中間絲聚合蛋白基因多態(tài)性與特應(yīng)性皮炎發(fā)病及臨床表型的相關(guān)性

張卉 程茹虹 李明 姚志榮

200092上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院皮膚科

·論著·

中間絲聚合蛋白基因多態(tài)性與特應(yīng)性皮炎發(fā)病及臨床表型的相關(guān)性

張卉 程茹虹 李明 姚志榮

200092上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院皮膚科

目的探討中間絲聚合蛋白（FLG）基因多態(tài)性與特應(yīng)性皮炎（AD）發(fā)病及臨床表型的相關(guān)性。方法采用問卷調(diào)查的形式收集261例AD患者伴發(fā)過敏性鼻炎、哮喘病史和疾病嚴重度評分等資料，對部分患者進行混合食物過敏原和混合吸入性過敏原篩選、血清總IgE抗體和嗜酸性粒細胞陽離子蛋白水平檢測。采用重疊PCR和DNA測序法對上述AD患者和276例健康對照FLG基因3號外顯子17個多態(tài)性位點（R444G、T454A、P478S、H519N、D836D、S1482Y、A1805V、R1891Q、1961Q、S2166S、Y2194H、H2330H、D2339N、S2366T、E2398Q、K2444E、E2652D）進行基因分型。結(jié)果二項邏輯回歸分析和卡方檢驗未發(fā)現(xiàn)17種FLG多態(tài)位點與AD發(fā)病相關(guān)（均P＞0.05）。H519N與AD伴發(fā)哮喘相關(guān)（χ2=8.680，P=0.011），AA基因型可增加AD患者發(fā)生哮喘的風(fēng)險（P=0.004，OR=1.061，95%CI1.016～1.109）。S2366T和K2444E與AD患者食物敏感相關(guān)（χ2值分別為6.520和6.121，P值分別為0.038和0.047），S2366T的GG+GC基因型（P=0.012，OR=1.396，95%CI1.054～1.849）和G等位基因（P=0.037，OR=1.350，95%CI1.008～1.807）可提高AD患者食物敏感的風(fēng)險。K2444E的AA+AG基因型（P=0.013，OR=1.393，95%CI1.049～1.850）和G等位基因（P=0.028，OR=1.380，95%CI1.025～1.857）可提高AD患者食物敏感的風(fēng)險。結(jié)論中國漢族人群FLG基因多態(tài)性可能是一些AD相關(guān)臨床表型的危險因素，H519N可能與AD伴發(fā)哮喘相關(guān)，S2366T和K2444E則可能與AD伴食物敏感相關(guān)。

皮炎，特應(yīng)性；中間絲蛋白質(zhì)類；多態(tài)性，單核苷酸；食物過敏；表型；中間絲聚合蛋白基因

特應(yīng)性皮炎（AD）的發(fā)病機制尚不明確，由中間絲聚合蛋白（filaggrin，F(xiàn)LG）基因突變導(dǎo)致的皮膚屏障功能缺陷被認為是AD發(fā)病的一個重要因素［1?2］。FLG功能缺失突變可增加AD患者對變應(yīng)原的敏感性及發(fā)生過敏性鼻炎和哮喘的風(fēng)險［3］，并可增加兒童和青少年患者的哮喘嚴重程度［4］。有研究表明，除FLG突變外，其單核苷酸多態(tài)性（SNP）也是AD發(fā)病的危險因素之一［5?8］。在前期研究中，我們已經(jīng)完成對261例中國漢族AD患者FLG全基因測序，明確FLG突變與AD發(fā)病相關(guān)，同時也是AD患者發(fā)生食物敏感的一個危險因素［9］，而關(guān)于FLG基因多態(tài)性與AD及其相關(guān)臨床表型的關(guān)系尚不明確。本研究目的是分析FLG 17個多態(tài)位點與AD及其相關(guān)臨床表型的相關(guān)性。

對象與方法

一、對象

261例散發(fā)的中國漢族AD患者和276例健康對照參與本研究。所有AD患者均于2008—2009年就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院皮膚科門診，符合Hanifin?Rajak診斷標(biāo)準［10］。本研究通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

