酶的篩選與鑒定

【摘要】 蛋白酶是工業(yè)酶中應(yīng)用最廣最多的一類酶，約占酶總量的60%。如在制革工業(yè)中，利用蛋白酶制劑對(duì)各工序中蛋白質(zhì)進(jìn)行處理。此外，在食品、飼料和餌料等生產(chǎn)過程中，蛋白酶被廣泛作為各種添加劑使用。比如，在魚類養(yǎng)殖中，從魚體消化道篩選出的高產(chǎn)蛋白酶菌株產(chǎn)生的蛋白酶制成的酶制劑可作為餌料（尤其是開口餌料）的添加劑使用，從而彌補(bǔ)人工育苗早期魚苗因消化道發(fā)育尚不完全而導(dǎo)致的酶分泌量的不足，降低育苗過程中魚類的死亡率，提高其生存率，進(jìn)而節(jié)約育苗成本。因此，在用開口餌料進(jìn)行苗種培育時(shí)， 必須添加益生菌或酶制劑以彌補(bǔ)魚苗消化酶分泌不足的狀況。益生菌是一類具有巨大實(shí)用價(jià)值的生物工程產(chǎn)品，它是由從宿主體內(nèi)、水體等分離出的菌群成分制成的活菌制劑，再通過適當(dāng)途徑作用于養(yǎng)殖動(dòng)物。目前，國內(nèi)外報(bào)道的益生菌主要有乳酸菌（包括乳桿菌和肉桿菌），芽胞桿菌和假單胞菌，其中應(yīng)用最廣泛的是能產(chǎn)生蛋白酶的芽胞菌。

本實(shí)驗(yàn)從大菱鲆的腸道中分離出一株能產(chǎn)蛋白酶的菌株，通過對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)，生理生化和16S rDNA序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育分析以期更好地了解該菌株和利用該菌株。形態(tài)學(xué)的鑒定主要是對(duì)菌株和菌落的觀察，在本實(shí)驗(yàn)中利用革蘭氏染色和芽胞染色對(duì)菌株進(jìn)行初步的鑒定。在形態(tài)學(xué)的鑒定基礎(chǔ)上該菌株的生理生化鑒定為接觸酶，氧化酶和能否利用一些葡萄糖類物質(zhì)。16S rDNA序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育分析則能更精確地分析出該菌株的屬和科。

【關(guān)鍵詞】 蛋白酶 篩選 鑒定

本實(shí)驗(yàn)中采用選擇性培養(yǎng)和富集培養(yǎng)兩種不同的培養(yǎng)方法從大菱鲆腸道中分離篩選出一株水解圈較大的產(chǎn)蛋白酶菌株，并將這株菌株命名為B5。將B5菌株接種到海水瓊脂培養(yǎng)上培養(yǎng)24h使菌株活化，之后挑取單菌落進(jìn)行涂片和革蘭氏染色，革蘭氏染色的過程為：①取無油跡的干凈載波片，滴上一滴無菌蒸餾水，用接種環(huán)挑取少許菌苔，于水滴邊緣輕輕涂幾下。②自然風(fēng)干，或在火焰上通過幾次，固定涂片。③滴加結(jié)晶紫液，染一分鐘。用水沖凈結(jié)晶紫液。④滴加碘液，覆蓋約1min。用水沖去碘液，將片上的水甩干。⑤滴加95%乙醇液脫色，并立即用水沖凈乙醇。⑥番紅液染1-2min。用水洗凈，風(fēng)干，用顯微鏡油鏡觀察涂片。菌體紅色為革蘭氏染色陰性，藍(lán)紫色為革蘭氏染色陽性。將B5菌株進(jìn)行芽胞染色[8]，芽胞染色的過程是：（1）加孔雀綠染液2—3滴于已涂上B5菌株的玻片上，然后加熱染色15 min：（2）水沖洗，至到流出的水無綠色為止；（3）用0.5%沙黃液復(fù)染2 min，棄去多余的染液，吸水紙吸干鏡檢（此步驟不用水沖洗）。利用上述的初步鑒定結(jié)果參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第9版）和常規(guī)生理生化鑒定對(duì)B5菌株進(jìn)行以下生理生化分析：氧化酶和接觸酶的分析，是否產(chǎn)H2S，甘露醇，葡萄糖和尿素利用。氧化酶試驗(yàn)的過程為：取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二甲基對(duì)苯二胺溶液一滴，陽性者呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深； 再加α-萘酚溶液一滴，陽性者于半分鐘內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍(lán)色。陰性于兩分鐘內(nèi)不變色。接觸酶試驗(yàn)過程：將24h培養(yǎng)的斜面菌種，以鉑絲接種環(huán)取一小環(huán)涂抹于已滴有3%過氧化氫的玻片上，如有氣泡產(chǎn)生則為陽性，無氣泡為陰性。產(chǎn)H2S試驗(yàn)的過程：以無菌操作將B5菌穿刺接種至培養(yǎng)基中，并將接種后的培養(yǎng)基放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。甘露醇，葡萄糖和尿素利用試驗(yàn)的方法與產(chǎn)H2S試驗(yàn)的方法相似。利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取B5菌株的基因組，細(xì)菌基因組DNA的提取過程為：①取細(xì)菌培養(yǎng)液lmL，1000Orpm 離心lmin ，盡量吸盡上清。②向菌體沉淀中加入200uL溶液GA，振蕩至菌體充分懸浮。③向管中加入2OuL蛋白酶K溶液 ，充分混勻。④向管中加入2OOuL 溶液GB，振蕩15s，70℃ 放置3Omin，沉淀即會(huì)消失，簡短離心除去壁內(nèi)水珠。⑤向管中加入2OOuL 無水乙醇，充分混勻振蕩15s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心去除水珠。⑥將上一步所得的沉淀和溶液都加入到一個(gè)吸附柱GB3中，1200Orpm 離心30s，棄廢液，將吸附柱GB3放入收集管中。⑦向吸附柱GB3中加入700uL 漂洗液GD，12000rpm 離心30s ，棄廢液，將吸附柱GB3放入收集管中。⑧向吸附柱中加入5OOuL 漂洗液PW，1200Orpm 離心30s，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。⑨向吸附柱中加入5OOuL 漂洗液PW，1200Orpm 離心30s，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR 等。⑩將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50 -2OOuL洗脫液TE，室溫放置2-5min，1200Orpm 離心2min，將溶液收集到離心管中。并將收集到的DNA進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為

