氧化白藜蘆醇在體外抑制人肝癌細(xì)胞株增殖和遷移的實(shí)驗(yàn)研究

楊紅專 吳炳火 黃杰

(1.成都市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610031；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專業(yè)2016級(jí)本科生，四川 成都 610041)

氧化白藜蘆醇在體外抑制人肝癌細(xì)胞株增殖和遷移的實(shí)驗(yàn)研究

楊紅專1吳炳火2黃杰1

(1.成都市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610031；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專業(yè)2016級(jí)本科生，四川 成都 610041)

目的：研究氧化白藜蘆醇對(duì)體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞QGY-7701、SMMC-7721增殖和遷移能力的影響。方法采用MTT法測定氧化白藜蘆醇抑制肝癌細(xì)胞QGY-7701、SMMC-7721生長的IC50；采用Transwell法測定經(jīng)不同濃度氧化白藜蘆醇(25 μM、50 μM和100 μM)以及白藜蘆醇50 μM與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后細(xì)胞的遷移率。結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化白藜蘆醇抑制QGY-7701和SMMC-7721細(xì)胞的IC50值分別為100.37±21.97 μM和74.39±9.30 μM。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)25 μM、50 μM、100 μM氧化白藜蘆醇和白藜蘆醇50 μM處理24 h后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率分別是74.96±2.85%、60.26±9.25%、38.58±8.69%和46.80±8.43%。且與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)，氧化白藜蘆醇濃度越高，細(xì)胞遷移率越低。結(jié)論氧化白藜蘆醇具有抑制體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞QGY-7701、SMMC-7721的細(xì)胞增殖作用；可顯著抑制肝癌細(xì)胞QGY-7701、SMMC-7721在體外培養(yǎng)條件下的遷移能力，其抑制能力呈濃度依賴性。

氧化白藜蘆醇；肝癌細(xì)胞；增殖；遷移

原發(fā)性肝癌(Primary carcinoma of liver，PLC，簡稱肝癌)是原發(fā)于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管的惡性腫瘤，是全球發(fā)病率最高的癌癥之一，其新增患者人數(shù)已超過62.6萬/年，居惡性腫瘤第五位，死亡患者人數(shù)接近60萬/年，居腫瘤相關(guān)死亡第三位。PLC在我國高發(fā)，目前，我國發(fā)病患者約占全球的55%；在腫瘤相關(guān)死亡中僅次于肺癌，位居第二。腫瘤轉(zhuǎn)移[1](Metastases)是惡性腫瘤最為顯著的特點(diǎn)之一，也是腫瘤防治中的難點(diǎn)。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，只有10%腫瘤患者死于原發(fā)性腫瘤，另外90%腫瘤患者死于因腫瘤侵襲所致的病情惡化或復(fù)發(fā)[2]。腫瘤的轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細(xì)胞脫離其原發(fā)部位，在體內(nèi)通過各種途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)，到達(dá)與原發(fā)部位不連續(xù)的組織，繼續(xù)增殖生長并形成與原發(fā)腫瘤同樣病理性質(zhì)的繼發(fā)腫瘤的全過程，是惡性腫瘤危及生命的最主要生物學(xué)特性[3]。臨床數(shù)據(jù)顯示，近30%的患者在明確惡性腫瘤診斷之初，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而另有近30%的患者可能已經(jīng)存在隱匿的轉(zhuǎn)移病灶[4]。在對(duì)腫瘤的治療上，有學(xué)者認(rèn)為，未來腫瘤治療研究的關(guān)鍵應(yīng)該是能夠抑制或控制腫瘤轉(zhuǎn)移的治療方案和手段[5]。

