云南藤黃提取物對(duì)人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其機(jī)制研究

段琳琳 隋華 朱蕾 張莉 譚紅勝

摘要 目的：探討云南藤黃提取物抑制裸鼠大腸癌植性實(shí)體瘤的作用機(jī)制。方法：建立裸鼠人結(jié)腸癌皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為：模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（5-氟脲嘧啶）、云南藤黃提取物低、中、高劑量組。連續(xù)治療28 d，于末次給藥后12 h，剝?nèi)∧[瘤，稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率；并檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況；免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達(dá)。結(jié)果：云南藤黃提取物低、中、高劑量對(duì)腫瘤的抑瘤率分別為12.5%、20.83%和29.17%，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。腫瘤細(xì)胞凋亡率增加，并且隨著云南藤黃提取物濃度的增加而增加，具有劑量依賴(lài)性（P<0.05）。云南藤黃提取物能明顯降低腫瘤組織中cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達(dá)，具有劑量依賴(lài)性（P<0.01）。結(jié)論：云南藤黃具有較好的體內(nèi)抗腫瘤作用，可能是通過(guò)降低cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)增殖。

關(guān)鍵詞 云南藤黃；大腸癌；裸鼠；凋亡；cyclinE1；c-Met；hnRNPK

Abstract Objective：To observe the mechanism of garcinia yunnanensis extract on subcutaneously implanted tumor of human colorectal carcinoma in nude mouse.Methods：A nude mouse model of subcutaneously implanted tumor of human colorectal carcinoma was established，and experimental nude mice were randomly divided into 5 groups：model group，positive control group （5-Fluorouracil），and high/middle/low doses of garcinia yunnanensis group.After 28 days of treatment，the tumor was cut to weigh and anti-tumor rate was calculated，and the apoptosis ratio of tumor cells was analyzed.CyclinE1，c-Met，hnRNPK expression level were analyzed by immuno-histochemical method.Results：The experimental results showed that，the anti-tumor rates in low/middle/high doses of garcinia yunnanensis group were 12.5%，20.83% and 29.17%，which were significantly different from the normal control group （P<0.01）.The apoptosis rate of tumor cells was increased with the increasing of extract concentration of garcinia yunnanensis，which showed a dose-dependent manner （P<0.05）.Garcinia yunnanensis could significantly reduce the expression of cyclinE1，c-Met and hnRNPK with a dose-dependent manner （P<0.01）.Conclusion：Garcinia yunnanensis has an obvious anti-tumor effect in vivo，and it may inhibit the proliferation of tumor cells in vivo by reducing the expression of cyclinE1，c-Met and hnRNPK.

Key Words Garcinia yunnanensis； Colorectal cancer； Nude mice； Apoptosis； CyclinE1； C-Met； HnRNPK

中圖分類(lèi)號(hào)：R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.02.035

大腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率逐年上升[1-2]。目前，大腸癌的治療多以手術(shù)治療為主，但大多數(shù)患者發(fā)病時(shí)已屬晚期，治療及預(yù)后不佳。中醫(yī)藥在防治大腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及改善患者生存質(zhì)量方面具有較好的治療優(yōu)勢(shì)[3-4]，但臨床治療效果個(gè)體差異較大，作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)仍有待進(jìn)一步明確。我們前期研究表明云南藤黃及其提取的單體成分具有對(duì)大腸癌抗凋亡作用[5]，但是云南藤黃抗大腸癌的作用機(jī)制仍不明確。因此，我們建立裸鼠人結(jié)腸癌皮下移植瘤耐藥模型，采用云南藤黃提取物進(jìn)行治療，觀察其對(duì)裸鼠人結(jié)腸癌的治療效果，旨在探討云南藤黃提取物體內(nèi)抑制大腸癌的作用機(jī)制，為其在臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人腸癌SW620細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞研究所。

1.1.2 動(dòng)物

Babl/c/nu代小鼠30只，雄性，體質(zhì)量（18±2）g，SPF級(jí)，購(gòu)自中科院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證編號(hào)：SCHK（新）2010-0005。實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)1周。

1.1.3 藥物 云南藤黃（Garcinia yunnanensis）采集于中國(guó)云南省，由中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園王洪教授鑒定，樣品保存在上海中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新中藥實(shí)驗(yàn)室。云南藤黃的果皮經(jīng)剝離粉碎成粗粉，取100 g果皮粗粉，用500 mL 95%乙醇于室溫浸泡24 h后，90 ℃加熱回流3次，第2次與第3次均為500 mL，每次1 h。合并3次濾液，濃縮至浸膏。實(shí)驗(yàn)前定量稱(chēng)取，紫外線(xiàn)照射滅菌，無(wú)菌蒸餾水溶解，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 試劑 5-氟脲嘧啶（5-FU）為上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：20070802），抗體，四甲基偶氮唑鹽MTT購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人腸癌SW620細(xì)胞于含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)液（含青霉素、鏈霉素各100（U/mL）中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 模型制備與分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人腸癌SW620細(xì)胞，以5×106/只數(shù)量接種于小鼠腋下。7～10 d后形成腫瘤，生長(zhǎng)旺盛期的瘤組織剪切成1 mm3左右，在無(wú)菌條件下，接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，如此傳3代后，大批接種裸鼠腋下，待瘤體生長(zhǎng)約100 mm3隨機(jī)分為5組。

