小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR檢測(cè)方法的建立

伍妙梨, 朱余軍, 饒 丹, 袁 文, 王 靜, 叢 鋒, 黃 韌, 陳梅麗, 郭鵬舉

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所, 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州510663)

小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR檢測(cè)方法的建立

伍妙梨, 朱余軍, 饒 丹, 袁 文, 王 靜, 叢 鋒, 黃 韌, 陳梅麗, 郭鵬舉

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所, 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州510663)

目的 建立敏感性高、特異好的小家鼠螺桿菌(Helicobacter muridarum) TaqMan-qPCR檢測(cè)方法。方法 選擇小家鼠螺桿菌保守基因GyrB設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品GyrB-19T。通過反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化，建立小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR檢測(cè)方法，并對(duì)GyrB-19T標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性及定量分析，評(píng)估該方法的靈敏度、特異性及重復(fù)性。結(jié)果 所建立的qPCR檢測(cè)方法，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度在2×102～2×108拷貝/μL范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的線性相關(guān)性，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.57，相關(guān)系數(shù)為0.996，檢測(cè)靈敏度達(dá)到200拷貝/μL。結(jié)論 所建立的小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR方法具有特異性好、敏感性高、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于小家鼠螺桿菌的定量及定性分析。

小家鼠螺桿菌; TaqMan-qPCR

嚙齒動(dòng)物螺桿菌(rodent helicobacter)是一類寄居在嚙齒動(dòng)物消化道的螺桿菌屬細(xì)菌總稱，常以隱性感染形式普遍存在于大鼠、小鼠、倉鼠、蒙古沙鼠等動(dòng)物的消化道中，可引起嚙齒動(dòng)物的多種胃腸道疾病[1]。目前，從嚙齒動(dòng)物體內(nèi)陸續(xù)分離出較為重要的腸道螺桿菌主要有膽汁螺桿菌(Helicobacter bilis)、肝螺桿菌(Helicobacter hepatitis)、嚙齒類螺桿菌(Helicobacter rodentium)、小家鼠螺桿菌(Helicobacter muridarum)、盲腸螺桿菌(Helicobacter typhlonius)等[2,3]。

小家鼠螺桿菌于1992年首次從小鼠腸黏膜中分離得出，其主要寄生在小鼠、大鼠等嚙齒動(dòng)物的胃及腸道黏膜中，可引起小鼠的腸胃炎而導(dǎo)致動(dòng)物體弱影響動(dòng)物健康，甚至影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量及干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造成人力、物力資源的浪費(fèi)[4]。目前用于小家鼠螺桿菌隱性感染的檢測(cè)主要有病原學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且因小家鼠螺桿菌的生長條件苛刻而失敗率較高; 血清學(xué)檢測(cè)方法雖然簡單便捷，但是由于診斷抗原和商品化試劑盒的缺乏，而限制了其應(yīng)用。分子生物學(xué)方法如普通PCR、巢式PCR、多重PCR等在螺桿菌檢測(cè)中已被大量運(yùn)用，但存在假陽性及污染問題[5]。TaqMan探針型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TaqMan-qPCR)因其高敏感性、高特異性、結(jié)果直觀并可準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測(cè)[6]。本研究旨在建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確檢測(cè)小家鼠螺桿菌的TaqMan-qPCR方法。

1 材料與方法

1.1 菌種及臨床樣本的收集

小家鼠螺桿菌ATCC51212、膽汁螺桿菌ATCC51630、肝螺桿菌ATCC51449等購自美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)，大腸桿菌DH-5α菌株購自大連寶生生物有限公司; 盲腸螺桿菌及鼠傷寒沙門氏菌均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。臨床樣品來自褐家鼠(Rattus norvegicus)，捕獲于廣州市某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場附近，共25只。樣本采集在本實(shí)驗(yàn)室的屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)間, 無菌采集盲腸內(nèi)容物共計(jì)25份，于-20℃保存。

1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒等購自天根生化科技有限公司; Premix Ex TaqTM (Probe qPCR)、pMDTM19-T Vector 等均購自大連寶生生物有限公司。

1.3 引物及探針的合成

根據(jù)小家鼠螺桿菌gyrase B(GyrB)基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物(GyrB-F、GyrB-R)及探針(GyrB-P), 同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)普通引物(GyrB-S、GyrB-A)用以擴(kuò)增GyrB基因長片段(表1)。引物及探針等均由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

表1 所用引物及探針Table 1 Primer and probe

1.4 制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

將擴(kuò)增的GyrB基因片段PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行TA克隆插入到pMD-19T載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，經(jīng)PCR菌液鑒定后送invitrogen公司測(cè)序。將測(cè)序正確的陽性克隆增殖培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。

