大鼠微小病毒和細小病毒雙重熒光定量PCR檢測方法建立

孫竹筠, 蔡驍垚,, 熊 煒, 陳懿斐, 張 泉, 李澤君, 魏曉鋒, 陳鴻軍

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所, 上海 200241; 2. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 揚州 225009;3. 上海實驗動物研究中心, 上海 201203; 4. 上海出入境檢驗檢疫局, 上海 200135）

大鼠微小病毒和細小病毒雙重熒光定量PCR檢測方法建立

孫竹筠1, 蔡驍垚1,2, 熊 煒4, 陳懿斐3, 張 泉2, 李澤君1, 魏曉鋒3, 陳鴻軍1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所, 上海 200241; 2. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 揚州 225009;3. 上海實驗動物研究中心, 上海 201203; 4. 上海出入境檢驗檢疫局, 上海 200135）

目的 建立快速、準確地同時檢測和鑒別大鼠細小病毒(RPV)和大鼠微小病毒(RMV)的雙重TaqMan實時熒光定量PCR方法。方法 根據(jù) GenBank中已公布的RMV NTU1株全基因組序列(JX627317.1)，在1 705～1 808 nt處設(shè)計引物和TaqMan探針，根據(jù)RPV NTU1毒株的全基因組序列(JX827169)，在863-967nt處設(shè)計引物和TaqMan探針。以構(gòu)建的質(zhì)粒參考物為模板建立熒光定量PCR檢測方法，并對該鑒別檢測方法的靈敏度、穩(wěn)定性和特異性進行評價; 用建立的熒光定量方法對50份臨床樣品進行檢測，并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的商品試劑盒進行驗證。結(jié)果 建立的RMV和RPV的鑒別熒光定量PCR方法標準曲線的線性關(guān)系良好，R2值可達0.99，最低檢測限均為10拷貝數(shù)/μL; 應(yīng)用鑒別熒光定量PCR方法和ELISA檢測試劑盒，對100份大鼠肝臟和50份血清樣品病料進行檢測，結(jié)果均為陰性。結(jié)論 建立的RMV和RPV的TaqMan實時熒光定量PCR方法具有特異、靈敏的特點，適用于RMV和RPV的臨床監(jiān)測。

大鼠微小病毒(RMV); 大鼠細小病毒(RPV); TaqMan探針; 熒光定量PCR

大鼠細小病毒(RPV)和大鼠微小病毒(RMV)是大鼠細小病毒(Parvovirus)中的兩株常見病毒株，具有細小病毒的典型特征，為無囊膜單股線狀DNA病毒，RPV和RMV感染表現(xiàn)出的臨床癥狀相似，所以需要通過雙重FQ-PCR技術(shù)同時檢測和鑒別這兩個病原體[1]。

在動物實驗中一旦使用細小病毒感染的大鼠，會嚴重影響實驗數(shù)據(jù)的準確性，特別是在涉及免疫學(xué)、器官移植、以及腫瘤學(xué)研究的動物實驗[2,3]。細小病毒能夠改變免疫應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致肝細胞壞死，影響神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、造血系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)。成年大鼠感染大多無臨床癥狀，細小病毒還可污染腫瘤移植物和細胞系，對實驗研究產(chǎn)生嚴重干擾。細小病毒抵抗力強，在環(huán)境中長期保持傳染性，感染動物排毒時間長，一旦感染便難以根除，一直是健康監(jiān)測的重點。

隨著我國實驗動物工作的法制化和規(guī)范化管理水平的提高，實驗動物生產(chǎn)和使用單位對實驗動物質(zhì)量要求也越來越提高，開始加強對實驗動物健康的全面監(jiān)測。RPV中，H-1和KRV已經(jīng)被列入國家標準SPF級大鼠要求必須檢測項目，而Charles River Laboratories (CRL)公司把RPV、RMV、NS-1和RTV均列為檢測項目。在國內(nèi)，有報道[4]已證實存在RPV和RMV感染大鼠情況。然而，這兩種病毒感染卻缺乏靈敏特異的分子生物學(xué)檢測方法。本研究擬建立TaqMan探針熒光定量PCR方法，以鑒別診斷RPV和RMV。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和病毒毒株

