雙酶混合催化水解河蜆肉蛋白工藝條件的優(yōu)化

黃茂坤，林 孌

（1.黎明職業(yè)大學(xué) 輕紡工程學(xué)院，福建 泉州 362000；2.泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362000）

雙酶混合催化水解河蜆肉蛋白工藝條件的優(yōu)化

黃茂坤1，林 孌2

（1.黎明職業(yè)大學(xué) 輕紡工程學(xué)院，福建 泉州 362000；2.泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362000）

以新鮮河蜆為原料，以水解度和氮收率為指標(biāo)，確定采用質(zhì)量比為1：1混合的木瓜蛋白酶和胰蛋白酶催化水解河蜆肉樣品，并以水解度為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定了混合蛋白酶催化水解河蜆肉蛋白的最優(yōu)工藝條件為：液料比5∶1、混合蛋白酶添加量1.4%、水解溫度50℃、水解時(shí)間3h、pH7.0，此時(shí)河蜆肉蛋白水解度為48.94%，氮收率為70.13%。

河蜆；雙酶；混合；水解度

河蜆，又稱黃蜆、金蚶、扁螺等，是雙殼軟體動(dòng)物，屬于瓣鰓綱真瓣鰓目蜆科蜆屬，是我國重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一[1]。河蜆廣泛分布在湖泊、江河中，其肉味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)良的高蛋白含量食物原料。據(jù)相關(guān)研究顯示[2]，河蜆干樣中粗蛋白質(zhì)含量達(dá)63.33%，高于文蛤、牡蠣、美洲簾蛤、翡翠貽貝等常見貝類產(chǎn)品，且其基本組成單位——氨基酸的種類齊全，共含有17種氨基酸，其中人體必需的氨基酸有7種，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。另外，河蜆還含有脂類、碳水化合物、維生素和鈣、磷、鐵、硒等多種具有特殊生理功能的礦物質(zhì)，有一定的藥用價(jià)值，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也表明：河蜆提取物具有巨噬細(xì)胞吞噬活性的作用[3]。

目前，河蜆仍以鮮食為主，常見的加工方式是將其制作成河蜆干或者河蜆罐頭，加工利用水平有待進(jìn)一步提高。酶催化水解技術(shù)在水產(chǎn)品深度加工中已有廣泛應(yīng)用，采用蛋白酶對(duì)河蜆肉進(jìn)行催化水解處理，可使河蜆肉的營養(yǎng)功效成分充分釋放出來，并將高分子蛋白水解成小分子多肽和各種呈味氨基酸，有利于將河蜆加工制作成調(diào)味料或其他功能性產(chǎn)品?？紤]到不同蛋白酶對(duì)同一底物具有不同的水解作用位點(diǎn)，使用單一蛋白酶催化水解處理河蜆肉樣品的效果有限，而不同蛋白酶混合使用，可能具有協(xié)同增效作用，本試驗(yàn)采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶兩種蛋白酶混合后處理河蜆肉樣品，并對(duì)其催化水解條件進(jìn)行優(yōu)化，以期找出更高效的蛋白酶催化水解工藝，為河蜆的深度開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮河蜆（購于泉州市豐澤區(qū)東海農(nóng)貿(mào)市場）；木瓜蛋白酶（酶活力≥6000 u/mg、BR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；胰蛋白酶（酶活力1000～1500 u/mg、BR，上海展云化工有限公司）；硼酸（AR，西隴化工股份有限公司）；氫氧化鈉（AR，西隴化工股份有限公司）；鹽酸（AR，西隴化工股份有限公司）；甲基紅（IND，西隴化工股份有限公司）；亞甲基藍(lán)（IND，西隴化工股份有限公司）；乙醇（AR，西隴化工股份有限公司）；過氧化氫（AR，西隴化工股份有限公司）；硫酸（AR，西隴化工股份有限公司）；硫酸鉀（AR，西隴化工股份有限公司）；硫酸銅（AR，西隴化工股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C020型攪拌機(jī)，九陽股份有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AL104-IC型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；K-98-II型電子調(diào)溫萬用電爐，天津市泰斯特儀器有限公司；PE20型PH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHB-Ⅲ磁力攪拌水浴鍋，金壇市良友儀器有限公司；78HW-1型恒溫磁力攪拌器，金壇市憶通電子有限公司；凱氏定氮儀實(shí)驗(yàn)裝置。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

