乙型肝炎不同HBsAg濃度與血清人宮頸癌基因蛋白、甲胎蛋白水平的變化及其相關(guān)性

徐群芳

論 著

乙型肝炎不同HBsAg濃度與血清人宮頸癌基因蛋白、甲胎蛋白水平的變化及其相關(guān)性

徐群芳

目的 探討血清乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）濃度與人宮頸癌基因蛋白（HCCR）及甲胎蛋白（AFP）的相關(guān)性。方法 采集2013年6月至2014年9月在湖南省益陽醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院傳染科住院的400例HBsAg陽性患者為觀察組，根據(jù)HBsAg濃度分為A、B、C、D組〔A組87例（HBsAg 0.5～150 μg/L）、B 組 98 例（HBsAg 151～300 μg/L）、C 組 113 例（HBsAg 301～450 μg/L）、D 組 102 例（HBsAg ＞450 μg/L）〕，另外根據(jù)疾病類型分為肝炎組183例、肝硬化組116例、肝細胞癌（HCC）組101例；以100例健康體檢者作為健康對照組。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測HCCR，化學發(fā)光法檢測HBsAg和AFP，并對HBsAg濃度與HCCR、AFP進行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果 不同HBsAg濃度組血清HCCR、AFP均明顯高于健康對照組，且HBsAg濃度越高，HCCR、AFP水平越高〔HCCR（g/L）：9.28±2.24、13.31±3.00、16.83±4.26、24.50±8.04 比 6.23±2.30，AFP（μg/L）：6.36±1.63、7.56±4.20、15.36±8.77、37.44±25.36比2.50±0.92，均P＜0.05〕，且A、B、C、D組HCCR與AFP均呈正相關(guān)（r值為0.73、0.51、0.63、0.79，均P＜0.05）。以HCCR＞15 g/L、AFP＞9 μg/L為陽性，不同HBsAg濃度A、B、C、D組HCCR、AFP陽性率隨HBsAg濃度的增加均呈升高趨勢〔HCCR：2.30%（2例）、16.33%（16例）、57.52%（65例）、75.49%（77例）；AFP陽性率為0%（0例）、10.24%（10例）、51.33%（58例）、65.69%（67例）〕，HCC組HCCR、AFP陽性率明顯高于肝炎組和肝硬化組〔HCCR：89.11%（90例）比21.86%（40例）、25.86%（30例）；AFP：71.29%（58例）比20.77%（38例）、21.55%（25例）；均P＜0.01〕；不同分組方法組內(nèi)比較，HCCR陽性率均明顯高于AFP陽性率（均P＜0.01）。結(jié)論 HCCR濃度的高低在一定程度上可反映肝細胞的實質(zhì)性炎性病變及癌變程度，聯(lián)合檢測HBsAg高濃度HBV感染者的HCCR和AFP對觀察肝臟損害的演變過程有重要的臨床價值。

乙型肝炎病毒表面抗原； 人宮頸癌基因蛋白； 甲胎蛋白

乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）為乙型肝炎病毒（HBV）感染的最主要病原學標志物和直接證據(jù)之一，是HBV的一種包膜蛋白抗原，合成后能穩(wěn)定地附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，進而包裹在HBV核殼上形成HBV 病毒顆粒，或轉(zhuǎn)移到細胞膜上［1］。HBV能引起急慢性肝炎，雖然有許多感染者的病毒最終處于非復制狀態(tài)，但是由于對感染的持續(xù)免疫應答，大多數(shù)人仍進展為肝纖維化，有大約40%的人進展為肝硬化、肝衰竭甚至肝細胞癌（HCC），HBV持續(xù)感染是HCC發(fā)病機制中的重要啟動因子［2］。作為HCC的實驗室診斷指標，血清甲胎蛋白（AFP）因其敏感性和特異性均較高而得到普遍認可，但仍有30%左右的患者AFP呈陰性［3］。近年來研究表明，人宮頸癌基因蛋白（HCCR）在原發(fā)性HCC患者血清中的活性升高，而且顯著高于急慢性肝炎、肝硬化、脂肪肝和其他良性肝占位性病變，提示它可能與HCC的發(fā)生有更密切的關(guān)系，HCCR可作為候選HCC標志物［4-5］。本研究旨在探討不同HBsAg濃度HBV患者中血清HCCR、AFP水平變化，并分析其相關(guān)性，以便更好地掌握HBV感染肝損傷后炎癥的變化程度。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例資料 選擇2013年6月至2014年9月在我院傳染科住院的HBsAg≥0.5 μg/L患者400例作為觀察組，原發(fā)病為肝炎、肝硬化或HCC；其中男性224例，女性176例；平均年齡（45±18）歲。所有研究對象均排除了腦、肺、腎、胰等器官疾病及女性宮頸癌疾病。