1.2.3 給藥方法 每組6只，分別為模型組，陽(yáng)性對(duì)照（5-FU）組，云南藤黃提取物低、中、高劑量聯(lián)合5-FU組。云南藤黃提取物低2.56 mg/（kg·d）、中5.12 mg/（kg·d）、高10.24 mg/（kg·d）劑量組分別每只灌胃，5-FU組尾靜脈注射0.5 mg/（kg·d）的5-FU，模型組每天注射等量的生理鹽水，連續(xù)給藥28 d后，每組中隨機(jī)取6只荷瘤裸鼠以頸椎脫臼法處死，剝離腫瘤組織，稱(chēng)重，測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、寬及質(zhì)量。計(jì)算抑瘤率：抑瘤率（%）=（對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Ki-67蛋白的表達(dá)水平在LNCaP。

組織采用中性福爾馬林4 ℃過(guò)夜固定，進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋并切片。表面抗原修復(fù)后孵育一抗hnRNPK，cyclinE1和c-Met（1∶500）并在4 ℃過(guò)夜；室溫放置10 min，孵育二抗30 min后，與HRP生物標(biāo)志鏈反應(yīng)；蘇木素染色5～20 min，蒸餾水沖洗2 min，鹽酸乙醇分化15 s后蒸餾水沖洗泛藍(lán)5 min；脫水后以中性樹(shù)脂封片，晾干，置于顯微鏡下拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較，采用Independent-Samples T Test，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)（Student-Newman-Keuls法），求出組間差異。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 云南藤黃提取物對(duì)大腸癌HCT-116細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況的影響

給藥前用游標(biāo)卡尺測(cè)量給藥前各組小鼠腫瘤體積大小，各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。給藥1周各組瘤體差別不明顯，進(jìn)食飲水如常，隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)，各組瘤體大小逐漸出現(xiàn)差距，在用藥24 d開(kāi)始，各組瘤體體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，陽(yáng)性對(duì)照組和云南藤黃提取物高劑量組的瘤體體積相比，有明顯的縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。但是云南藤黃提取物各劑量組對(duì)腫瘤的抑制作用不如陽(yáng)性對(duì)照組。提示云南藤黃提取物可以抑制裸鼠腸癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)，且呈劑量依賴(lài)性。

2.2 云南藤黃提取物對(duì)大腸癌裸鼠皮下移植瘤抑制率的影響

依表1可見(jiàn)，云南藤黃提取物各個(gè)劑量組和5-FU組的皮下移植瘤質(zhì)量均低于模型對(duì)照組（P<0.05），5-FU組的抑瘤率最高，云南藤黃提取物劑量組隨云南藤黃取物劑量的升高，抑瘤率逐漸升高，呈劑量依賴(lài)性。

2.3 云南藤黃提取物對(duì)大腸癌裸鼠移植瘤組織中細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL檢測(cè)顯示：與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組中腸癌組織細(xì)胞凋亡率最高（P<0.01）；云南藤黃提取物劑量組腫瘤組織中腸癌組織細(xì)胞凋亡率明顯高于模型組（P<0.05）。見(jiàn)圖2、圖3。圖2結(jié)果顯示，云南藤黃提取物治療的裸鼠，其腫瘤內(nèi)凋亡的細(xì)胞明顯增加（P<0.01）；云南藤黃提取物低、中、高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組（5-FU）相比凋亡細(xì)胞均明顯減少，且具有劑量依賴(lài)性，云南藤黃提取物低劑量組與高劑量組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 云南藤黃提取物對(duì)裸鼠移植瘤組織細(xì)胞內(nèi)cyclinE1，c-Met和hnRNPK的影響

治療后，模型對(duì)照組腫瘤組織中cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達(dá)陽(yáng)性率均高于治療組（P<0.05），陽(yáng)性對(duì)照組中hnRNPK，cyclinE1和c-Met的表達(dá)與模型對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示5-FU對(duì)大腸癌SW620裸鼠皮下移植瘤的抑制作用可能與hnRNPK，cyclinE1和c-Met無(wú)關(guān)。但是與對(duì)照組相比，云南藤黃提取物各劑量組的hnRNPK，cyclinE1和c-Met的表達(dá)明顯低于模型對(duì)照組，且成劑量依賴(lài)性（P<0.05），提示云南藤黃提取物能夠降低大腸癌SW620裸鼠皮下移植瘤組織內(nèi)cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖4、表2、表3、表4。

3 討論

目前，在多種腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期素E（CyclinE）的基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)失調(diào)，CyclinE的異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，該基因已經(jīng)被證實(shí)是一種癌基因[6]。有報(bào)道稱(chēng)，CyclinE的過(guò)度表達(dá)與大腸癌的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)[7]；抑制CyclinE的表達(dá)可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期在G1-S期限制點(diǎn)的轉(zhuǎn)化，阻滯細(xì)胞周期，控制腫瘤發(fā)生發(fā)展[8]。