自20世紀(jì)50年代起，系統(tǒng)性化療法就用于治療肝癌，但其發(fā)展與研究多年來始終停滯不前，迄今尚無標(biāo)準(zhǔn)化化療藥物或治療方案[6]。因此，尋找有效的化療藥物是目前研究肝癌藥物化療的熱點(diǎn)。白藜蘆醇(Resveatrol,trans-3,5,4′-trihydroxystilbene，Res)是一類天然來源的二苯乙烯類化合物，存在于虎杖、決明、藜蘆、葡萄、花生、桑椹等多種常見食物及藥用植物中。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有廣泛的藥理活性[7]，包括：心血管保護(hù)作用，抗氧化，抗炎，抗腫瘤等。白藜蘆醇作為抗炎藥已在德國上市，又因其具有顯著的癌癥預(yù)防及治療作用而備受關(guān)注。氧化白藜蘆醇(Oxyresveratrol trans-2,4,3′,5′-tetrahydroxystilbene，Oxyres.)[8]是天然來源的白藜蘆醇羥基衍生物，作為桑枝，菝葜等許多傳統(tǒng)中藥或民族藥的有效成分，研究顯示氧化白藜蘆醇具有諸多藥理活性，近年來也開始受到關(guān)注。氧化白藜蘆醇具有強(qiáng)大的抗酪氨酸酶活性，抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶，抑制黑色素的生成；此外，它還具有明顯的抗病毒作用[9]，神經(jīng)元保護(hù)作用，抗氧化，體內(nèi)外抗炎，抗心血管病，保護(hù)肝臟等作用。與具有顯著抗腫瘤活性的白藜蘆醇相比，氧化白藜蘆醇在結(jié)構(gòu)上與白藜蘆醇非常相似。那么，氧化白藜蘆醇是否也具有類似的潛在的抑制腫瘤活性，于是我們對(duì)氧化白藜蘆醇的抑制體外肝腫瘤細(xì)胞活性進(jìn)行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，人肝癌細(xì)胞株QGY-7701，為四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室保存。主要藥品:氧化白藜蘆醇(Oxyres)，純度>98%，由四川大學(xué)藥學(xué)院王峰鵬教授提供；白藜蘆醇(Res)，純度>99%，成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-14102702。主要試劑與耗材：磷酸鹽緩沖試劑PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、小牛血清、0.25% EDTA胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素：成都哈利生物公司；二甲基亞砜DMSO、結(jié)晶紫、甲醇：天津市科密歐化學(xué)試劑公司；MTT試劑：美國Amresco公司；BD Transwell小室：美國Corning公司；96孔板：耐思生物科技有限公司。主要儀器：TGL16M型高速低溫離心機(jī)，長沙湘智離心儀器有限公司；倒置顯微鏡，德國Olympus公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖及IC50的測定

生長曲線采用MTT法進(jìn)行測定。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化制成2×104個(gè)·ml-1細(xì)胞懸液，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，更換為含藥物的完全培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)定溶劑對(duì)照組，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間后，更換為無血清培養(yǎng)基，避光條件下每孔加入5 mg·ml-1MTT溶液20 μl，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO150 μl，置酶標(biāo)儀中避光振蕩5 min，570 nm測定吸光度值。吸光度(A)值的大小可反映細(xì)胞活力或細(xì)胞數(shù)量。按下列公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率。抑制率(%)=(1-A藥物組/A對(duì)照組)×100%。以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，各組吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。根據(jù)48 h各組藥物抑制率，使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度IC50值。

1.2.2 Transwell小室法測定細(xì)胞遷移能力

待細(xì)胞生長至80%融合狀態(tài)時(shí)，倒掉培養(yǎng)基，PBS潤洗3次，更換為無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)24 h。細(xì)胞用胰酶消化后用無血清培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞懸液密度，SMMC-7721細(xì)胞以每孔1.2×105個(gè)，QGY-7701以每孔1.5×105個(gè)接種于Transwell小室上室，下室中加入650 μl含有20% FCS的DMEM高糖培養(yǎng)基。藥物處理組中，將藥物用無血清培養(yǎng)基稀釋，加入小室上室，對(duì)照組加入等體積空白培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，吸棄上室培養(yǎng)基，用PBS潤濕的棉簽輕輕擦去上室中的未遷移的細(xì)胞。小室置于24孔板中，每孔加入10%甲醇500 μl，固定下室細(xì)胞5 min，轉(zhuǎn)移小室至新孔中，每孔加入0.1%結(jié)晶紫500 μl，室溫染色30 min。蒸餾水水洗至水無色，倒置于載玻片上，37℃烘干。遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)：染色后的Transwell小室放于顯微鏡下，隨機(jī)選取五個(gè)視野進(jìn)行觀察拍照和細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果：遷移至下室的細(xì)胞數(shù)量表示細(xì)胞的遷移能力。按以下公式計(jì)算遷移率：遷移率(%)=(藥物組下室細(xì)胞數(shù)目/對(duì)照組下室遷移數(shù)目)×100%。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氧化白藜蘆醇對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖的作用

2.1.1 氧化白藜蘆醇對(duì)肝癌細(xì)胞株生長曲線的作用

以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線(如圖1)。從生長曲線可見，隨著氧化白藜蘆醇的濃度增加，其細(xì)胞的吸光度越低，說明其活細(xì)胞數(shù)目越少，隨著時(shí)間的延長，其細(xì)胞的吸光度越低，活細(xì)胞數(shù)目越少。說明氧化白藜蘆醇濃度增加抑制細(xì)胞生長的作用越強(qiáng)，隨著氧化白藜蘆醇作用時(shí)間越長，其抑制細(xì)胞生長的作用越強(qiáng)。