1.1.2 研究分組

1.1.2.1 按HBsAg濃度分組 根據(jù)HBsAg濃度分為 A、B、C、D 組，A 組 87 例（HBsAg 0.5～150 μg/L）、B組98例（HBsAg 151～300 μg/L）、C組113例（HBsAg 301～450 μg/L）、D 組 102 例（HBsAg＞450 μg/L）。

1.1.2.2 按疾病類型分組 肝炎組183例，其中男性100例，女性83例；平均年齡（40±22）歲。肝硬化組116例，其中男性68例，女性48例；平均年齡（46±21）歲。HCC組101例，其中男性56例，女性45例；平均年齡（50±17）歲。所有患者均經(jīng)影像學、肝臟穿刺、病理檢查確診。

1.1.2.3 健康對照組 另外選擇肝功能正常及肝炎病毒標志物均為陰性的本院健康體檢者100例，其中男性56例，女44例；平均年齡（40±20）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 所有研究對象均取清晨空腹靜脈血5 mL，靜置30 min，3 000轉(zhuǎn)/min（離心半徑＝10 cm），離心 5 min，取血清 -40 ℃保存。

1.2.2 HbsAg和AFP檢測 采用化學發(fā)光法定量檢測血清HbsAg和AFP水平，試劑盒由上海卓康公司提供，檢測過程嚴格按試劑盒說明書進行測定。以HCCR＞15 g/L為陽性［6］、AFP＞9 μg/L為陽性［7］。

1.2.3 HCCR檢測 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測HCCR： ① 通過棋盤滴定法確定單克隆抗體（單抗）的最佳包被濃度、多克隆抗體（多抗）的最佳稀釋度（1：400）以及酶標抗體的最佳稀釋倍數(shù)（1：8 000）。② 包被：用包被緩沖液將鼠抗人HCCR單抗稀釋到5 mg/L，以100 μL/孔包被酶標板，4 ℃濕盒內(nèi)過夜，用洗滌液洗滌5次，每次3 min，拍干。③ 封閉：加入封閉液，每孔200 μL，37 ℃保溫保濕2 h，用洗滌液洗滌5次，每次3 min，拍干。④ 加入血清標本：每孔加血清100 μL（每個標本做3個平行孔），留取2孔加陰性、陽性對照各100 μL，并設(shè)一空白對照孔，加貼封片，37 ℃保溫保濕1 h。⑤ 孵育結(jié)束后，將微孔反應板上的封片揭掉，用洗滌液洗滌5次，每次3 min，最后一次吸干后拍干。⑥ 加一抗：每孔加一定濃度的抗小鼠HCCR多抗100 μL，37 ℃保溫保濕1 h，用洗滌液洗滌5次，每次3 min，最后一次吸干后拍干。⑦ 加酶標抗體：每孔加羊抗小鼠辣根過氧化物酶（HRP）-IgG抗體100 μL，37 ℃保溫保濕 1 h，用洗滌液洗滌 5 次，每次3 min，最后一次吸干后拍干。⑧ 顯色反應：加入底物緩沖液四甲基聯(lián)苯胺（TMB）100 μL/孔，37 ℃避光反應15 min。⑨ 終止反應：加終止液50 μL/孔，終止反應，靜置5 min。⑩ 比色：酶標儀測450 nm波長下吸光度（A）值。通過定值標準品建立標準曲線，再依據(jù)標準曲線計算出HCCR濃度值。

抗小鼠HCCR多抗和鼠抗人HCCR單抗由軍事醫(yī)學科學院微生物研究所贈，羊抗小鼠HRP-IgG抗體購自北京博奧森生物技術(shù)公司，TMB底物及顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，美國Bio-Tek公司ELX800型酶標儀。

1.2.4 相關(guān)性分析：對HBsAg濃度和HCCR、AFP進行Pearson相關(guān)性分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件分析處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 建立HCCR標準曲線 以5個HCCR標準品濃度（2.34、8.92、16.77、32.46、67.83 g/L）為橫坐標，對應的A值為縱坐標，建立標準曲線。見圖1。

圖1 HCCR標準曲線

2.2 健康對照組和不同HBsAg濃度組HCCR、AFP的比較及其相關(guān)性分析 方差分析顯示，不同HBsAg濃度組血清HCCR、AFP水平均明顯高于健康對照組，且HBsAg濃度越高，HCCR與AFP水平越高（均P＜0.05）。Pearson相關(guān)分析顯示，A、B、C、D 組 HCCR 與 AFP均呈正相關(guān)（均 P＜0.05）。見表 1，圖 2。

表1 不同HBsAg濃度組HCCR與AFP的比較及其相關(guān)性分析（x±s）

2.3 不同HBsAg濃度分組的HCCR、AFP陽性率比較 不同HBsAg濃度組HCCR陽性率和AFP陽性率隨HBsAg濃度的上升呈升高趨勢（χ2為142.40、130.76，均 P＜0.01）。見表 2。