新鮮河蜆吐沙后洗凈→置于沸水中熱燙10 s開殼→取肉→攪碎→定量稱取5 g樣品→加水勻漿→保溫至預(yù)設(shè)酶水解溫度→調(diào)節(jié)pH→添加混合蛋白酶→置于磁力攪拌水浴鍋恒溫水解→100℃水浴加熱處理10 min滅酶→冷卻→4500 r/min離心處理15 min→取上清液→殘?jiān)谜麴s水洗滌→二次離心→合并上清液，定容→測定指標(biāo)。

1.3.2 雙酶混合質(zhì)量比例的選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別按質(zhì)量比例 0∶1、1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1 定量混合木瓜蛋白酶和胰蛋白酶兩種酶制劑，配制出七種試驗(yàn)用酶。在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將混合蛋白酶催化水解條件約束為液料比5∶1、pH為7.0、加酶量為1.2%、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3 h，以河蜆肉蛋白水解度和氮收率為考察指標(biāo)，選擇水解效果最好的雙蛋白酶混合比例。

1.3.3 混合蛋白酶水解河蜆肉蛋白的單因素試驗(yàn)方案

由于混合蛋白酶的添加量與水解底物河蜆肉在反應(yīng)體系中的分散度存在明顯的相互關(guān)系，本試驗(yàn)不考慮酶催化水解反應(yīng)的底物因素，將酶催化水解反應(yīng)約束條件的液料比固定為5∶1，以河蜆肉蛋白水解度為水解效果考察指標(biāo)，分別研究混合蛋白酶添加量、水解溫度、水解時(shí)間、水解pH4個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果取3次平行試驗(yàn)所測指標(biāo)的平均值，具體方案設(shè)計(jì)如下：

(1）固定酶水解溫度為50℃，水解時(shí)間為3 h，水解pH為7.0，考察混合蛋白酶添加量分別為水解底物質(zhì)量0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%的水解效果；

(2）固定混合蛋白酶添加量1.5%，水解時(shí)間為3 h，水解pH為7.0，考察水解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃的水解效果；

(3）固定水解溫度50℃，混合蛋白酶添加量為 1.5%，pH為7.0，考察水解時(shí)間分別為 1、2、3、4、5、6 h的水解效果；

(4）固定水解溫度50℃，混合蛋白酶添加量為1.5%，酶解時(shí)間3 h，考察水解pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的水解效果。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[4]

采用L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化混合蛋白酶催化水解工藝條件。不考慮因素交互作用的影響，以河蜆肉蛋白水解度為考察指標(biāo)，在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定混合蛋白酶添加量 （A）、水解溫度（B）、水解時(shí)間（C）、水解 pH（D）4 個(gè)因素的水平范圍，于液料比為5∶1的條件下進(jìn)行催化水解試驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

1.4 測定方法

(1)總氮含量的測定：采用GB5009.5-2010凱式定氮法。

(2)氨基態(tài)氮含量的測定：電位滴定法[5]。

(3)氮收率和水解度的計(jì)算公式[6]:

2 結(jié)果與分析

2.1 雙酶混合質(zhì)量比例的選擇試驗(yàn)結(jié)果

氮收率代表的是河蜆肉被酶催化水解處理后，含氮成分進(jìn)入到水解液的情況，反映的是含氮物質(zhì)的利用程度，數(shù)值越大，說明水解液里面含氮物質(zhì)的利用程度越高；而水解度指的是河蜆肉中蛋白質(zhì)被酶催化水解的程度，其數(shù)值越大說明水解效果越好。由表2試驗(yàn)結(jié)果可知，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶混合后處理河蜆肉樣品，測得的氮收率和水解度兩個(gè)指標(biāo)值相較于單獨(dú)使用木瓜蛋白酶（木瓜蛋白酶與胰蛋白酶質(zhì)量比為1∶0組）處理河蜆肉樣品測得的值均有所提高，這說明，胰蛋白酶與木瓜蛋白酶混合使用，對(duì)木瓜蛋白酶的催化水解作用具有一定的協(xié)同增效作用。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，并綜合考慮氮收率和水解度兩個(gè)指標(biāo)的內(nèi)涵意義，最終確定質(zhì)量比為1∶1的木瓜蛋白酶和胰蛋白酶混合酶為本試驗(yàn)用酶，該酶的催化水解效果亦明顯高于單獨(dú)使用胰蛋白酶（木瓜蛋白酶與胰蛋白酶質(zhì)量比為0∶1組）的處理效果。

