粉防己堿對銅綠微囊藻的化感作用

郭孝玉，張瀟月，李奇勇1， ，張麗華1， ，劉冬玲1，，林曉娟 ，王穩(wěn)健,張 嚴1，

(1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)經(jīng)營利用重點實驗室,福建 三明365004；2.三明學院 資源與化工學院,福建 三明 365004)

粉防己堿對銅綠微囊藻的化感作用

郭孝玉1,2，張瀟月2，李奇勇1，2，張麗華1，2，劉冬玲1，2，林曉娟2，王穩(wěn)健2,張 嚴1，2

(1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)經(jīng)營利用重點實驗室,福建 三明365004；2.三明學院 資源與化工學院,福建 三明 365004)

篩選高效化感物質(zhì)是生物防治水華現(xiàn)象研究的熱點問題，為了探析防己提取的粉防己堿對銅綠微囊藻的化感作用，采用控制對比實驗，設(shè)置對照和0.1、0.2、0.3和0.4 mg/L 4種粉防己堿濃度，觀測銅綠微囊藻的生長動態(tài)。研究表明：粉防己堿顯著抑制銅綠微囊藻生長，粉防己堿水溶液濃度越大抑藻作用越明顯，最高抑制率達97%，0.40 mg/L為最佳抑藻濃度。粉防己堿為抑制藍藻生長提供新的依據(jù)，為治理銅綠微囊藻爆發(fā)生長，提供高效環(huán)保材料和措施的新思路。

銅綠微囊藻；粉防己堿；防己；藍藻水華；半效濃度

當前,水體富營養(yǎng)化已經(jīng)成為全球性的環(huán)境問題,大量N、P、K等養(yǎng)分通過各種途徑進入水體，引起水體富營養(yǎng)化導致藍藻類爆發(fā)性生長[1]。藍藻水華不僅會造成水生生物的大量死亡，還產(chǎn)生藻毒素和臭味污染水源，影響飲用水安全[2-3]。銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）是藍藻水華最常見的藻種，具有很強的光合作用能力。國內(nèi)外針對水體富營養(yǎng)化引起藍藻爆發(fā)防治的方法主要分為物理法、化學法和生物法[4-6]。眾多學者研究認為通過生物化感作用防治藍藻水華現(xiàn)象，是一種高效且安全的抑藻方法,許多學者研究了水生或旱生植物的浸提取物對銅綠微囊藻生長抑制效果，取得顯著成效，如蘆竹、蘆葦、菖蒲、荇菜、鳳眼蓮和睡蓮提取物挺水植物[7-9]，菹草、光葉眼子菜和金魚藻、黑藻、穗花狐尾藻等沉水植物[10-11]，也有石蒜科植物如洋蔥、大蔥及鮮韭菜等農(nóng)作物[12]，甚至用茱萸、香加皮、蒼耳子、五倍子、防己等中藥材的提取物[13-16]，這些植物組織器官均對特定藻類表現(xiàn)出明顯的化感抑制作用。

防己（Stephania tetrandra）為多年生藤本，廣泛分布浙江、福建、江西等地，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒和抗高血壓等效用[17]。柴民偉等（2010）研究了12種具有消炎抑菌作用中藥用植物干品對蛋白核小球藻的抑制效果，發(fā)現(xiàn)防己水浸提物在相對濃度為1 g/L時，抑藻效應(yīng)最佳[16]。防己對治理水華爆發(fā)有較好的應(yīng)用前景,但防己浸提物中的化感活性物質(zhì)對銅綠微囊藻細胞的作用機理仍不十分明確，尚未見報道。本研究分析粉防己堿對銅綠微囊藻化感效應(yīng)，為闡明粉防己堿的化感作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藻種為藍藻門的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)，該藻種購自中國科學院武漢淡水藻種庫，將無菌環(huán)境中配置的BG-11培養(yǎng)基置于50 mL錐形瓶中無菌培養(yǎng)，光暗比為12 h∶12 h人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，白天溫度為25±1℃，夜晚溫度為18±1℃，每天手工輕輕搖動2～4次，光照強度為2000 lx、濕度為95%[1,8,14]。觀察其長到對數(shù)期再轉(zhuǎn)接一次，鏡檢無雜藻且生長良好，作為試驗藻種。供試的抑藻物質(zhì)為防己提取的粉防己堿，純度大于98%，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 粉防己堿溶液配制

粉防己堿水溶液的配制：用電子天平（CP-214）稱量得0.9 mg粉防己堿試劑，溶解于25 mL無菌容量瓶，加蒸餾水至刻度，震蕩搖勻，放入溫度設(shè)置為25℃，頻率調(diào)為100%的超聲清洗器中處理2 h使其溶于水，配制成粉防己堿水溶液相對濃度為36.0 mg/L母液。