二、方法

1.數(shù)據(jù)采集：采用問卷調(diào)查形式收集數(shù)據(jù)。AD疾病嚴重度評分采用SCORAD評分系統(tǒng)［11］。哮喘和過敏性鼻炎的診斷基于既往病史和由內(nèi)科或耳鼻咽喉科醫(yī)生做出的診斷。采用UniCAP?100自動免疫分析儀（Phadia AB，瑞典法瑪西亞公司）檢測部分AD患者血清總IgE、血清嗜酸性陽離子蛋白（ECP）和特異性IgE抗體［混合吸入性過敏原h(huán)x2（包括戶塵螨、粉塵螨、屋塵和蟑螂）和混合食物過敏原fx5E（包括雞蛋白、牛奶、鱈魚、小麥、花生和黃豆）］水平。

2.基因分型：采用血液基因組DNA提取試劑盒（北京Tiangen公司）提取受試者外周血全血基因組DNA。采用重疊PCR、基因測序?qū)?7個FLG多態(tài)位點（R444G，G/A；T454A，A/G；P478S，C/T；H519N，C/A；D836D，T/C；S1482Y，C/A；A1805V，C/T；R1891Q，G/A；H1961Q，C/A；S2166S，T/C；Y2194H，T/C；H2330H，C/T；D2339N，G/A；S2366T，G/C；E2398Q，G/C；K2444E，A/G；E2652D，A/C）進行基因分型。PCR引物和反應(yīng)條件參照文獻［12］。使用Applied Biosystems 3730 DNA分析儀（美國ABI公司）進行基因分型。

3.統(tǒng)計分析：采用SPSS21.0軟件包。計量資料以±s表示。二項邏輯回歸分析和χ2檢驗分析17個FLG多態(tài)位點基因型與AD發(fā)病以及臨床表型的相關(guān)性。單因素方差分析比較不同基因型患者組SCORAD、血清總IgE和ECP水平的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

261例AD患者中，男147例，女114例，年齡0.5～57.8（7.11±8.39）歲。234例（89.7%）早年（2歲前）發(fā)病，發(fā)病年齡0.02～36.0（1.46±4.40）歲。29例伴尋常型魚鱗病，121例（46.4%）伴哮喘，112例（42.9%）伴過敏性鼻炎。72.3%（162/224）血清總IgE升高（＞ 100 IU/ml），96.6%（170/176）血清ECP升高（＞ 8 μg/L），63.8%（120/188）fx5E試驗陽性，67.2%（125/186）hx2試驗陽性。25例（9.6%）SCORAD評分為輕度（0～24分），182例（69.7%）中度（25～50分），54例（20.7%）重度（51～103分）。

276例健康對照均不伴有尋常型魚鱗病，其中男182例，女94例，年齡0.2～ 20（13.24±3.89）歲。AD組和對照組性別（χ2=5.23，P＜0.05）和年齡（t=-10.764，P＜ 0.05，95%CI：-7.249 ～ -5.009）差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、FLG SNP與AD發(fā)病及臨床表型的相關(guān)性

單因素邏輯回歸分析顯示，17個FLG SNP中H519N（P=0.016，OR=1.955，95%CI1.133 ～3.372）和 E2398Q（P=0.009，OR=4.572，95%CI1.461～14.307）與AD發(fā)病相關(guān)。進一步多因素邏輯回歸分析顯示，二者與AD發(fā)病均無關(guān)（P＞0.05）?？ǚ綑z驗顯示，17個FLG SNP與AD發(fā)病均無顯著相關(guān)性（P＞0.05），其中P478S SNP與AD發(fā)病的關(guān)系見表1。

