的差異較大，既可定性也可定量的區(qū)分上述3個(gè)種。

2.2 白及屬的花粉形態(tài)觀察

2.2.1 花粉形態(tài)和大小比較 白及屬3個(gè)種的花粉外觀形態(tài)無明顯差異。蕊柱的頂端為藥床，花粉著生于藥床的齒狀中裂片上，帽狀，4個(gè)花粉團(tuán)，鐮刀狀，粒粉質(zhì)，每2個(gè)花粉團(tuán)對(duì)生成2對(duì)，呈左右兩群，共8個(gè)花粉塊?；ǚ蹓K為囊狀，寬卵形，大小約為808 μm×586 μm，花粉塊輪廓線不平；花粉塊由四合花粉組成，四合花粉近圓球形，局部凹陷或圓拱，無明顯的對(duì)稱性，花粉連接處隆起呈脊，外壁結(jié)構(gòu)呈光滑或不同程度的褶皺狀；未見明顯的萌發(fā)孔?；ㄋ幭路綖橹^，呈笑口狀，略透明，成熟時(shí)表面有晶瑩的粘性物。

白及3個(gè)品種(系)以及黃花白及、小白及的花粉形態(tài)無明顯差異(圖2)，但花粉大小有差異(表3)，其中白及3個(gè)品種(系)花粉長25～42 μm，平均為(37.22±3.25)μm，寬25～36 μm，平均為(33.44±2.21)μm，三者之間差異不顯著；黃花白及花粉長度30～42 μm，平均為(33.38±1.71)μm，寬度28～38 μm，平均為(30.15±1.54)μm；小白及花粉長度20～41 μm，平均為(31.35±2.32)μm，寬度18～32 μm，平均為(27.24±1.65)μm；白及與黃花白及在花粉長度上差異顯著，寬度的差異不顯著；黃花白及與小白及在花粉長度和寬度上的差異均不顯著。說明雖然白及屬3個(gè)種之間花粉大小略有差異，但是這種差異仍不足以作為種間和品種(系)間的分類標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2 花粉外壁紋飾差異比較 白及屬3個(gè)種的花粉雖然在形狀、結(jié)構(gòu)上極為相似，但在其外壁紋飾上有一定差異。白及(B1、B2、B3)的花粉外壁具有明顯的網(wǎng)狀脈紋，網(wǎng)眼小，網(wǎng)壁粗；黃花白及的花粉表面不呈網(wǎng)狀紋飾，拱起的部分略光滑，凹陷的部分褶皺成無規(guī)則的紋飾；小白芨的花粉表面不呈網(wǎng)狀紋飾，拱起的部分略光滑，凹陷的部分呈腦狀紋飾或圓片狀凸起。在放大12 000倍的電鏡下表面紋飾差異更明顯，白及花粉外壁具有明顯的網(wǎng)狀脈紋(圖3A～C)，黃花白及的表面紋飾更密集連接成片(圖3D)，而小白及的表面紋飾為斷片狀，呈小圓形或不規(guī)則形彼此分離(圖3E)。

3 討 論

花粉是植物遺傳信息的攜帶者。在植物漫長的進(jìn)化過程中，不同種類植物的花粉會(huì)形成一些獨(dú)特、穩(wěn)定的形態(tài)特征，而同一類群的植物花粉形態(tài)往往具有一定程度的相似性。花粉的形態(tài)差異常常應(yīng)用于植物的系統(tǒng)進(jìn)化、分類和親緣關(guān)系研究等[18-23]。中國有白及屬植物4個(gè)種，中國藥典僅收錄白及(B.striata)1個(gè)種。王彩霞等[10]詳細(xì)描述了白及的花部特征。田愛梅等[11]對(duì)白及花粉進(jìn)行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)花粉外壁表面有波狀飾紋。王明君等[12]比較了白及屬4個(gè)種的種子形態(tài)掃描電鏡特征，認(rèn)為以蒴果、種子、胚的大小和顏色、表面紋飾等，可以明確區(qū)分白及屬4個(gè)種。

白及屬植物在我國分布較廣，因遺傳基礎(chǔ)和生態(tài)環(huán)境不同，在種間和種內(nèi)均保留了較高的多樣性。種子植物花粉形態(tài)特征是由基因控制并且相對(duì)穩(wěn)定的性狀，不同種間往往存在一定的差異。同時(shí)，花粉形態(tài)性狀在不同程度上受到其所處環(huán)境的各個(gè)因子的影響。研究發(fā)現(xiàn)，白及屬3個(gè)種的花粉外觀形態(tài)無明顯差異，但花粉大小有差異(表2)，白及與黃花白及在花粉長度上差異顯著，而寬度的差異不顯著；黃花白及與小白及在花粉長度和寬度上的差異均不顯著。一般來說，花粉大小是相對(duì)穩(wěn)定的性狀。研究發(fā)現(xiàn)白及屬3個(gè)種花粉存在微小的差異，但不足以作為種間和品種(系)間分類的可靠標(biāo)準(zhǔn)。分析其原因，一是所測(cè)量的種、品種(系)和個(gè)體的花粉數(shù)量不足，無法代表整個(gè)群體；二是與在電鏡拍攝中花粉的極面不一致；三是與供試材料的批次、干燥處理時(shí)間長短不一樣。

A：白及(白花，B1)(12 000倍)；B：白及(桃紅，B2)(12 000倍)；C：白及(玫瑰紅，B3)(12 000倍)；D-黃花白及(12 000倍)；E-小白及(12 000倍)A: B1(B.striata., 12 000×); B: B2(B.striata., 12 000×); C: B3(B.striata., 12 000×); D: B4(B. ochracea, 12 000×); E: B5(B. formosana , 12 000×)圖3 白及、黃花白及、小白及的花粉表面紋飾比較Fig.3 The comparison for exine omamentation of pollens of B.striata, B.ochracea and B. formosana

花粉外壁表面紋飾常常作為植物分類、鑒定的重要依據(jù)。孫崇波等[24]掃描電鏡觀察蘭科5屬10種植物花粉，其花粉外壁紋飾上差異明顯。本研究在放大12 000倍的電鏡下觀察白及屬3個(gè)種花粉表面紋飾，發(fā)現(xiàn)白及花粉外壁具有明顯的網(wǎng)狀脈紋(圖3A～C)，黃花白及的表面紋飾更密集連接成片(圖3D)，而小白及的表面紋飾為斷片狀，呈小圓形或不規(guī)則形彼此分離(圖3E)。

4 結(jié) 論

白及的3個(gè)品種(系)花部特征性狀沒有明顯的差異；白及、黃花白及和小白及在植株、假鱗莖和葉部性狀等方面均存在明顯差異，花粉外觀形態(tài)無明顯差異，但白及與黃花白及在花粉長度上差異顯著，黃花白及與小白及在花粉長度和寬度上的差異不顯著；在12 000倍的電鏡下白及花粉外壁具有明顯的網(wǎng)狀脈紋，黃花白及的表明紋飾密集連接成片，而小白及的表面紋飾為斷片狀，呈小圓形或不規(guī)則形彼此分離。因此，花部特征性狀可以明顯區(qū)分白及屬的3個(gè)種。

致 謝：感謝中國科學(xué)院昆明植物研究所在白及花粉電鏡掃描上提供的幫助。