1.3 實驗步驟

（1）高溫高壓對BG-11溶液培養(yǎng)基滅菌：將BG-11溶液每20 mL移于50 mL錐形瓶中，用面塞塞住，用報紙和棉線將每個小瓶包扎好，放入高壓滅菌鍋滅菌，溫度設(shè)為121℃，進行高溫高壓滅菌。

（2）銅綠微囊藻的接種：在超凈臺中，將所有的培養(yǎng)基和藻種、移液槍、燒杯、酒精燈等需要的物品用酒精消毒后，在酒精燈旁用移液槍分別向培養(yǎng)銅綠微囊藻的小錐形瓶中加入20 μL原處于對數(shù)生長期的藻，藻細胞初始密度均為5.0×105cells/mL。

（3）接入粉防己堿溶液：用移液槍分別向培養(yǎng)銅綠微囊藻的小錐形瓶中加入不同體積的粉防己堿水溶液的母液，使粉防己堿的濃度分別為0.1、0.2、0.3和0.4 mg/L 4種各3個平行樣，同時對照（CK）實驗樣中加入等量的蒸餾水，共設(shè)置5組，將其全部放入人工氣候培養(yǎng)箱中，按設(shè)置條件開始試驗每隔24 h用血球計數(shù)板在雙目顯微鏡下對樣品進行數(shù)藻，記錄觀測時間日期和藻密度，連續(xù)追蹤7 d。如此設(shè)置做4次重復實驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將銅綠微囊藻細胞計數(shù)轉(zhuǎn)換為藻類密度（N/mL），采用單因素方差分析粉防己堿對銅綠微囊藻的影響，采用Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗進行多重比較。藻類生長抑制率(IR)計算公式:IR(%)=(1－N/N0)×100%，其中N為處理組藻類密度，N0為同期對照組的藻類密度。通過Logit概率模型求出各濃度化感物質(zhì)的半效濃度EC50,確定最佳防治銅綠微囊藻生長的劑量。實驗所得數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS2 0.0軟件處理與分析。

2 結(jié)論與討論

2.1 粉防己堿水溶液對銅綠微囊藻生長的影響

粉防己堿4種濃度與對照組（CK）分別連續(xù)觀測7 d，銅綠微囊藻生長變化情況見圖1：對照組（CK）和0.1 mg/L濃度的粉防己堿，藻類生長規(guī)律均為先緩慢增長到指數(shù)增長，第7天對照組的藻密度達 1.86×107cells/mL,0.1mg/L 的藻密度為 1.13×107cells/ml；但濃度為 0.2、0.3、0.4 mg/L 粉防己堿溶液對銅綠微囊藻呈現(xiàn)明顯的抑制作用，第4天后均呈下降趨勢，藻密度均低于1.9×106cells/mL，第7天藻密度在0.4～1.3×106cells/ml。從圖1（B）生長抑制率來看，濃度為0.2、0.3和0.4 mg/L處理的銅綠微囊藻生長抑制率在第4天達43%～53%，第5天達73%～87%，第6天達88%以上，而0.1 mg/L處理的藻類的生長抑制率在第4天后維持在35%左右，見表1。方差齊性檢驗表明第1天至第3天表現(xiàn)為方差齊性(p＞0.248)，各組間差異不顯著；而ANOVA方差分析表明防己濃度越大藻類生長抑制效果越明顯，第4天不同處理組間差異顯著（p＜0.05），第5天后不同組間達極顯著差異（p＜0.01）。不同時期銅綠微囊藻生長的SNK多重方差比較分析表明：前3天不同組間無顯著差異（p＞0.05），而第4天開始對照組CK與粉防己堿處理組有顯著差異，第5天開始0.1 mg/L處理組與0.2、0.3、0.4 mg/L組間有明顯差異（p＜0.05），,粉防己堿濃度越高抑藻效果越明顯，但SNK檢驗表明0.2、0.3和0.4 mg/L 組間無顯著差異（p＞0.11）。

圖1 粉防己堿濃度對銅綠微囊藻生長的影響

2.2 抑制銅綠微囊藻生長的半抑制粉防己堿濃度

采用Logit模型擬合銅綠微囊藻響應(yīng)粉防己堿濃度的效應(yīng)（見表2），模型的Chi-Square卡方檢驗值為1.525（p＜0.01），得到概率為0.5時半抑制濃度（EC50）值為0.40，與分析表明該抑藻實驗中粉防己堿濃度為0.40 mg/L的效果最佳。