表1 中間絲聚合蛋白基因P478S與特應(yīng)性皮炎（AD）的相關(guān)性［例（%）］

對AD相關(guān)臨床表型與17個FLG SNP相關(guān)性進一步分析，發(fā)現(xiàn)H519N與AD伴發(fā)哮喘相關(guān)（χ2=8.680，P=0.011），其AA基因型在AD伴發(fā)哮喘患者組中比例顯著高于AD不伴發(fā)哮喘組（P=0.004），而A等位基因頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。未發(fā)現(xiàn)FLG SNP不同基因型與AD伴發(fā)過敏性鼻炎之間存在相關(guān)性（P＞0.05）。S2366T和K2444E與AD患者食物敏感相關(guān)（χ2值分別為6.520和6.121，P值分別為0.038和0.047）。S2366T位點 GG+GC基因型（P=0.012，OR=1.396，95%CI：1.054～ 1.849）、G等位基因頻率在AD伴有食物敏感組均顯著高于AD不伴有食物敏感組；K2444E位點AA+AG基因型（P=0.013，OR=1.393，95%CI：1.049 ～ 1.850）和G等位基因頻率在AD伴有與不伴有食物敏感組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3，4。未發(fā)現(xiàn)FLG SNP不同基因型與吸入物敏感間存在相關(guān)性（均P＞0.05）。

表2 中間絲聚合蛋白基因H519N與特應(yīng)性皮炎（AD）伴發(fā)哮喘的相關(guān)性［例（%）］

表3 中間絲聚合蛋白基因S2366T與特應(yīng)性皮炎伴發(fā)食物敏感的相關(guān)性［例（%）］

表4 中間絲聚合蛋白基因K2444E與特應(yīng)性皮炎伴發(fā)伴發(fā)食物敏感的相關(guān)性［例（%）］

χ2檢驗顯示，F(xiàn)LG SNP與AD早年發(fā)病無相關(guān)性（均P＞0.05）。單因素方差分析亦未發(fā)現(xiàn)FLG SNP不同基因型患者組間SCORAD評分、血清總IgE水平和ECP水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

已有多項研究報道，F(xiàn)LG SNP可能與突變一樣，是AD發(fā)病的一個危險因素。Kim等［6］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LG P478S TT+TC基因型與AD發(fā)病相關(guān)。Wang等［5］發(fā)現(xiàn)，P478S不僅是AD發(fā)病的危險因素，同時也是AD患者伴發(fā)哮喘的危險因素。本研究表明，中國漢族AD人群中FLG SNP與一些AD相關(guān)臨床表型如哮喘、食物敏感相關(guān)，同時也證實，F(xiàn)LG SNP的分布特點與FLG突變一樣存在種族差異。本研究中研究對象包括261例AD和276例健康對照者，盡管統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)兩組之間性別和年齡差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但進一步對性別進行分層分析，在男女性組內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)SNP與AD發(fā)病相關(guān)，與不分層統(tǒng)計分析結(jié)果一致，因此可視為性別差異對本研究無影響。而且，由于檢測的是基因多態(tài)性，這一數(shù)據(jù)不會隨著年齡的增長而變化，因此認為年齡不會對研究產(chǎn)生影響。

在FLG的多態(tài)性位點中，P478S是NCBI數(shù)據(jù)庫中最常見、被研究最多的一個SNP，且已被多項研究證明與AD發(fā)病相關(guān)，因此認為可將P478S作為AD高危人群的一個篩選工具。而在我們的研究中，未能得到類似的研究結(jié)果，其TT+TC基因型、T等位基因頻率在AD組和對照組間均無顯著性差異，提示FLG SNP分布在不同種族人群中存在很大差異，未來仍需對來自不同地區(qū)的大樣本AD人群進一步研究來確定中國AD人群的高危SNP。

以往有研究認為維持嬰兒期皮膚屏障功能的完整能阻止過敏性進程中其他過敏性氣道疾病的發(fā)生［13］。Hudson等［14］報道FLG功能缺失突變是AD伴發(fā)哮喘的一個危險因素，而不是非AD患者發(fā)生哮喘的危險因素，這也強調(diào)了皮膚屏障功能在發(fā)生變應(yīng)原致敏過程中的重要性。本次研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LG H519N可能是AD伴發(fā)哮喘的一個危險因素，攜帶H519N AA基因型的AD患者伴發(fā)哮喘的概率顯著高于攜帶CC+CA基因型者。Wang等［5］對中國臺灣116例兒童AD患者和212例正常對照進行分析，未發(fā)現(xiàn)H519N與AD發(fā)病以及伴發(fā)哮喘相關(guān)，提示H519N可能是中國大陸人群AD伴發(fā)哮喘患者的一個危險因素。我們的結(jié)果提示，對AD患者而言，確定有意義的FLG多態(tài)性和FLG無義或缺失突變同樣重要。通過確定有效的分子標(biāo)志來篩選AD伴發(fā)哮喘的高危人群從而實現(xiàn)早期臨床干預(yù)，對于延緩甚至阻止過敏性進程中其他氣道過敏性疾病的發(fā)生有重要意義。