圖1 氧化白藜蘆醇對(duì)肝癌細(xì)胞生長曲線的作用(QGY-7701細(xì)胞(上)和SMMC-7721細(xì)胞(下))

2.1.2 氧化白藜蘆醇對(duì)QGY-7701和SMMC-7721細(xì)胞細(xì)胞增殖半數(shù)抑制濃度IC50值(48 h)

從表1中可見，氧化白藜蘆醇抑制SMMC-7721細(xì)胞較QGY-7701更為敏感。

表1 氧化白藜蘆醇對(duì)QGY-7701和SMMC-7721細(xì)胞細(xì)胞增殖半數(shù)抑制濃度IC50值

2.2 氧化白藜蘆醇對(duì)人肝癌細(xì)胞遷移的作用

圖2結(jié)果顯示，24 h后對(duì)照組細(xì)胞向下室遷移明顯，各藥物處理組細(xì)胞遷移受到不同程度抑制，且計(jì)數(shù)后計(jì)算細(xì)胞遷移率，氧化白藜蘆醇組與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。表2顯示不同濃度氧化白藜蘆醇和白藜蘆醇對(duì)肝癌細(xì)胞株，QGY-7701和SMMC-7721的遷移率與對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)，氧化白藜蘆醇和白藜蘆醇在50 μM濃度作用基本相當(dāng)。

圖2 Transwell測定不同濃度氧化白藜蘆醇對(duì)QGY-7701和SMMC-7721細(xì)胞遷移(上圖QGY-7701細(xì)胞，下圖SMMC-7721細(xì)胞)

表2 不同濃度氧化白藜蘆醇對(duì)QGY-7701和SMMC-7721細(xì)胞遷移率(n=3)

注：與對(duì)照組比較*P <0.05，**P <0.01。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道[7]，白藜蘆醇對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的遷移能力具有較強(qiáng)的抑制作用，顯示出良好的體內(nèi)外抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，而氧化白藜蘆醇在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞是否具有遷移抑制作用未知。因此，我們進(jìn)一步探討了氧化白藜蘆醇對(duì)肝癌細(xì)胞QGY-7701遷移能力的影響，并與白藜蘆醇進(jìn)行對(duì)比。我們前期研究結(jié)果顯示[11]，氧化白藜蘆醇對(duì)6種不同類型腫瘤細(xì)胞株具有良好的抗增殖活性，包括人白血病細(xì)胞K562、人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肺癌細(xì)胞A549、人鼻咽癌細(xì)胞HNE-1、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480。氧化白藜蘆醇對(duì)這6株細(xì)胞體外生長的抑制作用，顯示出其良好的抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖活性。此外，我們發(fā)現(xiàn)氧化白藜蘆醇不僅能抑制小鼠S180肉瘤的生長，它還能抑制小鼠肝癌H22移植實(shí)體瘤的腫瘤生長[12]，抑瘤機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。另外我們還發(fā)現(xiàn)，氧化白藜蘆醇具有體內(nèi)抑制H22肝癌實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移的作用，氧化白藜蘆醇均能減少小鼠肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。這些數(shù)據(jù)均提示氧化白藜蘆醇可能具有抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用，對(duì)于氧化白藜蘆醇進(jìn)一步體內(nèi)外抗腫瘤作用研究，將為開發(fā)其藥用價(jià)值奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Oxyresveratrolinhibitsproliferationandmigrationofhumanhepatocellularcarcinomacell

Yang Hong-zhuan1, Wu Bing-huo2, Huang Jie1

(1.Clinical Laboratory, Chengdu Third People′s Hospital, Sichuan Chengdu 610031;2.Grade 2016 Undergraduate, West China School of Basic Medical Sciences& Forensic Medicine, Sichuan Universit, Sichuan Chengdu 610041)

Objective： To study the effects of Oxyresveratrol on the proliferation and migration of human hepatocellular carcinoma cells: QGY-7701 and SMMC-7721.MethodsProliferation and growth rate curves have been investigated using MTT; migration rates of the cells have been measured with Transwell assay.ResultsMTT tests showed that the cells in the experimental group with the different concentrations of Oxyresveratrol have been significantly inhibited compared with control group. Transwell experiments showed that migration rates of cells in different concentrations of Oxyresveratrol have been significantly decreased compared with the control group.ConclusionProliferation and migration rates of human hepatocellular carcinoma cells QGY-7701 and SMMC-7721 can be inhibited by Oxyresveratrol.

Oxyresveratrol；human hepatocellular carcinoma cells；proliferation；migration

楊紅專，男，檢驗(yàn)師，主要從事實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)工作，Email：798638162@qq.com。

2017-11-12)