表2 不同質(zhì)量比例混合雙酶的催化水解試驗(yàn)結(jié)果

2.2 混合蛋白酶催化水解河蜆肉蛋白的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 混合蛋白酶添加量對(duì)河蜆肉蛋白水解效果的影響

由圖1可以看出混合蛋白酶添加量在0.3%～1.5%范圍內(nèi)時(shí)，河蜆肉蛋白水解度隨著添加量的增加而呈增長趨勢(shì)，且增長速度越來越緩慢。當(dāng)混合蛋白酶添加量超過1.5%后，河蜆肉蛋白水解度開始下降。這可能是因?yàn)?，在同一個(gè)酶反應(yīng)體系中，混合蛋白酶催化底物河蜆肉蛋白水解反應(yīng)的作用位點(diǎn)是相對(duì)固定的，當(dāng)混合酶添加量達(dá)到1.5%時(shí)，混合蛋白酶與河蜆肉蛋白反應(yīng)作用位點(diǎn)的結(jié)合趨于飽和，此時(shí)的催化水解反應(yīng)速度和程度基本達(dá)到頂峰；而繼續(xù)提高混合蛋白酶的添加量，因蛋白酶本身亦是蛋白質(zhì)，其催化水解作用反而會(huì)受到抑制而影響底物的最終水解效果。

2.2.2 混合蛋白酶催化水解溫度對(duì)河蜆肉蛋白水解效果的影響

由圖2可以看出，在35～50℃范圍內(nèi)，河蜆肉蛋白水解度隨著混合蛋白酶催化水解溫度的升高而增大，當(dāng)水解溫度超過50℃以后，繼續(xù)提高催化水解溫度，河蜆肉蛋白水解度開始呈下降趨勢(shì)。溫度是影響酶催化水解反應(yīng)的重要因素，不同種類的酶有其不同的最適催化水解反應(yīng)溫度，正常情況下，在最適催化水解反應(yīng)溫度范圍內(nèi)，酶催化水解反應(yīng)速度和程度隨著反應(yīng)溫度的升高而提高，但超過最適催化水解反應(yīng)溫度后，進(jìn)一步提高反應(yīng)溫度有可能導(dǎo)致酶催化活性的減弱甚至失活，從該試驗(yàn)結(jié)果可知，混合蛋白酶的最適催化水解反應(yīng)溫度在50℃左右。

圖1 混合蛋白酶添加量對(duì)河蜆肉蛋白水解度的影響

圖2 催化水解溫度對(duì)和河蜆蛋白水解度的影響

2.2.3 混合蛋白酶催化水解時(shí)間對(duì)河蜆肉蛋白水解效果的影響

由圖3可以看出，隨著混合蛋白酶催化水解反應(yīng)時(shí)間的延長，河蜆肉蛋白水解度剛開始呈不斷上升的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到3.0 h后，河蜆肉蛋白水解度略有下降，且變化逐步趨于平衡。這可能是因?yàn)?，隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，混合蛋白酶不斷與反應(yīng)底物接觸結(jié)合，底物不斷被催化水解，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，水解度達(dá)到峰值，繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，水解產(chǎn)物的增加反而導(dǎo)致酶催化水解逆反應(yīng)的發(fā)生，所以，3 h后水解度的變化會(huì)略有下降，并隨著酶催化反應(yīng)體系慢慢進(jìn)入動(dòng)態(tài)平衡而趨于平衡。

2.2.4 水解pH對(duì)河蜆肉蛋白水解效果的影響

由圖4可以看出，在pH為5.5～8.0的范圍內(nèi)，河蜆肉蛋白水解度隨著pH的增大呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH為7.0時(shí)，河蜆肉蛋白水解度達(dá)到最大值。這是因?yàn)槊恳环N酶都有其最適的催化水解反應(yīng)pH范圍，pH偏離得太遠(yuǎn)，會(huì)影響酶反應(yīng)體系中各種反應(yīng)因子的解離狀態(tài)，降低酶反應(yīng)活性，不利于催化水解反應(yīng)的進(jìn)行。因此，最適pH為7.0左右較合適。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)表3的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析，分析結(jié)果分別見表4和表5。根據(jù)表4可知，正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳酶催化水解工藝條件組合為A1B2C2D2，即混合蛋白酶添加量為1.4%、水解溫度為50℃、水解時(shí)間為3 h、pH為7.0。根據(jù)表5可知，因素B、C、D對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著，因素A對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小為：C（水解時(shí)間）＞B（水解溫度）＞D（水解pH）＞A（混合蛋白酶添加量）。在液料比為5∶1的條件下，采用上述得出的最優(yōu)工藝組合條件A1B2C2D2處理河蜆肉樣品進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果測得河蜆肉蛋白水解度為48.94%，氮收率為70.13%。