原癌基因c-Met屬于具有酪氨酸激酶活性的生長(zhǎng)因子受體類(lèi)，編碼肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）受體，它參與細(xì)胞信息傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重排的調(diào)控，是細(xì)胞增殖、分化和運(yùn)動(dòng)的重要因素[9，10]。目前研究表明，c-Met基因在大腸癌組織中的表達(dá)明顯高于大腸腺瘤組織和正常大腸黏膜組織，且與腫瘤的浸潤(rùn)深度、Dukes分期、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示c-Met的過(guò)度表達(dá)在大腸腺瘤發(fā)展至大腸腺癌的過(guò)程中可能發(fā)揮一定作用[11]。

hnRNPs是存在于細(xì)胞核中，由30多個(gè)蛋白質(zhì)小分子組成的一種RNA結(jié)合蛋白族[12]。在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、前體mRNA剪切、mRNA輸出和降解等方面起著重要的作用[13]。hnRNPK是該家族中的一員，與多種癌基因及生長(zhǎng)因子有密切的關(guān)系[14]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：從中國(guó)藤黃屬植物怒江藤黃（Garcinia nujiangensis C.Y.Wu et Y.H.Li）中分離的化合物Nujiangexanthone A（NJXA）通過(guò)下調(diào)宮頸癌細(xì)胞HeLa中hnRNPK和CyclinE的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的合成、死亡以及細(xì)胞周期的改變[15]。云南藤黃為其同屬植物，且已證實(shí)云南藤黃及其提取的單體成分具有對(duì)大腸癌抗凋亡作用[5]，其單體成分Oblongifolin C對(duì)c-Met蛋白激酶具有較好的抑制活性[16]，但對(duì)大腸癌體內(nèi)的研究目前尚未開(kāi)展，因此本實(shí)驗(yàn)旨在探索云南藤黃對(duì)大腸癌裸鼠實(shí)體瘤的抑制效果以及具體的作用機(jī)制。

云南藤黃（Garcinia yunnanensis Hu）為中國(guó)藤黃屬植物，又名小姑娘果，是我國(guó)特有種，分布于云南省西南部，生于海拔1 300～1 600 m丘陵、坡地的雜木林中。其果實(shí)成熟后味酸甜，當(dāng)?shù)孛褡逑彩秤肹17]。現(xiàn)代研究表明，云南藤黃所含化合物具有抗腫瘤和抗炎活性[18-19]。近年來(lái)，本課題組對(duì)云南藤黃進(jìn)行了系統(tǒng)的抗腫瘤活性成分研究，提取并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)具有顯著抗腫瘤活性的化合物。體外實(shí)驗(yàn)表明，云南藤黃中的有效成分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抗癌活性，包括人肝癌細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）、人結(jié)腸癌細(xì)胞株（HCT116細(xì)胞）、人乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7）以及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）[20-27]。本研究旨在建立大腸癌裸鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，探討云南藤黃對(duì)大腸癌的抑制效果及其作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與治療組在裸鼠體重、生活質(zhì)量方面無(wú)明顯差異。治療前3周，模型對(duì)照組與云南藤黃各劑量組瘤體大小差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)入第4周后，隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)，各組瘤體大小逐漸出現(xiàn)差距，在用藥28 d時(shí)，云南藤黃各組呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性的抑制腫瘤的生長(zhǎng)（P<0.01）。該結(jié)果與課題組前期的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明云南藤黃能夠抑制人大腸癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。TUNEL結(jié)果顯示，云南藤黃對(duì)裸鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡也具有抑制作用，且成劑量依賴(lài)性。此外，本研究結(jié)果還顯示，大腸癌SW620裸鼠皮下移植瘤組織內(nèi)cyclinE1，c-Met和hnRNPK的表達(dá)較高，給予云南藤黃治療后，其表達(dá)明顯下降（P<0.01）。提示云南藤黃抑制大腸癌的生長(zhǎng)可能與調(diào)節(jié)cyclinE1，c-Met和hnRNPK三者相關(guān)。說(shuō)明云南藤黃可能是通過(guò)下降cyclinE1，c-Met和hnRNPK等蛋白的表達(dá)抑制大腸癌的生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究在前期證實(shí)云南藤黃及其有效成分具有抗腫瘤的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)云南藤黃提取物可以抑制人腸癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)，增加腫瘤抑制率，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。并且，以劑量依賴(lài)的方式降低cyclinE1，c-Met和hnRNPK蛋白的表達(dá)。因此，明確云南藤黃在人腸癌中的作用及具體機(jī)制，將是我們今后需要深入研究的方向，鑒于其來(lái)源于植物，在當(dāng)?shù)鼐哂锌墒秤?、不良反?yīng)小的臨床使用價(jià)值。后期研究云南藤黃抗腫瘤活性的靶向性將是我們進(jìn)一步需要深入探討的課題。

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