1.5 Taq-qPCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

根據(jù)Takara Premix Ex TaqTM (Probe qPCR)的操作說明書配制qPCR反應(yīng)體系，分別對(duì)引物濃度(0.1～1 μmol/L)，探針濃度(0.1～1 μmol/L)、循環(huán)數(shù)(36～45個(gè)循環(huán))等條件進(jìn)行優(yōu)化，通過比較Ct值、熒光強(qiáng)度等來判定優(yōu)化結(jié)果，建立小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR方法。

1.6 敏感性分析

為了評(píng)估TaqMan-qPCR方法的敏感性，將GyrB質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品母液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取108～100拷貝/μL共9個(gè)梯度稀釋度的質(zhì)粒作為反應(yīng)模板，每個(gè)稀釋度做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)以pMD-19T空質(zhì)粒為陰性對(duì)照，ddH2O為空白對(duì)照。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性分析

以膽汁螺桿菌(H.bilis)、嚙齒類螺桿菌(H.rodentium)、肝螺桿菌(H. hepatitis)、盲腸螺桿菌(H.typhlonius)、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌等細(xì)菌DNA作為模板進(jìn)行小家鼠螺桿菌qPCR特異性檢測(cè)，同時(shí)以pMD-19T空質(zhì)粒為陰性對(duì)照，水作為空白對(duì)照，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)。

1.8 重復(fù)性分析

選取5個(gè)濃度梯度模板測(cè)定其Ct值，并重復(fù)5次，通過計(jì)算Ct值的變異系數(shù)CV來評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的重復(fù)性。

2 結(jié)果

2.1 GyrB-19T重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以小家鼠螺桿菌的基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得小家鼠螺桿菌GyrB基因片段，長度為756 bp，經(jīng)過TA克隆獲得重組質(zhì)粒(圖1)。經(jīng)測(cè)序鑒定與NCBI中GyrB基因片段序列一致。

M: DL2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～4: GyrB-19T質(zhì)粒陽性克隆菌落圖 1 重組質(zhì)粒GyrB-19T的菌液PCR鑒定DL2000 DNA Marker (M) and positive plasmid colony of GyrB-19TFigure 1 Result of PCR identification of the recombinant plasmid GyrB-19T

2.2 Taq-qPCR反應(yīng)體系的建立

通過對(duì)引物濃度、探針濃度、循環(huán)數(shù)等條件摸索, 得出最佳反應(yīng)條件是每20 μL反應(yīng)體系中加入 10 μL Premix Ex Taq, 0.2 μL ROX Reference DyeII，上下游引物各 0.2 μmol，探針 0.2 μmol，模板2 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95 ℃預(yù)變性30 s后進(jìn)入PCR擴(kuò)增階段，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s ，共40個(gè)循環(huán)。其中60 ℃ 34 s為熒光收集階段。

2.3 定量線性分析及敏感度檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在 2 ×102～2 × 108拷貝 /μL濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系較好，擴(kuò)增曲線呈S型(圖2)，Ct值在16～38。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線定量線性方程所得斜率為 -3.57, 截距為44.17，線性相關(guān)系數(shù)為0.996。而2×10拷貝/μL和2×102拷貝/μL組因模板濃度較低，接近TaqMan探針的臨界檢測(cè)濃度，線性相關(guān)性不好，故排除。故本研究建立的小家鼠螺桿菌TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的靈敏度為200個(gè)拷貝/μL。定性判定可認(rèn)為Ct值大于38為陰性，Ct值小于38為陽性。

2.4 特異性分析

除了小家鼠螺桿菌有擴(kuò)增外，其他幾種細(xì)菌模板包括陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，其所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線均為平緩直線。故認(rèn)為該方法對(duì)小家鼠螺桿菌核酸的檢測(cè)是特異的。

圖2 GyrB-19T質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋qPCR擴(kuò)增熒光動(dòng)力曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 The fluorescence quantitative amplification plot and standard curve of 10-fold serial dilution standard plasmid

圖3 小家鼠螺桿菌qPCR檢測(cè)方法特異性分析Figure 3 The specificity evaluation of qPCR method

2.5 重復(fù)性分析

2×102～2×108拷貝/μL的模板重復(fù)測(cè)定5次，分別得到5個(gè)Ct值，計(jì)算Ct值平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)(表2)。由表2可知，本檢測(cè)方法的重復(fù)性較好。

2.6 臨床樣品檢測(cè)

用本研究建立的TaqMan-qPCR方法及普通PCR方法對(duì)25份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示，用TaqMan-qPCR檢測(cè)出陽性樣品16份(檢出率64%)，而普通PCR檢測(cè)出的陽性樣品為14份(56%)。經(jīng)測(cè)序分析，TaqMan-qPCR的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。