圖3 催化水解時(shí)間對(duì)和河蜆蛋白水解度的影響

圖4 pH對(duì)和河蜆蛋白水解度的影響

表3 混合蛋白酶催化水解河蜆肉蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 混合蛋白酶催化水解河蜆肉蛋白試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

3 結(jié)論

通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析與驗(yàn)證，得出木瓜蛋白酶與胰蛋白酶按質(zhì)量比1∶1混合后處理河蜆肉樣品，催化水解河蜆肉蛋白的效果要優(yōu)于該兩種酶單獨(dú)使用的效果；對(duì)上述混合蛋白酶的催化水解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)工藝條件為：液料比5∶1、混合蛋白酶添加量1.4%、水解溫度50℃、水解時(shí)間3 h、pH7.0，采用該工藝條件處理河蜆肉樣品，測得河蜆肉蛋白水解度為48.94%，氮收率為70.13%。本試驗(yàn)方法高效環(huán)保，極具開發(fā)前景，為低值水產(chǎn)品河蜆的深度開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。試驗(yàn)制備的酶水解液，富含低分子肽和各類氨基酸，可作為開發(fā)液態(tài)水產(chǎn)調(diào)味品的風(fēng)味基料，但該酶水解液具有一定的苦味和腥味，后續(xù)研究中可通過分析酶水解液的組成成分，探索其苦味和腥味的掩埋方法等，進(jìn)一步提高河蜆的開發(fā)利用價(jià)值。

表5 混合蛋白酶催化水解河蜆肉蛋白試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

[1]劉晶晶，黃婷，顧云，等．可控酶解河蜆蛋白質(zhì)的工藝優(yōu)化[J]．食品工業(yè)科技，2013，38（1）：109－113．

[2]韓鵬，王勤．河蜆軟體部分營養(yǎng)成分分析及評(píng)價(jià)[J]．廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，46（1）：115－117．

[3 ]KONG Z L，CHIANG L C，F(xiàn)ANG F，et al．Immune bioactivity in shellfish toward serum－free cultured human cell lines[J]．Biosci Biotechnol Biochem，1997，61（1）：24－28．

[4]王欽德，楊堅(jiān)．食品試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2010：260－280．

[5]寧正祥．食品成分分析手冊(cè)[M]．北京：中國輕工業(yè)出版社，1998：117－121．

[6]林孌，黃茂坤，董樂，等．風(fēng)味蛋白酶水解河蜆蛋白的條件優(yōu)化[J]．食品工業(yè)，2014，25（11）：92－95．

The Process Condition Optimization of Double-enzyme Mixed Catalytic Hydrolysis to Corbicula fluminea Protein

HUANG Mao-kun1,LIN Luan2
（1.College of Light-Textile Engineering,Liming Vocational University,Quanzhou 362000,China；2.College of Oceanology and Food Science,Quanzhou Normal Unibersity,Quanzhou 362000,China.）

Taking the freshCorbicula flumineaas raw material,the degree of hydrolysis and nitrogen recovery as index,the Corbicula fluminea sample was hydrolyzed with the enzyme hydrolytic technique in which the mass ratio 1∶1 papain and trypsin were added simultaneously.By single factor and orthogonal experiments and taking the degree of hydrolysis as index,the results showed that the optimum conditions with mixed hydrolysis toCorbicula flumineaprotein as follows:liquid-solid ratio was 5∶1,mixed protease amount 1.4%,hydrolysis temperature 50℃,hydrolysis time 3h and pH 7.0.At this point,the degree of hydrolysis toCorbicula flumineaprotein was 48.94%,nitrogen recovery was 70.13%.

Corbicula fluminea；double-enzyme；mixed； hydrolysis degree

TS201.21

A

1673-4343（2017）06-0062-06

10．14098/j．cn35－1288/z．2017．06．010

2017-6-28

福建省泉州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013Z40）

黃茂坤，男，福建南安人，講師。主要研究方向：食品加工。

朱聯(lián)九）