表2 不同HBsAg濃度組HCCR、AFP陽性率比較

2.4 不同疾病類型分組的HCCR、AFP陽性率比較

肝炎組和肝硬化組的HCCR、AFP之間的陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2為2.46、3.02，均P＞0.05）。但HCC組的HCCR陽性率明顯高于AFP陽性率（χ2＝24.68，P＜0.01），說明 HCCR 對 HCC的敏感性高于AFP。見表3。

表3 HBV相關(guān)性肝臟疾病HCCR、AFP陽性率比較

圖2 不同HBsAg濃度組HCCR與AFP的相關(guān)性分析

3 討論

目前HBV的臨床診斷主要依據(jù)HBsAg，對HBV的血清標志物進行檢測是進行乙型肝炎診斷、分析以及治療的基礎(chǔ)，其檢測結(jié)果能夠確定HBV感染者的患病程度和傳染性［8］。在早期檢測中，若患者血清中存在HBsAg，則可確定其患有乙型肝炎［9］。非急性情況下，多數(shù)HBV感染者不會出現(xiàn)臨床癥狀，HBsAg攜帶者的HBV-DNA為低水平或陰性，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）為正常水平，伴有程度不高或無肝組織壞死性的炎癥，血清中能夠檢測到HBsAg。對HCC病例之中感染HBV的病例數(shù)進行統(tǒng)計和分析，發(fā)現(xiàn)HCC患者有高達94%的幾率感染HBV，HCC組中有89%的患者攜帶陽性HBsAg，通過HBsAg轉(zhuǎn)基因鼠的實驗可知，HBsAg基因的表達能夠使肝細胞增生，若肝細胞增生或增殖速率過高，則極易轉(zhuǎn)變?yōu)镠CC，這也從側(cè)面表明了HBsAg攜帶者轉(zhuǎn)變?yōu)镠CC的可能性極高［10-11］。本實驗對400例研究對象的HBsAg濃度進行了檢測，對檢測結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，不同HBsAg濃度組與健康對照組HCCR、AFP水平變化之間有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；提示HCCR與AFP可能參與HBV的感染過程，肝細胞被HBV感染之后受到損傷繼而出現(xiàn)再生，此時的肝細胞能夠產(chǎn)生HCCR與AFP，因此血清中這二者的含量也大量增加［12］。本研究證明，HBsAg濃度與HCCR與AFP水平成正比，A、B、C、D 4組HCCR與AFP均呈正相關(guān)（均P＜0.05），說明HCCR與AFP參與了HBV感染過程，因此可以認為，HCCR與AFP也能夠在一定程度上體現(xiàn)肝細胞的再生程度和質(zhì)量，并且能夠明確肝損害的具體程度。因此可以認為，HCCR與AFP可以用來判斷肝細胞是否損傷，在一定程度上反映患者的病情變化，通過對HCCR與AFP的水平進行檢測和分析，能夠及時了解患者HBV感染之后的肝損傷程度，并且結(jié)果正確率較高。

中國相對于其他國家的HBV感染病例較多，有學者發(fā)現(xiàn)，HBV感染和原發(fā)性HCC有著直接聯(lián)系，并且HBV是HCC出現(xiàn)的主要原因［13］。在HCC早期時，腫瘤直徑≤5 cm，此時并不存在明顯病癥，而一旦到達晚期，預后效果不好，對人類健康的危害較大，所以進行早期診斷和及時治療是非常重要的，能夠有效改善預后效果［14-15］。HCC在發(fā)展過程中會表達AFP，能夠在癥狀出現(xiàn)前6～12個月的早期診斷中起到重要作用，因此可以通過AFP的檢測結(jié)果來判斷患者是否患有HCC，但是這種診斷方式容易受到很多因素的影響。其中患者癌細胞分化能力就是影響因素之一，分化能力差則AFP陽性檢

