ELISA實驗中的常見問題和注意事項

[摘 要] 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA） 即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點。

[關(guān) 鍵 詞] ELISA實驗；問題；注意事項

[中圖分類號] G712 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [文章編號] 2096-0603（2017）33-0113-01

用于ELISA測定的臨床標(biāo)本最為常用的是血清（漿）。本實驗室用ELISA測定乙肝兩對半、甲肝、戊肝、抗HIV的標(biāo)本時，在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：

1.要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞。當(dāng)標(biāo)本出現(xiàn)嚴(yán)重溶血及血清中混有紅細(xì)胞時，反應(yīng)孔不易洗凈，殘留在反應(yīng)孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶的活性，顯色時可能造成假陽性。

2.標(biāo)本凝固不全強行離心，造成血清中含有少量的纖維蛋白原，在實驗過程中形成纖維蛋白吸附在反應(yīng)孔孔壁上不易洗掉，易造成假性結(jié)果。

3.血清標(biāo)本可在2～8℃下保存1周。如血清樣本需長時間保存，則需放入-20℃冰柜內(nèi)冰凍保存。冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免反復(fù)凍融，標(biāo)本可能引起假陰性結(jié)果。此外凍融標(biāo)本的混勻不要進(jìn)行劇烈振蕩，應(yīng)反復(fù)顛倒混勻。

二、ELISA測定中試劑準(zhǔn)備

在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后再進(jìn)行測定，試劑盒溫度要和室溫一致。如果把試劑盒從冰箱拿出來直接做實驗，會導(dǎo)致一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性。在后面的孵育反應(yīng)步驟中，造成孵育時間不夠。其次，ELISA實驗中洗板用的洗液需每日更換配制，稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。

三、加血清樣本及反應(yīng)試劑

血清樣本使用微量加樣槍加樣。使用微量加樣槍加樣必須注意避免以下幾點：

1.加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。需勻速加樣，吸樣時，加樣槍需按到第一檔；加樣時，加樣槍需直接按到底。

2.加樣應(yīng)直接加入反應(yīng)孔底部，加在反應(yīng)孔孔壁上易濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染，盡量避免出現(xiàn)氣泡。

3.反應(yīng)試劑加入時先要注意試劑的有效期，再注意滴加的角度和滴加的速度。滴加太快易重復(fù)滴加或加在兩孔之間。

四、溫育的時間與溫度

溫育是ELISA測定中最容易出現(xiàn)問題的步驟。溫育溫度應(yīng)在37℃，水浴。溫育時間應(yīng)按照試劑說明書上的時間嚴(yán)格執(zhí)行。溫育實際測定操作中要注意以下幾點：

1.要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時間。溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來。

2.因為采用水浴，所以在溫育時一定要封板，防止水蒸氣形成水滴掉入反應(yīng)孔內(nèi)造成污染。

五、ELISA測定的洗板

全自動洗板機(jī)的使用應(yīng)注意以下幾點：

1.洗板前，應(yīng)檢查洗液瓶、蒸餾水瓶是否充足，廢液瓶是否滿瓶。

2.在自檢過程中注意觀察洗液灌注是否通暢，排液是否通暢。

3.在洗板過程中，應(yīng)注意觀察反應(yīng)孔每孔是否灌滿且無外溢，每孔吸水是否吸盡，并且要保證洗液在孔中放置的時間。

六、ELISA測定以TMB為底物的顯色

加入底物開始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效期。滴入A、B顯色劑后，需溫育15min，最后加入終止液終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進(jìn)行下面的比色測定判斷結(jié)果。在此過程中應(yīng)注意不要把顯色劑和終止液滴入順序弄反，否則需要重做實驗。

七、ELISA的比色測定

ELISA的比色測定由酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，故需強調(diào)比色測定時，一定要注意酶標(biāo)儀的波長是否是雙波長（450nm和630nm）。

八、ELISA測定結(jié)果判定

結(jié)果判定一般是根據(jù)比色結(jié)果和肉眼觀察綜合判定，如在判定過程發(fā)現(xiàn)有些反應(yīng)孔出現(xiàn)倒陰不陽的現(xiàn)象或出現(xiàn)不常見的模式（如乙肝兩對半中出現(xiàn)12陽性等），需本著嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，重新復(fù)查。

對ELISA測定中出現(xiàn)問題的可能原因（非試劑盒本身的原

因），總結(jié)如下：

1.弱陽性質(zhì)控樣本檢測不出溫育的時間或溫度不夠；顯色反應(yīng)時間太短；所用配制緩沖液的蒸餾水有問題。

2.測定的重復(fù)性差，這是由于測定操作引起的問題，包括：（1）加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致；（2）加樣過快，孔間發(fā)生污染；（3）加錯樣本；（4）加樣本及試劑時，加在孔壁；（5）不同批號試劑盒中組分混用；（6）溫育時間、洗板、顯色時間不一致；（7）孔內(nèi)污染雜物。

血清標(biāo)本未完全凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固

或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽性等。

3.全部孔都不顯色。（1）漏加酶結(jié)合物；（2）洗板液配制中出現(xiàn)問題；（3）漏加顯色劑A或B；（4）終止劑當(dāng)顯色劑使用。

4.全部板孔均有顯色。（1）板不干凈；（2）顯色液變質(zhì)；（3）洗板液受酶等污染。

參考文獻(xiàn)：

[1]紀(jì)照紅.基層中心血站實驗室如何正確手工操作ELISA測定[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，1（12）：112-113.

[2]叢玉隆.實用臨床實驗室管理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：302-303.

[3]季育華.臨床檢驗免疫學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2006：204-206.

[4]葛海良，張冬青.免疫學(xué)技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2009：401-403.