我們還發(fā)現(xiàn)兩個與AD食物敏感相關(guān)的FLG SNP即S2366T和K2444E。已知FLG基因主要表達于表皮和口腔、鼻黏膜，其終產(chǎn)物FLG是形成皮膚屏障的重要蛋白。Wang等［5］的研究表明，機體暴露于各種變應(yīng)原后可能通過調(diào)控IgE水平改變易感機體發(fā)生AD的風(fēng)險。盡管本次研究未發(fā)現(xiàn)FLG多態(tài)性與IgE水平之間的相關(guān)性，未來仍需更大樣本的研究來進一步明確FLG多態(tài)性與血清總IgE水平以及sIgE水平之間的關(guān)系。

FLG SNP對終產(chǎn)物FLG的結(jié)構(gòu)或功能的影響目前尚不清楚，其中P478S的作用機制目前也僅限于推測［10］，P478S以及其他SNP在AD發(fā)病機制中的作用及其機制均有待于進一步研究。

綜上所述，我們在AD群體中確定了一些可能導(dǎo)致對AD相關(guān)臨床表型如哮喘、食物敏感等易感的FLG多態(tài)性位點，這些位點是否以及如何改變FLG的結(jié)構(gòu)或功能而發(fā)揮作用仍需進一步研究。

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Association of polymorphisms in the filaggrin gene with the occurrence and clinical phenotypes of atopic dermatitis

Zhang Hui,Cheng Ruhong,Li Ming,Yao Zhirong
Department of Dermatology,Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,China

Yao Zhirong,Email:zryaoxh@sina.com

ObjectiveTo investigate the association of polymorphisms in the filaggrin（FLG）gene with the occurrence and clinical phenotypes of atopic dermatitis（AD）.MethodsA questionnaire survey was carried out to collect data from 261 patients with AD,including the diagnosis of allergic rhinitis and asthma,and the severity of AD.Mixed food allergen screening test and mixed inhaled allergen screening test were performed in a part of patients,so was the detection of total serum IgE and eosinophil cationic protein（ECP）.Among the above AD patients and 276 healthy controls,17 polymorphic sites in exon 3 of the FLG gene,including R444G,T454A,P478S,H519N,D836D,S1482Y,A1805V,R1891Q,1961Q,S2166S,Y2194H,H2330H,D2339N,S2366T,E2398Q,K2444E and E2652D,were genotyped by overlapping PCR and DNA sequencing.ResultsBinary logistic regression analysis and chi?square test showed no correlations between the 17 polymorphic sites in the FLG gene and the occurrence of AD（allP＞ 0.05）.However,the H519N polymorphic site was associated with AD complicated by asthma（χ2=8.680,P=0.011）,and the AA genotype of H519N could increase the risk of asthma in the AD patients（P=0.004,OR=1.061,95%CI:1.016-1.109）.The S2366T and K2444E polymorphic sites were associated with food sensitization in the AD patients（χ2=6.520,6.121,P=0.038,0.047,respectively）,and the GG+CG genotype of S2366T（P=0.012,OR=1.396,95%CI:1.054-1.849）and its G allele（P=0.037,OR=1.350,95%CI:1.008-1.807）both could increase the risk of food sensitization in the AD patients.Similarly,the AA+GA genotype of K2444E（P=0.013,OR=1.393,95%CI:1.049-1.850）and its G allele（P=0.028,OR=1.380,95%CI:1.025-1.857）could increase the risk of food sensitization in the AD patients.ConclusionsThe FLG polymorphisms may be predisposing factors for some AD?related clinical phenotypes in Chinese Han population.The H519N gene may be associated with AD complicated by asthma,and the S2366T and K2444E genes may be related to food sensitization in AD patients.

Dermatitis,atopic;Intermediate filament proteins;Polymorphism,single nucleotide;Food hypersensitivity;Phenotype;Gene,filaggrin

姚志榮，Email：zryaoxh@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.11.007

2017?05?22）

尚淑賢）