出率高，反之檢出率低［16］。據(jù)臨床診斷發(fā)現(xiàn)，70%的HCC患者檢測出的AFP為陽性，這表明這種診斷方式有一定的局限性［17］。在不同HBsAg濃度組HCCR和AFP陽性率變化分析中，HCCR和AFP陽性率隨HBsAg濃度的增大而增大（均P＜0.01），提示HBsAg濃度與HCCR、AFP的陽性率有著直接聯(lián)系，也從側(cè)面證明對HCCR、AFP水平進行檢測，其檢測結(jié)果有利于明確患者肝細胞病變或癌變程度。除此之外，我們對肝炎、肝硬化兩組患者的HCCR、AFP水平進行檢測，并對二者陽性率進行比較分析，其差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。但HCC組的HCCR陽性率較AFP的高（P＜0.01），說明HCCR對HCC更加敏感。肝病患者AFP明顯升高，其機制如下： ① 感染HBV的HCC患者，其肝細胞因受到損傷而出現(xiàn)再生情況，再生的肝細胞能夠分泌AFP，因此患者血清中的AFP會出現(xiàn)升高現(xiàn)象［18］； ② 非腫瘤性肝病患者體內(nèi)的AFP也會出現(xiàn)升高現(xiàn)象，但機制并沒有完全明確，推測可能原因為肝細胞病變壞死使AFP分泌出現(xiàn)異常［19］。因此可以通過對AFP水平的檢測結(jié)果來判斷患者是否患有HCC，并且也是判斷治療效果以及預后的重要依據(jù)，據(jù)臨床診斷發(fā)現(xiàn)，只有70%的HCC患者檢測出的AFP為陽性，這表明這種診斷方式有一定的局限性［17］。本研究還發(fā)現(xiàn)，HCCR與AFP二者有直接聯(lián)系，并且HCCR水平與HBsAg濃度成正比，因此，HCCR也可以運用到HCC的診斷中，若將HCCR與AFP聯(lián)合診斷，則診斷結(jié)果更加準確，可以提高HCC的檢出率。所以，聯(lián)合檢測HCCR和AFP對早期診斷HCC有著重要作用，在一定程度上能夠推動HBV感染者肝臟損害的研究進程。

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Correlations of different concentrations of HBsAg in HBV patients with the levels of HCCR and AFP

Xu Qunfang Yiyang Medical College, Yiyang 413000, Hunan, China
Corresponding author: Xu Qunfang, Email: 1298467265@qq.com

Objective To investigate the relevance of the concentration of hepatitis B virus surface antigen(HBsAg) to human cervical cancer gene protein (HCCR) and alpha fetoprotein (AFP). Methods From June 2013 to September 2014, 400 patients with positive HBsAg admitted to infection department of the Affiliated Hospital of Yiyang Medical College in Hunan Province as the observation group, according to the concentration of HBsAg was divided into A, B, C, D groups, A group of 87 cases (0.5～150 g/L), 98 cases in B group (151～300 g/L), C group of 113 cases (301～450 g/L), 102 cases in D group (＞ 450 g/L). In addition, according to the type of disease was divided into hepatitis group 183 cases, 116 patients with cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC) group of 101 cases.100 cases of healthy people were taken as control group. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect HCCR, chemiluminescence method was used to detect HBsAg and AFP, and Pearson correlation analysis was performed. Results Serum HCCR and AFP in different concentrations of HBsAg groups were significantly higher than the control group, and the higher the concentration of HBsAg, the higher the level of HCCR and AFP [HCCR (g/L):9.28±2.24, 13.31±3.00, 16.83±4.26, 24.50±8.04 vs. 6.23±2.30; AFP (μg/L): 6.36±1.63, 7.56±4.20,15.36±8.77, 37.44±25.36 vs. 2.50±0.92, all P ＜ 0.05], and A, B, C, D groups HCCR and AFP were positively correlated (r = 0.73, 0.51, 0.63, 0.79, all P ＜ 0.05). With HCCR ＞ 15 g/L, AFP ＞ 9 g/L positive, with the increase of HBsAg concentration in different HBsAg concentration groups, HCCR, AFP positive rate were increased [the positive rate of HCCR was 2.30% (2 cases), 16.33% (16 cases), 57.52% (65 cases), 75.49% (77 cases); the positive rate of AFP was 0% (0 case), 10.24% (10 cases), 51.33% (58 cases), 65.69% (67 cases)], HCCR and AFP positive rates in HCC group were significantly higher than the positive rate of hepatitis group and cirrhosis group [the positive rate of HCCR was 89.11% (90 cases) vs. 21.86% (40 cases), 25.86% (30 cases); the positive rate of AFP was 71.29%(58 cases) vs. 20.77% (38 cases), 21.55% (25 cases), all P ＜ 0.01]; comparison of methods of different groups within the group, the positive rate of HCCR was significantly higher than the positive rate of AFP (all P ＜ 0.01).Conclusions The concentration of HCCR can reflect the parenchymal inflammatory lesions and canceration degree of hepatocytes to a certain extent. Meanwhile, detecting HCCR and AFP in HBsAg infected patients with high concentration of HBV has important clinical value in the observation of the evolution of liver damage.

Hepatitis B virus surface antigen; Human cervical cancer gene protein; Alpha fetoprotein

湖南省教育廳科研項目（12C1239）

413000 湖南益陽，湖南省益陽醫(yī)學高等?？茖W校

徐群芳，Email：1298467265@qq.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.04.001

2017-10-20）

楊程伍 張耘菲）

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