10×擴(kuò)增緩沖液 2.5uL

Dntp 2.5uL

引物1 2uL

引物1 2uL

模板DNA 2uL

Taq DNA聚合酶 2uL

Mg2+ 2uL

雙蒸水 11uL

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10min （95℃ 1min 55℃ 1min 72℃ 1min）30個(gè)循環(huán) 72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行電泳檢測，確定成功后用PCR膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。膠回收的過程是：⑴將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的1.5ml？EP管中，加入3倍體積的結(jié)合液，輕輕混勻。⑵將步驟1的混合液加入到吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘。⑶加入600uL漂洗液于吸附柱中，12000rpm離心30秒，棄廢液。⑷再次加入300uL漂洗液于吸附柱中，12000rpm離心30秒，棄廢液。再以12000rpm離心1分鐘。⑸直接加入6-10uL水于吸附柱中，12000rpm離心30秒洗脫DNA。所收集的DNA可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。將回收的PCR產(chǎn)物與合適的質(zhì)粒載體連接轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞進(jìn)行搖床培養(yǎng)，取菌液進(jìn)行PCR、瓊脂糖電泳檢測。重組產(chǎn)物送交公司測序。將測序獲得的16SrDNA序列在NCBI中運(yùn)用BLAST軟件進(jìn)行同源性分析，并運(yùn)用Clustal 1.8軟件對(duì)同源性高的序列進(jìn)行比對(duì)，用Mega2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

通過對(duì)大菱鲆胃腸道菌的分離和篩選，分離所得一株具有產(chǎn)蛋白酶能力的菌株B5，并對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定。本實(shí)驗(yàn)在鑒定過程中運(yùn)用了細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定法生理生化鑒定法和16S rDNA序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定法。細(xì)菌形態(tài)鑒定法主要包括革蘭氏染色和芽胞染色，經(jīng)染色所知B5菌株為革蘭氏陽性和含有芽胞。生理生化鑒定主要內(nèi)容有氧化酶和接觸酶的分析，是否產(chǎn)H2S，甘露醇，葡萄糖和尿素利用，B5菌株為氧化酶陰性，接觸酶陽性，能利用甘露醇和葡萄糖，不能利用尿素和不產(chǎn)H2S。16S rDNA序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定法利用對(duì)菌株的16S rDNA序列分析出B5菌株為蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus B5。這三種方法都有各自得優(yōu)缺點(diǎn)，相對(duì)來說形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定法只是對(duì)菌株進(jìn)行初步的鑒定。16S rDNA序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定法不僅能鑒定出為何種菌株，還能列出菌株的進(jìn)化樹使鑒定結(jié)果更為精確。