表2 Logit模型參數(shù)估計a

2.3 分析與討論

粉防己堿是一種有效抑制藍藻生長的化感物質(zhì)。已有研究用高效液相色譜分析法驗證了防己浸提液中抑藻主要化學成分含有防己若林堿和粉防己堿，且它們均屬于芐基異喹啉類生物堿，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、看菌等多方面藥理作用[17-19]。銅綠微囊藻屬于藍藻門又和細菌有微妙相似點，由于藍藻門藻的細胞核結(jié)構(gòu)中無核膜核仁，細胞壁與細菌相似，屬原核生物，進行有絲分裂繁殖，由肽聚糖組成，革蘭染色呈陰性。Mo S,et al.(2010)報道了生物堿Hapalindole對細菌和真菌的抑制作用[20]，其抗炎殺菌的作用機理同樣也可能適用于細胞結(jié)構(gòu)類似細菌的銅綠微囊藻。王彩萍等（2006）研究顯示微量加熱法中粉防己堿對大腸桿菌有很好的抑制效果[21]，本研究也證實粉防己堿水溶液對銅綠微囊藻具有顯著的生長抑制作用（見表1），其他學者研究發(fā)現(xiàn)防己浸提液對綠藻門中蛋白核小球藻有抑制作用的[16]。本實驗第3天才觀察到有細胞破裂，粉防己堿類生物堿對銅綠微囊藻滲透作用過程比較緩慢，說明化感物質(zhì)對細胞器膜滲透性的影響，進而對細胞分裂、伸長和亞顯微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使細胞內(nèi)物質(zhì)大量滲出，影響酶的活性降低了光合效率而導致細胞衰退。本研究模擬得到最佳半效應(yīng)濃度(EC50)值為0.40 mg/L，這與其他學者研究結(jié)果一致，均在統(tǒng)一數(shù)量級，如李鋒民等（2007）研究從大型挺水植物蘆葦中分離鑒定出化感物質(zhì)2-甲基乙酰乙酸乙酯，對銅綠微囊藻化感抑制作用的半效應(yīng)濃度(EC50)值為0.65 mg/L[22]。防己是我國傳統(tǒng)的中藥材，為綜合利用中藥材達到“以廢治廢”，在防藍藻爆發(fā)時通過計算水體量獲得最有效濃度，在富營養(yǎng)水體里投放適宜量的粉防己堿母液，或在湖邊栽種防己植物，利用防己分泌產(chǎn)生的生物堿等，通過生物化感作用從而防治藍藻水華現(xiàn)象是一種有益的防治措施。

4 結(jié)論

粉防己堿水溶液對銅綠微囊藻的生長具有顯著的抑制作用，濃度越高抑制效果越好，當濃度為0.4 mg/L時，第6天后銅綠微囊藻生長抑制率達94%；抑制銅綠微囊藻的最佳濃度為0.40 mg/L。

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Growth and Allelopathic Effects of Microcystis Aeruginosa under Different Concentration Tetrandrine

GUO Xiao-yu1,2,ZHANG Xiao-yue2,LI Qi-yong1,2,ZHANG Li-hua1,2,LIU Dong-ling1,2,LIN Xiao-juan2,WANG Wen-jian2,ZHANG Yan1,2
(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Resources and Environment Monitoring&Sustainable Management and Utilization,Sanming 365004,China；2.College of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

Biology allelopathy is an efficient and safe biological control method to prevent Cyanobacterial bloomt.In order to verify the allelopathy of tetrandrine onMicrocystis aeruginosa,we used control experiments,designed control(CK)and four tetrandrine concentration(0.1 mg/L,0.2mg/L,0.3mg/L,0.4mg/L),for cultivatingMicrocystis aeruginosaand observating consecutive seven days.The results showed that tetrandrine inhibited the growth ofMicrocystis aeruginosa.The greater the concentration,the more obvious the inhibitory effect on algae,and the inhibition rate reached up 97%.When the concentration of tetrandrine was 0.40 mg/L,it was the best concentration of suppression of Microcystis aeruginosa.The results provide a new basis for exploring the effective way to restrain Cyanobacteria growth,and provide an environmental measures to treatment ofMicrocystis aeruginosa.

Microcystis aeruginosa;tetrandrine;the root of Menispermaceae;Cyanobacterial bloom;50%effect concentration

X171.5

A

1673-4343（2017）06-0057-05

10．14098/j．cn35－1288/z．2017．06．009

2017-06-05

福建省自然科學基金項目（2014J01136）；福建省中青年教師教育科研項目（科研A類）（JA14288）；三明學院大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目（ZL0917/CS）

郭孝玉，男，福建尤溪人，博士。主要研究方向：資源環(huán)境監(jiān)測與評價。通訊作者：張嚴，男，廣東平遠人，副教授。主要研究方向：有害藻類的植物化感抑制技術(shù)。

朱聯(lián)九）