RPV和RMV ELISA試劑盒購于美國XpressBio公司。QlAamp DNA Mini kit購于德國Qiagen公司。TaKaRa ExTaq HS kit購于日本TaKaRa公司。小鼠微小病毒、RPV KRV株、RPV H1株、仙臺病毒(SEV)、小鼠呼腸孤病毒3型(Reo-3)和鼠痘病毒(ECT)由上海實驗動物研究中心保存。

1.2 參考物質(zhì)粒構(gòu)建與引物設(shè)計

通過MegAlign分析全基因序列，選出RPV(JX827169.1)的 863～963 bp和RMV(JX627317.1)的3 389～3 589 bp特異性序列區(qū)間，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成串聯(lián)的基因序列，與pUC57載體連接，構(gòu)建pUC-RV作為參考物質(zhì)粒。同時，根據(jù)該區(qū)域設(shè)計特異性引物，序列見表1。

表1 實驗所用引物信息Table 1 Primers in the experiment

1.3 熒光定量PCR方法反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

使用美國ABI公司7500型熒光定量PCR儀，擴增反應(yīng)總體系為20μL，其中Premix ExTaq(Probe qPCR)(2 ×)使用量為 10 μL, ROX Reference Dye II(50 ×)使用量為 0.2 μL，DNA模板使用量 2 μL, 加入引物(10 μmol/L)qRPV-F、qRPV-R、qRMV-F、qRMV-R 各0.4 μL，F(xiàn)AM-RPV探針(10 μmol/L)，F(xiàn)AM-RMV各0.8 μL, 用滅菌蒸餾水補足20 μL。采用優(yōu)化后的反應(yīng)程序進行反應(yīng), 反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，并采集熒光40個循環(huán)。

1.4 敏感性、特異性、重復(fù)性

將1×108拷貝/μL的參考物質(zhì)粒pUC-RV，進行10倍梯度稀釋，用于進行敏感性測試; 用大鼠中常見的RPV KRV株、RPV H1株、SEV和ECT進行特異性檢測。以倍比稀釋的參考物質(zhì)粒 PUC-RV作為模板，每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)孔來進行重復(fù)性實驗。方法的重復(fù)性以Ct值變異系數(shù)(標準偏差/重復(fù)值平均數(shù))來評估。

1.5 臨床樣品檢測

初步運用建立的RMV和RPV的TaqMan探針熒光定量PCR方法，將采集來一一對應(yīng)的100只大鼠的肝臟研磨液，進行組織DNA提取。抽提得到的DNA作為模板進行檢測。同時運用傳統(tǒng)的血清學(xué)ELISA方法檢測對應(yīng)的100份血清樣品，對比兩種方法檢測的結(jié)果，確保檢測結(jié)果的準確性，同時也是對本研究建立方法的一種驗證。

2 結(jié)果

2.1 RPV和RMV各自特異性序列區(qū)間分析

從GenBank中調(diào)取細小病毒內(nèi)的KRV(AF321230.1); 小鼠微小病毒(NC_001510.1); RPV H1(X01457.1); RMV NTU1(JX627317.1); RPV NTU1(JX827169.1)全基因序列。通過MegAlign分析全基因序列，表明RPV (JX827169.1)在863～963 bp的序列區(qū)間為特異性區(qū)間:cactgactctggctggaaatttaactttatgaaagaggcagacagacacttggtcagtacactttatactgatcaaatgaagccagaaacggttga gacca。RMV (JX627317.1)在3 389～3 589 bp(圖 1)。