表2 小家鼠螺桿菌qPCR檢測(cè)方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 2 The repeatability evaluation of 10-fold serial dilution of GyrB-19T

3 討論

螺桿菌是一類最初從人類及其他哺乳動(dòng)物的胃組織中分離出來的螺旋彎曲狀細(xì)菌，為微需氧革蘭氏陰性菌[7]。根據(jù)其定植部位的不同可分為胃內(nèi)螺桿菌(gastric helicobacter species)和肝腸螺桿菌(enterohepatic helicobacter species, EHS)。嚙齒動(dòng)物螺桿菌屬于肝腸螺桿菌菌屬, 主要寄居于消化道中,包括盲腸、結(jié)腸及肝膽管系統(tǒng)[8]。螺桿菌的致病力較低，故多數(shù)動(dòng)物表現(xiàn)為潛伏性、慢性感染，臨床癥狀不明顯，但對(duì)于免疫缺陷動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或免疫力較低的動(dòng)物, 可導(dǎo)致臨床炎癥、肝膽疾病、腫瘤甚至致死性疾病等，嚴(yán)重影響動(dòng)物的質(zhì)量。若使用隱性攜帶螺桿菌的動(dòng)物進(jìn)行致病機(jī)理、藥物篩選、藥效研究、藥品及保健品的安全性評(píng)估時(shí), 必然會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故被國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物理事會(huì)列為嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須排除的病原微生物。

目前動(dòng)物中具有致病性報(bào)道較多的螺桿菌是肝螺桿菌和膽汁螺桿菌，而對(duì)于小家鼠螺桿菌的報(bào)道甚少。小家鼠螺桿菌, 主要寄生在大、小鼠的消化道, 與大、小鼠的胃炎、腸炎發(fā)生相關(guān)[4]。若使用感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行胃炎、腸炎相關(guān)實(shí)驗(yàn), 必將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此, 小家鼠螺桿菌在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的感染已引起研究者的高度重視[9]。目前, 在國內(nèi)對(duì)小家鼠螺桿菌的檢測(cè)缺乏有效方法，而未被列入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，造成我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科研領(lǐng)域與國際水平的差距，影響我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)業(yè)化,并對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)出口帶來不利影響[10]。因此, 建立一種簡單、快速、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)小家鼠螺桿菌的方法對(duì)保證及提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量至關(guān)重要。

在螺桿菌檢測(cè)研究的早期，細(xì)菌分離培養(yǎng)法因其結(jié)果直接可靠而成為螺桿菌診斷的首選方法，鑒于其生長條件苛刻，該方法的成功率較低而限制了其應(yīng)用。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，PCR檢測(cè)技術(shù)因其快速準(zhǔn)確、操作便捷而被廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)[11-13]。與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有特異性更強(qiáng)、檢驗(yàn)時(shí)間短、有效解決PCR產(chǎn)物污染問題等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域[14,15]。

本研究所建立的小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR檢測(cè)方法具有敏感、穩(wěn)定及特異性好等特點(diǎn)，其定量準(zhǔn)確性達(dá)到200拷貝/μL。可用于小家鼠螺桿菌的快速檢測(cè)及定量分析。

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Development of TaqMan-qPCR for Detection of Helicobacter muridarum

WU Miao-li, ZHU Yu-jun, RAO Dan, YUAN Wen, WANG Jing,CONG Feng, HUANG Ren, CHEN Mei-li, GUO Peng-ju
(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663, China)

ObjectiveTo establish the sensitive and specific TaqMan-qPCR method for detection ofHelicobacter muridarum.MethodThe specific primers were designed according to theHelicobacter muridarumgyrase B(GyrB) gene, specific fragment was amplified by PCR, and cloned into pMD-19T vector to construct the recombinant plasmid GyrB-19T, which was used as standard DNA of this qPCR method. The qPCR system was optimized and the sensitivity, specificity, repeatability and quantitative range of this method were evaluated.ResultThe quantitative standard curve from 2×108copies/well to 2×102copies/well of serial diluted plasmid DNAs showed that they had good liner correlation, the slope of the standard curve was -3.57, R2＞0.996, and the lowest detection limit reached 2× 102copies/well.ConclusionThis qPCR method showed high sensitivity, specificity and stability, which will be utilized for qualitative and quantitative detection of Helicobacter muridarum.

Helicobacter muridarum; TaqMan-qPCR

S855.3 Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0378-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.007

2017-03-23

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B060400028;2014A070705003; 2014B070706006)

伍妙梨(1987-), 女, 碩士, 研究方向: 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail: 983671845@qq.com

郭鵬舉, 研究員。E-mail: 1517727522@qq.com