2.2 熒光定量PCR的標準曲線

按pUC-RV質(zhì)粒參考物1×108拷貝數(shù)/μL為起始模板濃度, 以倍比稀釋次數(shù)和相應(yīng)的Ct值繪制出標準曲線(圖2)。得到的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，標準曲線都具有良好的線關(guān)系，各個稀釋度相關(guān)性好，誤差較小。將1×108拷貝/μL的參考物質(zhì)粒pUC-RV, 進行10倍梯度稀釋, 用于進行敏感性測試,Ct值大于35視為陰性。繪制不同濃度的模板下三組樣品的擴增曲線。結(jié)果顯示: 該方法具有良好的重復(fù)性, 最低可檢測模板濃度為10拷貝/μL(圖3), 約100 fg DNA。

圖1 使用MegAlign Clustal W方法進行序列比對Figure 1 Sequence alignments were performed using the ClustalW method in MegAlign

檢測方法中RPV產(chǎn)生的熒光強度明顯高出RMV,RMV的熒光擴增曲線也趨于平直, 很容易區(qū)分和辨別出, 且擴增曲線可靠, 所以雙重熒光檢測方法是可以同時鑒別并檢測RMV和RPV, 且靈敏度很高。

2.3 特異性試驗

對小鼠微小病毒、RPV KRV株、RPV H1株、仙臺病毒、小鼠呼腸孤病毒3型和鼠痘病毒進行檢測，除參考物有陽性擴增曲線外，其他病毒均沒有擴增曲線。這說明該方法與待檢的其他大鼠病毒病原體無交叉反應(yīng)(圖4)。

2.4 重復(fù)性試驗

以倍比稀釋的參考物質(zhì)粒 PUC-RV 作為模板，每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)孔來進行重復(fù)性實驗。對結(jié)果統(tǒng)計分析(表1)，對RMV檢測重復(fù)孔的變異系數(shù)為1.28%～2.91%，對RPV檢測重復(fù)孔的變異系數(shù)為0.12%～0.97%，變異系數(shù)小于3.0%，表明建立的RMV和RPV的熒光定量PCR檢測方法，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.5 臨床樣品檢測

圖2 TaqMan熒光定量PCR檢測標準曲線Figure 2 Standard curve of TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR

圖3 TaqMan熒光定量PCR動力學(xué)曲線Figure 3 Dynamic Curve of TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR

圖4 TaqMan熒光定量PCR檢測方法的特異性Figure 4 Specificity of TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR

表2 RMV和RPV的熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性Table 2 Repeatability of qPCR method for detecting RMV and RPV

收集上海實驗動物研究中心用于檢測和科研的來自各單位的100只SPF級大鼠，采集各肝臟組織,提取DNA，使用建立的熒光定量PCR方法檢測，以質(zhì)粒參考物模板為陽性對照，無RNA酶水模板為陰性對照。同時采集50只大鼠的血清樣品, 利用RPV和RMV的ELISA檢測試劑盒進行血清學(xué)檢測。結(jié)果表明，兩種方法檢測結(jié)果均呈陰性, 100只大鼠均未感染RPV和RMV，檢測結(jié)果相符合。

3 討論

RMV和RPV在大鼠群中的傳播能力非常強，且多為隱性感染并長期排毒，其傳播途徑為糞口途徑，所以要及早地發(fā)現(xiàn)并處理RPV感染，一旦蔓延，會造成嚴重損失。防治措施除對動物房的飼料、飲水和周圍環(huán)境消毒滅菌外，還要定期對實驗動物進行病原微生物監(jiān)測。定期對動物房進行監(jiān)測，確保第一時間發(fā)現(xiàn)疾病感染，是防控RPV感染最重要方法[5]。隨著我國實驗動物工作的法制化和規(guī)范化，我國實驗動物的質(zhì)量已有明顯提升。雖然RPV H-1株和KRV株已被列入了國家標準SPF級大鼠必須檢測項目，但RPV和RMV也嚴重威脅著我國實驗大鼠健康安全。所以建立關(guān)于RPV和RMV的檢測方法十分必要。

目前，我國檢測RPV和RMV仍然利用傳統(tǒng)病毒抗體檢測方法，也就是先用ELISA對大鼠血清進行病毒抗體初步檢測，如出現(xiàn)陽性及可疑檢測結(jié)果的樣品，再用IFA進行復(fù)檢，檢測步驟繁瑣，操作過程中也容易污染，但準確性很高。ELISA與IFA檢測結(jié)果符合率為99.07%[4-6]。熒光定量PCR一直以來都是大鼠病毒的主要檢測手段之一[7-9]。本研究臨床檢測同樣也使用了傳統(tǒng)的ELISA對血清進行病毒抗體初步檢測，在運用建立的熒光定量PCR的檢測方法進行檢測，結(jié)果一致，均未見陽性RPV和RMV的感染。表明本研究建立的RPV和RMV的檢測方法是非常便捷和靈敏。

本研究側(cè)重于檢測方法的建立，檢測樣本只能說明該批SPF級大鼠不存在RPV和RMV的感染。目前，我國對實驗動物感染RPV和RMV病毒尚未引起足夠重視，但RPV和RMV重要性決定了這必將是國家標準要求的大鼠檢測項目，所以，建立RPV和RMV的熒光定量PCR的檢測方法非常重要。作者將收集更多地區(qū)的大鼠樣品，檢測和統(tǒng)計目前我國大鼠RPV和RMV感染情況，為實驗動物生產(chǎn)和使用單位制定健康監(jiān)測方案以及動物病原體的凈化提供依據(jù)，也將為建立國家標準或地方標準提供重要參考依據(jù)。

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Establishment of TaqMan Real-time Fluorescent Quantitative PCR for Detecting Rat Minute Virus and Rat Parvovirus

SUN Zhu-yun1, CAI Xiao-yao1,2, XIONG Wei4, CHEN Yi-fei3,ZHANG Quan2, LI Ze-jun1, WEI Xiao-feng3, CHEN Hong-jun1
(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China.2. Veterinary Medicine College, Yangzhou University, Yangzhou Jiangsu 225009, China.3. Shanghai Lab. Animal Research Center, Shanghai 201203, China.4 Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China)

ObjectiveTo establish TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR method which can detect rat minute virus (RMV) and rat parvovirus (RPV) quickly and accurately in clinic.MethodAccording to the whole genome sequence of strain RMV NTU1 (Accession No. JX627317.1 in Genbank) the primers and TaqMan probe were designed from the 1705～1808 nt. And according to the whole genome sequence of strain RPV NTU1 (JX827169) the primers and TaqMan probe were designed from the 863-967nt. The stability, specificity, and sensitivity of the method were evaluated through realtime quantitative PCR method, which is based on the standardized plasmid constructed. 50 clinical samples were detected using this fluorescence quantitative method, which validated with the traditional ELISA method.ResultThe real-time quantitative PCR for detecting RMV and RPV showed a perfect linear relationship of standard curve, and R2value reached 0. 99 with a high specificity. The sensitivity of the real-time PCR was 10 copies/μL at minimum. Due to dual specificity of primer and probe, TaqMan quantitative PCR is extremely accurate. One hundred liver samples and 50 serum samples were negative via ELISA and real time quantitative PCR respectively.ConclusionThe TaqMan probe-based real-time PCR method is established with good specificity and sensitivity, which can make a powerful technical support for RMV and RPV investigation and detection.

Rat minute virus (RMV); Rat parvovirus (RPV); TaqMan probe; Real-time PCR

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0372-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.006

2017-03-06

上海市科委實驗動物專項資金資助(15140900600)

孫竹筠(1981-), 女, 碩士, 主要從事動物生態(tài)毒理研究。E-mail: sunzhuyun@shvri.ac.cn;

共同第一作者: 蔡驍垚(1990-), 男, 碩士研究生, 主要從事動物病毒學(xué)研究。E-mail: 1007567118@qq.com

陳鴻軍, 研究員。vetchj@shvri.ac.cn魏曉鋒, 副研究員。wei.xf@outlook.com